CommonMethodsofKaryotypeAnalysisinPlant.docx

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CommonMethodsofKaryotypeAnalysisinPlant

CommonMethodsofKaryotypeAnalysisinPlant

LIUYong、FENGHaisheng、CHENZhiguo1、CHANGXiyun、LIURuijuan、DOUQuan

Abstract:

Plantkaryotypeanalysis,involvingthenumber,shape,lengthandbandingofchromosome,siteofcentromereandsoon,isanimportantmethodforclassificationandgeneticstudyofplant.Thebasicmethodforplantkaryotypeanalysisincludingsampling,pretreatment,stationary,dissociation,dye,squashandresultanalysisisintroducedandevaluatedsystematically.

Keywords:

plant;karyotypeanalysis;chromosom

一、染色体核型分析是什么？

1、染色体：

（1）染色体的形态、结构特征在细胞周期中，以细胞分裂中期最为典型，称为中期染色体。

（2）每一个中期染色体均由两条染色单体构成，每一条染色单体由一个DNA分子螺旋而成。

两条染色单体互称为姐妹染色单体，而且通过一个着丝粒彼此相连，而着丝粒将染色体分为两臂-----长臂和短臂。

（3）形态：

中央着丝粒染色体，着丝粒位于染色体1/2处；

亚中着丝粒染色体，着丝粒位于染色体5/8处；

近端着丝粒染色体，着丝粒位于染色体7/8处；

2、组型：

是将一个细胞内的染色体按照一定的顺序排列起来所构成的图像。

通常以模式图的方式表示，他是通过对许多细胞的染色体的测量取平均值绘制而成的，代表了一个物种染色体组型的特征。

3、核型分析：

是指对细胞染色体的数目、形态、长度、带型、和着丝粒位置等内容的分析和研究。

二、为什么要进行染色体核型分析？

1、染色体组型分析-----染色体水平上的表型：

可以了解染色体形态特征及外部结构，使人类更加形象的认识染色体；

2、可确定物种的特征，确定种属亲缘关系;

地球上50多万种植物，在人们研究植物的早期，对植物的分类往往是根据植物的形态学、解剖学等资料来进行的，但由于每个人对植物形态认识的差异，经常会将同一植物划分为不同的类别，特别是在研究形态相同的植物时。

