PCR荧光检测试剂盒生产质控规程.docx
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PCR荧光检测试剂盒生产质控规程.docx
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PCR荧光检测试剂盒生产质控规程
PCR荧光检测试剂盒生产质量控制规程
一.微量加样器的使用规定
1.微量加样器校正:
:
使用微量加样器吸10μl10次是否为100μl。
2.加样前吸头润湿:
当吸头排空时,仍会有一些残留的液体以薄膜的形式吸附在吸头里面,所以,在加样时先吸打液体数次,充分润湿吸头管腔,以保证加样的一致性。
3.加样时吸头应靠试管壁:
加样时吸头的液体顺着管壁流出,防止液滴的形成由于其表面张力的作用而阻止样本的释放。
4.吸头是否与加样器上吸头套筒密封:
样器上吸头与套筒密封完好。
5.加样时注意第一停点和第二停点:
吸液是应注意大拇指按下按钮至第一停点,缓慢慢慢吸入液体。
停留1s,然后将吸头提离液面。
用吸纸抹去吸嘴外面可能黏附的液滴。
放液时经过第一停点,停1-2s后,继续按压到第二停点,排出残余液体。
6.PCR反应原液由于有甘油在冷的状态较黏稠,易于1次吸取数人份,慢一些。
7.边加边看,直观估计,防止跳管。
8.低温冷藏批量DNA提取液、PCR反应液A和B取出时是否充分混匀后,分装使用,PCR反应液A和B是否避光低温冷藏和使用。
9.配PCR反应液应先加缓冲液再加PCR反应液充分混匀,必要时倒置混匀,再离心,或用灭菌吸头上下吸几次。
10.PCR反应液(包括样品)应充分混匀:
保证PCR反应曲线呈S形,全阴性样品呈近似水平曲线。
二.PCR试验操作规程
程序
操作
检查
操作
1
混匀方法
每一次提醒注意
倒置混匀、移液器吹打、震荡,50000rpm离心1分钟。
2
取血清样本
1)因水分蒸发变浓
2)冻状、混浊
按
(1)法混匀,再取25µl加水5µl混匀。
温水浴37℃溶解按
(1)法混匀,或12000rpm离心5分钟,取清液。
3
取质控品
冻状、混浊
温水浴37℃溶解按
(1)法混匀或12000rpm离心5分钟,取清液。
4
血清样本稀释
混匀血清
阴性血清40µl加阳性血清10µl,按
(1)法混匀。
5倍稀释
5
质控品稀释
混匀质控品
血清稀释液40µl加质控品10µl,按
(1)法混匀5倍稀释。
6
血清样本DNA提取
DNA提取液完好
血清样本按
(1)法混匀,取30µl加DNA提取液60µl,按
(1)法混匀,98℃8分钟变性,0℃冷却2-3分钟,12000rpm,离心10分钟,吸取上清液。
7
质控品DNA变性
分装,有效,呈清液状态,未反复加热、冻融
质控品按
(1)法混匀,取30µl5000rpm离心1分钟,98℃5分钟变性,5000rpm,离心1分钟,吸取上清液。
8
PCR反应液
混匀状态
取25µl反应液加5µl提取DNA,按
(1)法混匀,5000rpm离心1分钟,5000rpm,离心1分钟,吸取上清液。
9
PCR反应
室温10-30℃
PCR反应槽四角不放管。
10
设阴性对照
阴性混匀血清
CT〉38
11
阳性参考品
各浓度呈梯度
以PCRA反应液制作标准曲线,呈直线。
12
阴性质控品B
各浓度呈梯度
以PCRA和B反应液制作标准曲线,呈直线。
**血清稀释液:
全阴性血清再加2倍HBVDNA提取液混匀,5000rpm,离心1分钟,混匀血清98℃5分钟变性,12000rpm,离心10分钟,吸取上清液。
三.超净工作台的使用、维护保养与清洁标准操作规程
1.目的
建立一个超净工作台的使用、维护保养与清洁标准操作程序,使操作过程标准化。
2.职责
质量部QC负责本文件的起草,质量部及QC检验人员负责本标准的实施。
3.范围
本标准适用于超净工作台的使用、维护和保养与清洁。
4.内容
