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肺癌综述
EGFR基因扩增检测试剂盒
疾病
名称
检测探针
标记颜色
探针定位
探针名称
非小细胞肺癌(NSCLC)
GLPEGFR/CSP7
红/绿
EGFR:
7p11.1
CSP7:
7p11.1-q11.1
EGFR基因扩增检测试剂盒(荧光原位杂交法)
临床意义
在世界范围内,无论男性还是女性,肺癌均已成为癌症死亡的主要原因。
肺癌高死亡率的主要原因有二个:
一是肺癌缺乏有效的早期诊断手段,70%以上的病人在确诊时已属晚期[3~4];二是晚期肺癌(尤其是非小细胞肺癌,NSCLC)对化疗的敏感性差,现有的各种化疗方案对NSCLC的总体有效率仅为30%左右。
Gefitinib(Iressa)是一种苯胺喹唑啉化合物,是强有力的选择性酪氨酸激酶抑制剂,可阻断EGFR诱导的体外肿瘤细胞的生长[11]。
Ⅰ、Ⅱ期临床试验显示,gefitinib对标准治疗失败的部分NSCLC有良好疗效。
值得注意的是,患者对gefitinib的治疗反应差别很大,因此,研究肺癌患者不同治疗反应的机制以及筛选能从治疗中获益的患者有重要的临床意义。
表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorrecepter,EGFR)又称HER–1,EGFR在多种上皮性肿瘤高表达,其过表达与肿瘤细胞的增殖、活动性、粘连性、侵袭性、凋亡抑制和血管生成相关,最终导致细胞的转化、增殖,抵抗细胞凋亡、促进细胞生存,与肿瘤的发生、发展、临床分期、生存期、预后和对治疗反应相关[5]。
马萨诸塞总医院癌症中心(MassachusettsGeneralHospitalCancerCenter,MGHCC)的Lynch等以及达纳法伯癌症研究所(DanaFarberCancerInstitute,DFCI)的Paez等研究发现有变异EGFR基因的患者表现出对gefitinib更好的治疗反应[22]。
但是,Danafarber癌症研究所的BruceJohnson(首先报道敏化EGFR突变的研究者之一)表示,在临床试验中,从抑制剂治疗中获益的患者超过了仅有EGFR突变的人数。
这些新的结果提示,测定EGFR基因拷贝数,在将来选择治疗时可能起着一定的作用。
另有研究显示EGFR基因突变和扩增两种改变同时存在的患者使用酪氨酸激酶抑制剂的疗效显著,说明对EGFR基因拷贝数和基因突变进行联合检测可能更有助于药物敏感性和预后的判断[24]。
因此,在临床上无论是检测EGFR基因突变还是检测基因拷贝数增加,对于患者用药的选择及预后判断都有着重要的意义。
使用FISH检测出EGFR基因扩增的病人:
✧EGFR基因扩增的患者,应用gefitinib的有效率为35%,疾病控制率高达70%[24]。
✧检测EGFR基因是否扩增可以有效指导吉非替尼(易瑞沙)的使用。
EGFR基因扩增检测试剂盒(荧光原位杂交法)的探针组成为:
红色信号代表检测的目的基因EGFR、绿色信号代表对照探针CSP7。
荧光原位杂交信号在正常细胞内显示为2红2绿(2R2G),在异常细胞显示红色信号数量大于2,绿色信号数量不少于2。
EGFR基因检测的阳性判断方法如下:
随机观察细胞(至少观察100个细胞),统计红信号个数和绿信号个数。
当红绿信号比值小于2,而有不少于40%的细胞中红色信号个数大于或等于4个时,表示EGFR基因高多体性扩增,为阳性结果;当出现以下三种情况之一时,表示EGFR基因扩增,为阳性结果(①红绿信号比值大于或等于2、②不少于10%的细胞中有大于或等于15个红色信号、③包含成簇的红色信号)。
一、背景介绍:
1.流行病学介绍:
恶性肿瘤是严重危害人类健康的一种常见疾病。
世界卫生组织(WHO)公布的最新统计资料显示[1],2000年全球恶性肿瘤的新发病人数接近1,000万,而其死亡人数为630余万。
在世界范围内,无论男性还是女性,肺癌均已成为癌症死亡的主要原因。
2005年估计中国肺癌的新发病例大约有500,000例(男性约330,000例,女性约170,000例),2007年美国肺癌的新发病例估计有213,380例(男性114,760例,女性98,620例),死亡160,390例(男性89,510例,女性70,880例)[2]。
2.肺癌的临床分型:
按解剖学部位分类
中央型肺癌:
发生在段支气管以上至主支气管的癌称为中央型。
周围型肺癌:
发生在段支气管以下的癌称为周围型。
肺癌的组织病理学分类现分为两大类:
非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC):
鳞状上皮细胞癌(鳞癌):
包括乳头状型、透明细胞型、小细胞型和基地细胞样型。
腺癌:
包括腺泡状腺癌、乳头状腺癌、细支气管-肺泡细胞癌、实体癌粘液形成。
大细胞癌:
包括大细胞神经内分泌癌、复合型大细胞神经内分泌癌、基地细胞样癌、淋巴上皮瘤样癌、透明细胞癌、伴横纹肌样表型的大细胞癌。
其他:
包括燕麦细胞型、中间细胞型、复合燕麦细胞型。
小细胞肺癌(smallcelllungcancer,SCLC):
包括燕麦细胞型、中间细胞型、复合燕麦细胞型。
3.肺癌的诊断:
临床常用的肺癌诊断方法包括:
胸部X线检查;电子计算X线机体层显象(CT);磁共振显像(MRI);放射性核素扫描检查;痰脱落细胞检查;纤维支气管镜检查;开胸肺活检;癌相关抗原,如癌胚抗原,神经肽类和神经元类等。
但癌相关抗原(肿瘤标记物)检查对于发现肺癌均缺乏特异性,对判断转移或复发均无肯定的应用价值。
一般来讲,依靠详细的病史询问、体格检查和有关的辅助检查,进行综合判断,约80%-90%的患者可以得到确诊。
4.肺癌的治疗:
根据肺癌的生物学特点及预备后,大多数临床肿瘤学家将肺癌分为非小细胞肺癌(包括鳞癌、腺癌、大细胞癌)和小细胞肺癌两大类。
非小细胞肺癌与小细胞肺癌的治疗原则不同。
非小细胞肺癌治疗原则:
I-IIIa期以手术为主的综合治疗,IIIb期放疗为主的综合治疗,IV期化疗为主。
小细胞肺癌的治疗原则:
以化疗为主,辅助以手术和(和)放疗。
肺癌高死亡率的主要原因有二个:
一是肺癌缺乏有效的早期诊断手段,70%以上的病人在确诊时已属晚期[3~4];二是晚期肺癌(尤其是非小细胞肺癌,NSCLC)对化疗的敏感性差,现有的各种化疗方案对NSCLC的总体有效率仅为30%左右。
因此,晚期NSCLC病人一旦化疗失效预后极差,中位生存期仅为3个月,一年存活率不足10%。
只有15%的患者在确诊肺癌后能生存5年或以上。
近年来,以表皮生长因子受体(EpidermalGrowthFactorReceptor,EGFR)为治疗靶标的分子靶向治疗(MolecularTargetedTherapy)受到了国内外肿瘤界的普遍关注,其中EGFR酪氨酸激酶抑制剂Iressa(Genfitinib)已被美国食品药品管理局(FDA)批准用于治疗晚期NSCLC,并且Iressa还分别获得包括日本、澳大利亚等27个国家的批准,我国也于2005年2月批准了Iressa进入临床。
Gefitinib(Iressa)是一种苯胺喹唑啉化合物,是强有力的选择性酪氨酸激酶抑制剂,可阻断EGF诱导的体外肿瘤细胞的生长[11]。
资料显示,Iressa治疗能使此类病人的症状缓解,病灶缩小,生活质量提高,生存期延长。
Ⅰ、Ⅱ期临床试验显示,gefitinib对标准治疗失败的部分NSCLC有良好疗效。
5.EGFR的定位、结构与功能:
表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorrecepter,EGFR)又称HER-1,此外,还包括HER-2、HER-3、HER-4等,EGFR基因位于人类7号染色体的短臂,由118kb组成,包括28个外显子。
EGFR在多种上皮性肿瘤高表达,其过表达与肿瘤细胞的增殖、活动性、粘连性、侵袭性、凋亡抑制和血管生成相关,并导致其下游信号途径的异常激活,最终导致细胞的转化、增殖,抵抗细胞凋亡、促进细胞生存,与肿瘤的发生、发展、临床分期、生存期、预后和对治疗反应相关[5]。
肺正常组织中,EGFR低表达或不表达,而在非小细胞肺癌(NSCLC)中EGFR常表现为活性增高,文献报道的表达率为23%~89%,主要表现形式有过表达、EGFR基因扩增以及EGFR基因突变,这些异常与病人的高分期、生存期缩短、淋巴结转移、化疗抗拒相关[6]。
6.EGFR与Gefitinib(Iressa):
近年来,随着分子生物学技术的提高和对肿瘤发病机制从细胞、分子水平的进一步认识,产生了一些针对分子靶点的抗肿瘤药物,这些药物针对性强,效果显著,因此称为分子靶向药物(molecularlytargeteddrug,MTD),其中包括具有靶向性的表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)阻断剂。
Gefitinib(Iressa)是一种苯胺喹唑啉化合物,是强有力的选择性酪氨酸激酶抑制剂,可阻断EGFR诱导的体外肿瘤细胞的生长[11]。
Ⅰ、Ⅱ期临床试验显示,gefitinib对标准治疗失败的部分NSCLC有良好疗效。