种属划分的混乱，给学术交流和对整个植物界的研究带来不便。

然而一种生物的染色体核型是相当固定的，因此可用它作为植物学分类及遗传研究的一个重要手段。

3、分析生物物种的变异和进化过程：

染色体的变异：

有缺失、重复、倒位、易位，而在易位的变异过程中，两个非同源的近端染色体有可能经过易位后只留下了一个近中染色体或者中央染色体。

由此染色体更加稳定，或者也可以根据染色体的着丝粒位置来判断一个物种的进化地位高低。

4、识别单条染色体、基因定位

5、临床运用：

由于一个物种的染色体核型是固定不变的。

有次可以以健康个体的染色体组型为标准，从而在临床医学（判断遗传病、染色体疾病、产前诊断等）的运用。

三、怎样进行染色体的组型分析（实验方法）？

1、主要步骤：

取材---材料的预处理---材料的固定---材料的解离---材料的染色---制片---镜检---染色体数目的确定---染色体的形态分析。

2、取材：

（1）在取材过程中需要充分了解不同植物组织结构和生长发育规律的基础上，有针对性的取样才能获得适合的材料。

（2）各类样品给有优缺点

优点

缺点

根尖

不受时间、季节的限制，即培养种子萌发生根即可使用

茎尖

必需剥除幼叶

花粉母细胞

不易判断花粉的生长状况，难以把握时机

只有一个染色体组，分析时不必进行同源染色体配对。

3、材料的预处理：

（1）中期染色体：

中期染色体的形态特征最为明显，容易观察，所以使材料染色体处于中期染色体为最佳。

（2）化学处理方法：

1）化学方法可分为离体处理和非离体处理，离体处理是将从植物体上取下的材料浸泡于化学药剂中,对其进行处理。

因为材料脱离母体,所以化学药剂很容易从破损处渗入,只需较短的时间即可,至于处理的时间,因不同植物或组织而异。

非离体处理是指将植物的根等组织直接浸泡于化学药剂中,因为材料没有破损,所以化学药剂进入植物组织的速度较慢,需处理较长的时间。

2）各类药品的处理方法：

药品

方法

秋水仙素

常用浓度为0.01%~0.2%。

秋水仙素有很强的毒性,如果秋水仙素用量过大或处理时间过长,会引起染色体收缩过度或产生多倍体,而且秋水仙素的价格较贵。

但由于用秋水仙素进行预处理的效果较好,因此,在染色体核型分析时仍较为常用。

饱和的对二氯苯水溶液

对材料进行预处理，对二氯苯也有毒性,其效果和秋水仙素相似,但价格较为便宜,使用也较为广泛。

低浓度的羟基喹啉溶液

对材料进行预处理。

浓度范围在0.002~0.004mol/L,该溶液适合处理具有较大染色体的植物。

经过该溶液处理后,染色体的缢痕区比较清晰。

溴荼的饱和水溶液

对材料进行预处理。

该溶液适合对禾本科和水生植物的材料进行预处理,而且是非离体处理的效果较好。

（3）物理处理方法：

物理方法是用低温对植物材料进行预处理，处理温度一般在0~8摄氏度，最常用的就是用冰水混合物对材料进行预处理。

该方法比较经济、简单和安全,因而也比较常用。

（4）化学方法与物理方法比较

方法

优点

缺点

化学方法

能很好控制得到较多或者定量的中期染色体

价格昂贵，步骤复杂，且药品具有毒性

物理方法

操作方便，简单易行

不能很好的得到大量的中期染色体

4、材料的固定：

（1）固定目的：

用渗透力强的固定液将材料迅速杀死,使蛋白质沉淀,并尽量使其保持原有状态。

（2）固定试剂：

通常用卡诺液（无水酒精：

冰醋酸=3：

1）对材料固定24h左右。

也有人用甲醇冰醋酸溶液（甲醇：

冰醋酸=3：

1）来固定材料。

5、材料的解离

（1）在对材料固定后,应马上进行解离,因为经过保存过的材料其效果没有固定后立即解离的效果好。

固定好的材料如不能及时解离,可将其保存在70%的酒精中。

如果不需要保存很长时间,也可将其直接保存在固定液中。

（2）解离目的：

植物的细胞有细胞壁,胞间层含有果胶,这将导致压出的片子达不到理想的效果。

经过解离,细胞之间的果胶层被除去,细胞壁得到软化,使压片能够顺利进行。

（3）解离方法：

对材料的解离方法有酶解法和酸解法。

1）酶解法是用低浓度的果胶酶（1%~2%）和纤维素酶（1%~5%）的混合液对材料进行解离[5,7,47~50],解离时间一般在室温下2~5h;

2）酸解法一般是将材料放入预热60摄氏度的1mol/LHCl中解离,解离时间一般为几分钟到十几分钟或更长。

以上2种方法,酸解法比较经济,一般实验多采用此法。

但是,无论是酶解还是酸解,都要把握好解离的时间,时间过长或过短都会产生不良的影响。

另外,有的研究者在对材料进行解离前进行前低渗,解离后又进行后低渗,其目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入,使细胞膨胀,进而使细胞中本来已经分散的染色体更加分散。

