NBM微生态制剂的研制及其应用研究.docx

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NBM微生态制剂的研制及其应用研究

畜禽ＮＢＭ微生态制剂

的研制及其应用研究

（ＮＢＭ技术源研究）

贵州黔南创先科技有限责任公司

2011年10月

目录

前言…………………………………………………………………………………………4

摘要…………………………………………………………………………………………5

第一章国内外微生态制剂研究进展……………………………………………………9

第一节益生菌在畜禽养殖业中的应用研究………………………………………11

第二节益生元在畜禽养殖业的中应用研究………………………………………16

第三节卵黄免疫球蛋白在畜禽养殖业中应用研究……………………………18

第四节抗菌肽在畜禽养殖业中的应用研究………………………………………21

第五节微生态制剂的应用效果……………………………………………………24

第六节动物微生态制剂应注意的事项……………………………………………27

第七节畜禽微生态制剂的研究方向………………………………………………30

第二章NBM微生态制剂研究综合报告………………………………………………31

第一节项目来源……………………………………………………………………31

第二节主要研究内容………………………………………………………………31

第三节技术路线……………………………………………………………………32

第四节主要研究结果………………………………………………………………33

第五节讨论…………………………………………………………………………42

第六节项目主要创新………………………………………………………………45

第三章研究分报告……………………………………………………………………47

第一节微生态制剂菌种选育研究…………………………………………………47

第二节饲用嗜酸乳酸杆菌LS-03生物特性的研究………………………………52

第三节微生态活菌制剂发酵条件研究……………………………………………57

第四节微生态菌剂生产关键技术研究……………………………………………69

第五节微生态制剂的包埋技术……………………………………………………72

第六节NBM微生态制剂饲养断奶仔猪的效果……………………………………78

第七节NBM微生态制剂饲养生长猪的效果………………………………………84

附件：

1.科技查新报告

2.专利初审合格通知书

3.检验报告

4.企业标准

5.工艺流程图

6.生产许可证

7.环保证明

8.应用效果证明报告

前　言

抗生素在畜禽饲养业的应用，为世界畜牧业的发展做出了巨大的贡献，然而也带来了极大的隐患—引起内源性感染和二重感染，使畜禽机体免疫力下降，细胞产生耐药性，并可以转移到人体，威胁人类身体健康。

因此，自1988年以来，世界发达国家现已开始全面禁止抗生素在饲料中的应用。

国内外许多学者正在关注并寻找能够克服抗生素弊端的代替物，而益生菌、低聚糖、免疫球蛋白、抗菌肽等则是目前较理想的具有发展前途的产品。

近年来，国内外对单一的活菌制剂、低聚糖、免疫球蛋白、抗菌肽等产品在畜禽饲料上的应用研究，均已有较多的报道。

但是，将活菌制剂—低聚糖—免疫球蛋白有机结合的研究，在一起，形成一种具有特定功能的新型微生态制剂，则国内外尚未见报道。

本研究的目的是，采用现代生物技术，按特殊的生理生化加工工艺，将活菌剂、低聚糖、免疫球蛋白、抗菌肽有机地结合起来而研制成的一种新型NBM微生态制剂，充分发挥免疫球蛋白的特异性免疫功能与益生菌、低聚糖、抗菌肽的非特异性免疫功能及相应的生理促进功能，进而达到促进畜禽生长、预防和治疗感染性疾病的目的。

摘要

近年来，随着抗生素在饲料添加剂中的禁用，寻求有效抗生素替代品的研究工作，受到人们极大的关注。

而微生态制剂、低聚糖、卵黄免疫球蛋白、抗菌肽、中草药制剂等则是有希望的抗生素代替品。

本研究针对人们关注的这一问题进行了研究，取得了如下结果：

1、筛选出高产乳酸的乳酸菌菌株。

从126份猪肠、鸡肠、牛瘤胃、猪粪中，近2000株菌株中，分离筛选出一株高产乳酸的乳酸片球菌（LS-9），乳酸产量高达26.09g/L。

2、采用诱变育种技术对选育出的乳酸片球菌（LS-9）进行了遗传改良，并最终选项育出一株生产性能更好的乳酸菌（LS-9-1），该菌能忍耐高浓度（10%）葡萄糖，对葡萄糖的转化充高达86%-90%，产乳酸的能力达到了108g/L。