值得注意的是,患者对gefitinib的治疗反应差别很大,日本患者明显优于欧美患者(27.5%vs10.4%),除了种族的差异,女性、不吸烟的腺癌患者相对有更好的疗效[12~14]。
因此,研究肺癌患者不同治疗反应的机制以及如何筛选能从治疗中获益的患者有重要的临床意义。
7、EGFR基因异常与gefitinib疗效的相关性:
7.1EGFR基因变异
EGFR基因位于人类7号染色体的短臂,由118kb组成,包括28个外显子。
迄今为止发现的EGFR基因突变90%以上位于外显子19-21[27~30]。
马萨诸塞总医院癌症中心(MassachusettsGeneralHospitalCancerCenter,MGHCC)的Lynch等以及达纳法伯癌症研究所(DanaFarberCancerInstitute,DFCI)的Paez等用PCR分别对gefitinib有效、无效和未经gefitinib治疗的3组病人进行EGFR基因外显子序列的检测发现,EGFR基因的变异与NSCLC患者对gefitinib的有效率有明显相关性。
变异基因主要发现于腺癌,几乎均为杂合型变异(heterozygousmutation),都定位于EGFR酪氨酸激酶的ATP结合位点的编码区(第18~21位外显子),表现为一个或一段碱基的缺失、插入,碱基替换引起的错义突变等。
这些突变可引起EGFR酪氨酸激酶的活性增强[22,23]。
未经gefitinib治疗的病人中,有少部分(2/25)发生了突变,同时证明该突变也并非是此药的使用引起的。
为了证实该区域的改变确实增加了EGFR对ATP竞争抑制物gefitinib的敏感性,Lynch等把delL747-P753insS、L858R变异基因及野生型EGFR分别转染到cos-7细胞中,发现各细胞群中的EGFR表达水平相当,可见这些变异并没有影响到EGFR蛋白的稳定性及其表达水平。
在缺乏EGF的培养基中,野生型及变异EGFR均没有发生自身磷酸化,加入EGF后,变异EGFR的活性程度即自身磷酸化程度可达到野生型的2~3倍,而且变异EGFR的活性可持续3小时,野生型EGFR活性15分钟后就逐渐减弱。
细胞群被不同浓度的gefitinib预处理后,野生型及变异型EGFR对gefitinib敏感性有明显差异,野生型EGFR半数细胞抑制药物浓度(IC50)为011μmolPL,2μmolPL时可完全抑制其活性,而变异型EGFR的IC50为01015μmolPL,完全抑制浓度仅为012μmolPL。
可见,这种变异的基因被转染到细胞后,提高了细胞对EGF的反应性,也明显增加了对gefitinib的敏感性。
Lynch等认为这种现象可能是由于EGFR变异使EGFR酪氨酸激酶ATP结合位点的某些关键基团发生重构,增强了与ATP或其竞争性抑制剂gefitinib的相互作用。
因此,有变异EGFR基因的患者表现出对gefitinib更好的治疗反应[22]。
在DFCI的研究中,关于EGFR基因变异的情况不但结果酷似,而且还证实EGFR的变异和患者的病情特征有明显的相关性。
NSCLC中,腺癌变异发生率(15/70,21%)较其他病理类型(1/49,2%)高,女性(9/45,20%)比男性(7/74,9%)高,日本患者(15/58,26%)较美国患者(1/61,1.6%)高,发生率最高的是日本女性腺癌患者(8/14,57%)。
这些结果与不同种族、病理类型患者对gefitinib不同的治疗有效率相符[23]。
针对台湾患者的一项分析,进一步证实了gefitinib治疗有效的患者与EGFR酪氨酸激酶结构域基因变异的相关性,并发现一些新的变异类型,如L833V、E709A、S768I等,同时说明了中国NSCLC患者EGFR基因变异水平(39/101,3.16%),其中腺癌患者为55%(38/69)。
不同的是并没有发现女性EGFR基因变异率明显高于男性(55.5%vs54.5%)[25]。
这些研究足以证明,EGFR酪氨酸激酶结构域基因变异与gefitinib治疗有效率(responsetogefitinib)明显相关。
但没有研究证明基因变异与病情稳定率(stabledisease)或生存率(survival)有相关性。
UniversityofColoradoCanerCenter(UCCC)的研究发现,15例存在EGFR基因变异的患者应用gefitinib治疗后,仍有一部分(40%)病情继续进展,没有表现出药物的任何治疗效果,相反,74例没有EGFR基因变异的患者应用gefitinib治疗后,有32%病人病情得到控制[24]。