低渗液一般使用蒸馏水或0.075mol/LKCl溶液。

其中0.075mol/LKCl溶液对染色体的结构破坏较小,经它处理后,染色体较为明显清晰

6、材料的染色

（1）对材料的染色是指用颜料对材料进行处理,仅使染色体染色,而染色质不染色或染色很淡,以便观察和分析。

（2）各类染色方法：

试剂

方法

醋酸洋红溶液

用不锈钢刀片切去根冠和伸长区,留下分生区,然后加一滴醋酸洋红,待根尖被染至暗红色时,进行常规压片。

如果想使染色的效果更好,可以在压片后置于酒精灯上加热数秒,但不能使染液沸腾。

如染色过深,可在盖玻片的一侧滴加适量45%的醋酸,另一侧用滤纸吸取染液,以达到褪色的目的

改良石炭酸品红溶液

改良石炭酸品红克服了石炭酸中含有较多甲醛而使原生质硬化的缺点,并且该染液比较稳定,能存放很长时间,因此应用也很广泛。

该染液染色的方法与醋酸洋红染色的方法相同,但不需加热

铁矾苏木精溶液

先用4%的铁矾溶液进行媒染,用蒸馏水将铁矾洗净,再用0.5%的苏木精染色,蒸馏水漂洗,然后用45%的醋酸分色、软化,常规压片。

此方法能使染色体的轮廓保持清晰,即使用它处理染色体数目多而不易分散的材料,也能得到较好的效果

Schiff试剂

先将解离好的材料用蒸馏水漂洗几次,把材料放于染液中1~5h或黑暗处过夜,然后将材料在漂洗液或直接将材料在蒸馏水中冲洗几次,每次数分钟,最后用45%的醋酸压片。

（3）根据染色体带型染色

带型

方法

C带染色

先将压好的片子冷冻脱片,室温下防尘干燥。

用酸或碱（通常用5%的Ba（OH）2处理,使染色体变性,再用盐溶液高温（60~65摄氏度）下处理,使之复性,最后Giemsa染色,使染色体的不同部位呈现宽窄不同的条带。

通常一种植物的C带是固定的,而且重复性很高,因此,在实际操作中C带染色法最常用

G带染色

先将压好的片子冷冻脱片,室温下防尘干燥。

用2SSC溶液处理,Giemsa染色,使染色体上出现宽窄、深浅不同的条带。

但G带较为均一,缺乏特异性,因此没有C带常用

N带染色

先将压好的片子冷冻脱片,室温下防尘干燥。

用1mol/LNaH2PO4高温（87~97摄氏度）处理,水洗,Giemsa染色,使染色体核仁组成区染色。

但用该方法处理一些禾本科植物的染色体时,不仅核仁组成区着色,而且染色体的其它部位也染色成带。

因此该法可用于植物染色体核仁组成区的数目和位置等方面的研究,同时也可用于一些禾本科植物染色体的带型研究

7、染色体数目的确定：

至少应该统计30个染色体分散良好的细胞（染色体大且数目少的材料,可以少统计一些细胞,而染色体小且数目多的材料,可多统计一些细胞）,而且85%以上的细胞具有相同染色体数时,才能确定该植物染色体数目。

8、染色体的形态分析：

在进行染色体形态分析时,一般取5个以上染色体分散良好的中期细胞进行显微摄影,将底片冲洗放大,用精确的尺子测量照片上染色体长、短臂的相对长度,根据放大的倍数求出染色体绝对长度;也可以用测微尺测量染色体的绝对长度（随体一般不记长度）,然后求出每条染色体绝对长度、相对长度和臂比的平均值。

如果要对染色体的带型进行分析,还要观察染色体条带的数量、相对位置、宽度等特征。

根据染色体的长度、臂比、着丝粒的位置、随体的有无和位置以及染色体的带型等进行同源染色体的配对。

然后根据染色体的长度给染色体编号,长度最长的染色体编为1号染色体,依次排列,最短的染色体编为末号,等长的染色体把短臂长的染色体排在前面。

接着将配好对的同源染色体按编号由小号到大号排列在与照片底色一样的纸上,并且粘好,排列时把染色体的着丝粒放在一条直线上（如果染色体数目较多,可把染色体排成两行或两行以上）,染色体纵向与直线垂直,短臂放在上边。

四、染色体核型分析的发展前景

1、科学发展领域：

鉴定各类植物的属种分类：

2、其他：

随着人类基因组计划的完成以及我国对水稻、鸡、非典病毒等生物基因组测序的完成,人类已经进入了后基因组时代。

但植物染色体核型分析不会因此而过时,它将同植物的外部形态鉴定、基因组序列测定等一起成为植物分类和遗传研究的重要手段。

参考文献：

1、《植物染色体核型分析常用方法概述》刘永安

2、生命科学学院遗传学课件