3、利用重组DNA的基因工程技术，将棒杆菌（AS1.563）赖氨酸合成途径中的关键酶基因（dapA）导入了乳酸片球菌（LS-9）中，使乳酸片球菌（LS-9）既高乳酸又能合成赖氨酸。

4、探索出活菌制剂混和发酵的关键技术参数。

在生产应用中采取分步发酵法：

第一步发酵时间为24-27h，温度32℃，通气量为60升/min，pH值为6，搅拌速度为120r/min。

适合酵母菌和芽孢杆菌快速生长。

第二步发酵时间24-27h，温度37℃，通气量为20升/min，pH值为6，搅拌速度为120r/min。

适合乳酸菌快速生长。

5、本研究比较了葡萄糖、蔗糖、大豆粉、土豆粉、玉米粉、麦麸等六种物质作为活菌制剂发酵的碳源，结果表明，效果最好的是葡萄糖。

乳酸菌工业发酵最好的碳源是土豆粉，酵母菌工业发酵最好的碳源是大豆粉，芽孢杆菌工业发酵碳源上述两者均可，没有显著差异，浓度为6%。

6、本研究比较了蛋白胨、植物油、大豆粉、玉米粉、土豆粉、麦麸、尿素等七种物质作为活菌制剂发酵的氮源，结果表明，效果最好的蛋白胨，浓度为0.5%，其次是植物油，浓度为0.3%，尿素也是很好的无机氮源，但在培养基的高温灭菌过程中，可能产生缩二脲等有害物质，影响菌体的生长。

因此，本研究中排除使用无机氮源尿素。

7、本研究比较了低聚木糖、低聚果糖、低聚甘露等三种寡糖对活菌制剂的作用，结果表明，效果最好的是低聚果糖，但达到最佳效果需要的浓度较大（0.25%），达到最佳作用效果，用量需要最少的是低聚木糖（0.075%）。

8、本研究比较了土霉素、金霉素、杆菌肽锌三种常用的抗生素（浓度为1-10单位/g）对活菌制剂的影响。

结果表明，三种抗生素对活菌制剂中的任何一种菌种都有抑制作用。

9、活菌制剂的菌种及其数量

本研究中，NBM制剂的菌种：

乳酸菌：

乳酸片球菌（LS-03LS-09LS-15）：

3.6×108个/ml

芽孢杆菌：

枯草芽孢杆菌（AS1.884）：

1.3×108个/ml

酵母菌：

产朊假丝酵母菌（AS2.120）：

2.1×108个/ml

10、活菌制剂营养配方：

主体碳源6%+葡萄糖2%+蛋白胨0.5%+植物油0.3%，另加K2HPO40.2%、Caco31%、MgSO40.06%、MnSO40.025%。

猪用活菌制剂，主体菌种乳酸菌，主体碳源土豆粉。

反刍动物和鸡用活菌剂，主菌种为酵母菌，主碳源为大豆粉。

11、NBM制剂的配方：

本研究中，NBM微生态制剂的主要配方为：

活菌制剂98.4%+低聚木糖0.5%+卵黄免疫球蛋白（IgY）0.1%+蝇蛆抗菌肽蛋白粉1%

12、微胶囊包埋壁材的选择。

研究结果表明，海藻酸钠0.5%+变性淀粉35%+阿拉伯胶15%+麦芽糊精25%+玉米糖浆20%作为壁材效果最佳，包埋率达97%以上。

此外，2%的氯化钙有利于胶囊的形成和菌种包埋率的保持。

13、NBM制剂微胶囊包埋产品热稳定性研究。

通过70℃高温处理10min，包埋后的产品活菌成活率高达88.7%，而未包埋的产品活菌成活率只有41.5%。

14、NBM制剂酸稳定性研究。

本研究通过模拟胃液（含胃酸10%、胃蛋白酶1%，PH值4.0-5.0）试验，结果表明，经过8h后，包埋产品活菌率还有32%，而未包埋的产品经过7h后就完全丧失了活性。