EGFR基因变异能否作为NSCLC应用gefitinib治疗的筛选因子以及是否所有EGFR基因变异均有临床意义还有待进一步研究。
7.2EGFR基因拷贝数增加/扩增:
UniversityofColoradoCancerCenter(UCCC)的学者应用应用荧光原位杂交法(fluorescentinsituhybridization,FISH)的方法检测了102例应用gefitinib单药治疗(250mg/d)的NSCLC患者EGFR基因的拷贝数,发现其与gefitinib治疗的反应率、病程进展时间、生存率均明显相关[24]。
大约1/3的患者FISH检测为阳性,在阳性组患者中,应用gefitinib的有效率为35%,疾病控制率高达70%[24]。
研究者们对应用gefitinib治疗(500mgPd)的一组支气管肺泡细胞癌患者进行了类似的研究,进一步证实了应用FISH检测的EGFR基因的拷贝数与gefitinib的疗效的相关性。
甚至还发现,FISH方法检测EGFR基因阳性的患者,如果同时HER-2基因拷贝数升高,对gefitinib的疗效有更强的预示作用[26]。
Hirsch等进行研究的目的在于找出能够预测药物敏感性的最佳标志物。
该研究发现,EGFR基因拷贝数和吉非替尼治疗患者的生存期延长有关。
对于靶向治疗,选择合适的患者非常重要,他们的资料提供了一个预测因子可作为选择标准的非常强有力假设。
如前所述,已有不少研究显示,EGFR突变的存在可以高度预测对吉非替尼和埃罗替尼的治疗反应,但这还不够。
Danafarber癌症研究所的BruceJohnson(首先报道敏化EGFR突变的研究者之一)表示,在临床试验中,经治疗后,从酪氨酸酶抑制剂(gefitinib)治疗中获益的患者总数超过了仅有EGFR突变的人数。
这些新的结果提示,测定EGFR基因拷贝数,在将来选择治疗时可能起着一定的作用。
EGFR扩增也能预测治疗敏感性,这为预测酪氨酸激酶抑制剂(gefitinib)的治疗敏感性提供了又一标志物。
麻省总医院的DanielHaber认为,EGFR扩增和突变可能都是药物敏感性的标志物,他们互相联系,相对较小规模的临床试验难以分清他们各自作用。
Haber报道,随着吉非替尼及埃罗替尼大规模临床试验分子分析的完成,关于所有这些标志物的回顾性资料将陆续出现。
8.总结:
研究表明,大多数非小细胞肺癌的发生发展依赖于活化的EGFR基因,这正是酪氨酸激酶抑制剂作用的分子基础。
基因扩增和基因突变都能引起EGFR酪氨酸激酶活化,激发其下游一系列信号传导途径,促进肿瘤发生发展,提示基因扩增和突变可能均与酪氨酸激酶抑制剂的敏感性相关[22-27],以往大量临床药物试验证实,EGFR基因突变患者使用酪氨酸激酶抑制剂比无突变患者具有显著的敏感性,表现为肿瘤体积的缩小或消失,但突变与用药后生存期长短关系不大,因此EGFR突变被认为是药物反应敏感性的筛选标志。
也有多数临床III期试验表明,EGFR高拷贝数患者使用酪氨酸激酶抑制剂后生存显著高于EGFR低拷贝数患者,因此,EGFR拷贝数被认为可能适合作为用药后生存期判断的指标[31,32]。
另有研究显示EGFR基因突变和扩增两种改变同时存在的患者使用酪氨酸激酶抑制剂的疗效显著,说明对EGFR基因拷贝数和基因突变进行联合检测可能更有助于药物敏感性和预后的判断[24]。
综上所述,在临床上无论是检测EGFR基因突变还是检测基因拷贝数增加,对于患者用药的选择及预后判断都有着重要的意义。
二、EGFR基因扩增检测试剂盒探针介绍及结果判读方法:
探针介绍:
EGFR基因扩增检测试剂盒(荧光原位杂交法)的探针组成为,红色信号代表检测的目的基因EGFR、绿色信号代表对照探针CSP7。
结果判读:
荧光原位杂交信号在正常细胞内显示为2红2绿(2R2G),在异常细胞显示红色信号数量大于2,绿色信号数量不少于2。
正常结果:
荧光原位杂交信号在正常细胞内显示为2红2绿(2R2G)。
EGFR基因检测的阳性判断方法如下:
随机观察细胞(至少观察100个细胞),统计红信号个数和绿信号个数。
1.当红绿信号比值小于2,而有不少于40%的细胞中红色信号个数大于或等于4个时,表示EGFR基因高多体性扩增,为阳性结果;
2.当出现以下三种情况之一时,表示EGFR基因扩增,为阳性结果:
①红绿信号比值大于或等于2、
②不少于10%的细胞中有大于或等于15个红色信号、
③包含成簇的红色信号
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