超净工作台的主要组成部分:
高效过滤器、中效过滤器、通风机、电气控制及排气管道部分。
安放点的选择:
4.2.1应安放于卫生条件较好的地方,便于清洁,门窗能够密封以避免外界的污染空气对室内的影响。
4.2.2安放位置应远离有震动及噪音大的地方。
4.2.3严禁安放在产生大尘粒及气流大的地方,以保证操作区空气的正常流动。
使用前的检查:
4.3.1接通超净工作台的电源。
4.3.2旋开风机开关,使风机开始正常运转,这时应检查高效过滤器出风面是否有风送出。
4.3.3检查照明及紫外设备能否正常运行,如不能正常运行则通知工程部检修。
4.3.4工作前必须对工作台周围环境及空气进行超净处理,认真进行清洁工作,并采用紫外线灭菌法进行灭菌处理。
4.3.5净化工作区内严禁存放不必要的物品,以保持洁净气流流动不受干扰。
使用:
4.4.1使用工作台时,先经过清洁液浸泡的纱布擦拭台面,然后用消毒剂擦拭消毒。
4.4.2接通电源,提前50分钟打开紫外灯照射消毒,处理净化工作区内工作台表面积累的微生物,30分钟后,关闭紫外灯,开启送风机。
4.4.3工作台面上,不要存放不必要的物品,以保持工作区内的洁净气流不受干扰。
4.4.4操作结束后,清理工作台面,收集各废弃物,关闭风机及照明开关,用清洁剂及消毒剂擦拭消毒。
4.4.5最后开启工作台紫外灯,照射消毒30分钟后,关闭紫外灯,切断电源。
4.4.6每二月用风速计测量一次工作区平均风速,如发现不符合技术标准,应调节调压器手柄,改变风机输入电压,使工作台处于最佳状况。
4.4.7每月进行一次维护检查,并填写维护记录。
清洁
4.5.1每次使用完毕,立即清洁仪器,悬挂标识,并填写仪器使用记录。
4.5.2取样结束后,先用毛刷刷去洁净工作区的杂物和浮尘。
4.5.3用细软布擦拭工作台表面污迹、污垢目测无清洁剂残留,用清洁布擦干。
4.5.4要经常用纱布沾上酒精将紫外线杀菌灯表面擦干净,保持表面清洁,否则会影响杀菌能力.
4.5.5效果评价:
设备内外表面应该光亮整洁,没有污迹。
四.检验方法操作规范
1.混匀:
反应液混匀,按人份量取出,加样,再混匀后5000rpm离心数秒(按原说明进行)。
2.准确:
反应液及样本混匀后,每一步加样准确(按原说明进行)。
3.新鲜血清样本:
血清样本混匀后离心(5000rpm离心数秒),取30μl,加2倍量DNA提取液60μl混匀100℃8--9分钟变性,放置冰箱0℃冷却2-3分钟,12000rpm离心5分钟,取出全部上清液置另1管混匀,再取5μl加样。
4.长期放置冰箱冷藏血清样本:
取25μl,加无菌水5μl加2倍量DNA提取液60μl混匀98℃8--9分钟变性,放置冰箱0℃冷却2-3分钟,12000rpm离心5分钟,取出全部上清液置另1管混匀,再取5μl加样.
5.DNA提取液处理并冷藏保存血清样本:
DNA提取液处理:
血清样本混匀,取200μl,加DNA提取液400μl混匀98℃5分钟变性,放置冰箱0℃冷却2-3分钟,12000rpm离心5分钟,取出全部上清液置另1管混匀,冷藏保存,按100μl/管分装冷藏保存.
保存血清样本使用:
取1管分装冷藏保存血清样本,融化后混匀,5000rpm离心数秒,再取30-40μl98℃5-6分钟变性,放置冰箱0℃冷却2-3分钟,5000rpm离心数秒,再取5μl加样.
6.质粒DNA有关质控品(P和N):
用全阴性血清与质粒DNA按9:
1混匀,5000rpm,离心1分钟,再加2倍HBVDNA提取液混匀,5000rpm,离心1分钟,混匀血清98℃5分钟变性,12000rpm,离心10分钟,吸取上清液,取出全部上清液置另1管混匀,冷藏保存,按100μl/管分装冷藏保存.
有关质控品使用:
取1管分装冷藏保存质控品,融化后混匀,5000rpm离心数秒,再取30-40μl98℃5-6分钟变性,放置冰箱0℃冷却2-3分钟,5000rpm离心数秒,再取5μl加样.