15、NBM制剂贮藏稳定性研究。

经6个月的贮藏试验显示，包埋产品活性高达92.9%，而未包埋产品活菌存活率只有51.1%。

包埋后的产品在更长的贮藏期后的稳定性，结果仍在观测之中。

16、活菌制剂代谢产物抑菌能力研究。

研究结果表明，活菌制剂抑制病原菌起主要作用的是其代谢产物，且代谢产物的浓度越高，抑菌能力越强。

代谢产物中起到抑菌作用的不是乳酸，而是乳酸以外的其他代谢产物，如乳酸菌素等，具体是哪种物质仍待进一步研究。

17、NBM制剂抑菌能力的比较。

本研究比较了NBM制剂、单项活菌剂、单项低聚糖、单项免疫球蛋白、单项蝇蛆抗菌蛋白粉的抑菌能力，结果表明，NBM制剂的抑菌能力明显高于单项物质的抑菌能力，但作用效果不是几项物质的数值累加。

18、通过本项研究，谨慎地提出如下理论：

微生态制剂中，死菌具有与活菌相同的作用效果相同。

微生态制剂产品中，强调菌种的代谢产物含量比强调菌体的活性更为重要。

19、NBM制剂在断奶仔猪中的应用效果。

试验结果表明，断奶仔猪日增重比对照提高65.83%，日采食量提高45.7%，饲料转化率提高12.02%，腹泻率下降近3倍。

20、NBM制剂在生长猪中的应用效果。

试验结果表明，生长猪日增重比对照提高23.5%，日采食量提高10.7%，饲料转化率提高11.8%，产投比为8.6：

1，经济效益提高13%。

第一章

国内外微生态制剂研究进展

早在上世纪初（1907年），著名细菌学家梅切尼科夫就提出饮用酸奶可以延年益寿的假说，而微生态制剂用于防治畜禽疾病却是近20年的事。

最早研究和应用畜禽微生态制剂的历史可以追溯到1947年，蒙哈德（Mollgaard）首先发现使用乳酸杆菌饲喂仔猪，可以有效地增加仔猪的体重，并改善仔猪的身体健康状况。

然而20世纪50-70年代，正是抗生素研究、生产和使用的黄金时期，导致了微生态制剂的研究和开发处于低潮，一段时期以来没有受到足够的重视，直到80年代中期才有了根本性的变转。

日本是世界上研制开发和利用微生态制剂较早的国家之一，其产品主要是双歧杆菌活菌制剂。

在70年代双歧杆菌活菌制剂用于临床治疗腹泻。

至80年代中期已有26种产品，90年代已达到饱和状况。

据报道，至今在日本微生态制剂年产值达200亿日元以上的企业已有10余家。

其他许多国家，例如德国、美国、法国、意大利、荷兰、英国、俄罗斯和韩国等都有不同类型的微生态制剂产品，有的产品近年来进入了我国市场。

如英国的PIC公司的Protexin，泰国研制生产的Togocerin，以0.04%的比例添加到饲料中，可以提高妊娠母猪和泌乳期母猪的生产性能，可以使仔猪的腹泻率和死亡率明显下降。

加拿大生产的ProsursPaste（主要含芽孢杆菌、粪链球菌、双歧杆菌等）可使育肥猪日增重提高9.5%。

目前国外多使用复合菌剂。

如芬兰的Broilact，由32种菌组成。

日本的EM原液由5科10属80余种微生物复合而成。

产品开发进行得最成功的是美国和日本，到2004年止，美国年产各种微生态制剂4.5万吨，产值达20亿美元。

其次是日本，年产各类微生态制剂1.5万吨，产值达3000亿日元。

我国虽然在微生态制剂的研究和开发方面比欧美起步晚，但近10年来发展相当迅速。

生产微生态制剂的厂家由2000年的十几家发展到2004年的1600家。

产业化程度高、规模较大的有四川何明清用芽孢杆菌研制的8501、8701、8801、8901、901系列，分别用于仔猪、育肥猪、鱼、禽、肉鸡。

大连医学院研制剂的“促菌生”，南京农大研的“促康生”，松江制药厂生产的DM423菌粉，黑龙江兽医研究所生产的“痢康粉剂”，北京营养研究所生产的“增菌素”，杭州商学院生产的乳酸菌复合剂等等，在此不一一列举了。

市场上应用较多、效果较好的大多是以芽孢杆菌和乳酸杆菌为主的复合益生菌剂。

到2004年止，据不完全统计，我国的各种微生态制剂的产量已达到15万吨。

但由于国家没有一个具体统一的行业标准，产品的质量参差不齐。

目前国际上已将微生态制剂分成三个类型。

即益生菌（Pr