五.防止荧光定量PCR产物污染的质控规程
1.目的
规范荧光定量PCR实验和生产的操作过程,确保操作过程中无PCR产物污染。
2.适用范围
本规范适用于荧光定量PCR实验和生产的操作过程。
该规程参照中华人民共和国《艾滋病核酸检测技术规范》。
3.职责划分
操作人员按照此标准操作规范进行荧光定量PCR实验和生产,质检部经理负责监督。
4.质量保证体系
实验室和生产工作区质控体系
4.1.1实验室和生产工作区原则上应分为四个独立工作区,分别是试剂准备区(GMP车间超净工作室)、样品处理区(质检室1)、扩增区(质检室2)和扩增产物分析区(质检室3)。
前两区为扩增前区,后两区为扩增后区。
各区的功能是:
(1)样品处理区:
样品登记、分装。
各种组织匀浆或细胞裂解,进行核酸提取、保存和加样。
(2)试剂准备区:
PCR扩增试剂的配制、分装和保存。
(3)扩增区:
普通PCR扩增及荧光定量PCR扩增。
(4)扩增产物分析区:
PCR扩增产物的电泳、杂交、成像、测定、结果分析、报告。
4.1.2用有效的方法对操作区域和共用器具在实验前后进行清洁及消毒
推荐的程序是:
a.实验前将次氯酸钠溶液或70%乙醇涂布于操作台或器具表面,两分钟后用纸巾擦除。
b.移入盛放污染材料的器皿、所需的试剂、耗材和样品,进行试验。
c.一个实验区域在同一时间段只进行一种实验。
d.实验结束后移出个人专用材料至个人专用区域保管;封好污染材料盛放
器皿并移出至污物袋;移出共用器具至专门区域保管;将次氯酸钠溶液或70%乙醇涂布于操作台或器具表面,两分钟后用纸巾擦除;打开紫外灯照射至少15分钟。
4.1.3实验工作区内必须穿好实验工作服,并戴口罩,进行实验操作时根
据要求戴不同规格的手套。
4.1.4PCR产物分析使用相对封闭的系统或共用分析软件时,如特定的凝胶成像分析检测系统及分析软件或荧光定量PCR仪及分析软件,每位实验人员都要准确的命名自己的设置程序及分析结果,使用完毕后需收拾好所用的仪器并保存好自己的实验分析结果。
4.1.5各区域的仪器、设备、器具和试剂应为该区专用,不得交叉使用。
荧光定量PCR扩增实验过程控制体系:
4.2.1样品的采集和处理
4.2.1.1用于普通PCR或荧光定量PCR检测的样品有细胞、全血、血浆、各种组织和其他分泌物,有时还包括生物制品。
4.2.1.2采集样品应避免微生物和核酸污染(所用器皿必须无菌或属于一次性用品,RNA类样品所用器皿必须没有RNA酶污染)。
4.2.1.3处理样品应在样品处理区由专人进行。
处理和保存用于抽提DNA或RNA的样品应避免DNA或RNA酶造成的降解,通常要求在采样后1小时内处理并低温保存。
4.2.1.4处理后的样品应分装、标记(需用防水的笔填写),并做好实验记
录,冻存于-20℃以下,DNA或RNA类样品应冻存于-60℃或保存在液氮中。
4.2.2核酸(RNA/DNA)提取
4.2.2.1应在规定的区域内由专人按相应程序进行。
4.2.2.2应保证无细菌及核酸污染,实验材料和容器应经过消毒处理并一次性使用。
4.2.2.3提取RNA时应避免RNA酶污染,抽提RNA样品实验使用的移液器及离心管等用品必须用DEPC处理,去除RNA酶。
4.2.2.4配制RNA逆转录或DNA反应试剂,所有操作超过10分钟时应将反应管置于冰盒内,防止各种酶及样品DNA或RNA降解。
4.2.3.3进行逆转录反应时应避免RNA酶污染,实验使用的移液器及离心管等用品必须用DEPC处理,去除RNA酶。
4.2.3.4扩增仪应预热,时间不少于20分钟。
4.2.3.5进行内参基因的扩增(β-actin或GAPDH),并设置递增PCR循环数,电泳确定逆转录的效率及CDNA样品的起始浓度,为荧光定量PCR实验做准备,成功的逆转录样品在
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