复方丹参滴丸对光化学反应诱发的大鼠肠系膜血栓形成的.docx
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复方丹参滴丸对光化学反应诱发的大鼠肠系膜血栓形成的
复方丹参滴丸对光化学反应诱发的大鼠肠系膜血栓形成的抑制作用
王芳,刘育英,刘连祎,郭俊,孙凯,王传社,樊景禺,韩晶岩
北京大学医学部天士力微循环研究中心
摘要我们以往的研究证实了复方丹参滴丸对微循环障碍有改善作用。
但是,复方丹参滴丸对血栓是否具有改善作用尚没有直接证据。
本研究用光化学反应所诱导的大鼠肠系膜血栓模型,探讨复方丹参滴丸对光化学反应诱导血栓的抑制作用及其原理。
用微循环观察记录系统连续记录光化学刺激后大鼠肠系膜细静脉管径、血栓形成的时间、血栓与血管面积比、细静脉壁粘附的白细胞数。
结果显示,光化学刺激30分钟之内大鼠肠系膜细动静脉的血管径没有显著变化。
照射9.8秒后细静脉开始出现血栓、血栓面积迅速增加、粘附于细静脉血管壁上的白细胞数显著增加。
在光化学刺激前60分给大鼠灌胃投予复方丹参滴丸(0.4g/kg),其血栓出现的时间、血栓面积、粘附于细静脉管壁的白细胞数显著减少。
用流式细胞仪测定结果表明,光化学刺激30分钟后粒细胞粘附因子CD11b、CD18和血小板粘附因子CD31的表达显著增加,复方丹参滴丸灌胃大鼠的粒细胞粘附因子CD11b、CD18的表达受到抑制,但是、血小板粘附因子CD31的没有受到影响。
以上结果提示,复方丹参滴丸具有抑制血栓形成作用,该作用可能与其抑制粒细胞粘附因子CD11b、CD18的表达,进而抑制粒细胞与血管内皮粘附相关。
关键词:
复方丹参滴丸,微循环障碍,血栓,白细胞与内皮细胞相互作用,粘附分子
1.引言
复方丹参滴丸(CP)由丹参,三七和冰片组成,在中国、南韩、俄罗斯、越南已经被广泛地应用于冠心病、脑血栓、静脉血栓等与血栓相关疾病的治疗。
我们已经报导过复方丹参滴丸对缺血再灌注所诱导的大鼠白细胞与肠系膜细静脉粘附、细静脉壁产生的过氧化物、白蛋白的渗出、肥大细胞脱颗粒有抑制作用[1,2],可以降低慢性饮酒大鼠肠缺血再灌注后粘附于盰窦的白细胞数[3]。
复方丹参滴丸的主要组成药物丹参以及丹参的主要水溶性成份丹参素(3,4-二羟基苯甲酸)具有抑制血小板的聚集的作用[4],提示含有丹参的复方丹参滴丸可能具有抑制血栓的作用。
但是,关于复方丹参滴丸对血栓是否有改善作用的在体研究,尚未见报导。
大岛宣雄先生在1996年建立的光化学反应诱导的大鼠肠系膜血栓模型[5]已经被用于血栓和防治血栓原理的研究[6]。
本研究用微循环观察系统探讨了复方丹参滴丸对光化学反应形成血栓的抑制作用,并用细胞流式计数仪检测了复方丹参滴丸对白细胞粘附因子CD11b、CD18和血小板粘附因子CD31表达的影响。
2.材料与方法
2.1.肠系膜微循环观察方法
选体重为220-250g的SD雄性大鼠(北京大学医学部动物中心提供)禁食但正常饮水12小时后供实验用。
用20%乌拉坦溶液按1ml/100g体重肌肉注射麻醉,从腹部正中作长约20-30mm的切口,并将近回盲部的20cm的肠系膜轻轻取出,展开放在有观察孔的观察板上。
表面连续滴加37℃恒温的生理盐水保持肠系膜的温度和湿度。
用配有37℃恒温装置的倒置生物显微镜(DM-IRBLeica,Wetzler,Germany)进行观察。
通过通过连接在显微镜上的摄像机(Jk-TU53HTOSHIBA,Japan)在显示屏(J2118ATCL,Guangdong,China)上观察,直径在30-50μm之间,200μm长,无分支,无明显弯曲的肠系膜细静脉被用于实验研究。
2.2.血栓形成模型的建立
按大岛宣雄先生(NorioOHSHIMA)光化学血栓形成的方法[5],在10分钟观察之后,将血啉甲醚光敏剂(北京制药工业研究所实验药厂,第二军医大学药物化学研究所研制,批号:
971007)按0.25mg/kg体重的给药量经大鼠股静脉一次性注入。
10分钟后,用倒置荧光显微镜100瓦汞灯作光源经紫外滤光片照射在选定的细静脉上,照射光斑直径为250μm。
在照射开始时,设定显示器的时间为0分,在血栓达到细静脉管径的1/2时停止照射,连续观察并记录30分钟。
2.3.给药方法
正常对照组(control):
麻醉后暴露肠系膜,不注射血啉甲醚光敏剂,不进行照射。
连续观察并记录30分。
光化学反应组(PR):
将麻醉大鼠,按以上方法,注射血啉甲醚光敏剂和进行紫外光照射,连续观察并记录30分。
光化学反应+复方丹参滴丸组(PR+CP):
在实验前,将复方丹参滴丸(天津天士力制药股份有限公司)用生理盐水溶解成水溶液,按0.4g/kg的给药量,用灌胃管给大鼠一次性灌胃。
60分钟后,按上述方法开始注射血啉甲醚光敏剂和照射,连续观察并记录30分。
每组所用动物数均为6只。
2.4.血栓和微循环的测定
在重放的记录CD盘上进行以下测定:
血栓开始出现的时间:
由照光开始到血栓出现的时间。
血栓与血管面积比:
从照光开始到照光后5分,每隔15秒钟,用image-proplus软件测定观察视野内的血栓面积和细静脉血管面积,用血栓面积除以细静脉血管面积,得血栓与血管面积比。
细静脉直径:
在照光开始时和10分钟,20分钟,30分钟,用image-proplus软件分别测定所选静脉同一位置的肠系膜细静脉直径[7]。
粘附于细静脉壁的白细胞数:
通过观察系统所记录下来的动态图像的回放,测定粘附于细静脉壁的白细胞数。
粘附的白细胞数是指白细胞粘附于细静脉血管壁超过10秒以上的白细胞数[7]。
在照射开始前、照射后每隔15秒计数一次直5分、以后10分、20分、30分计数一次、用粘附白细胞数/200um长细静脉表示。
2.5.粒细胞粘附因子CD11b、CD18和血小板粘附因子CD31的表达的测定
在连续观察30分钟后,从大鼠肠系膜静脉取血3ml,用流式细胞仪计数5000个粒细胞,CD11b或CD18粘附因子的表达用FITC标记的CD11b或CD18抗体阳性细胞的平均荧光强度表示[8]。
另取大鼠,在光化学法刺激30分钟后,正常组、光化学反应组、光化学反应+复方丹参滴丸组大鼠各6只,从大鼠肠系膜静脉取血3ml,EDTA抗凝,分离血小板,用流式细胞仪计数500个血小板,血小板粘附因子CD31的表达用PE标记的CD31的抗体平均荧光强度表示[9]。
2.6.统计学处理
每组数据均以
SE表示,用SPSS11.0数理统计软件进行F检验,设定P<0.05的差异有显著意义。
2.结果
3.1.复方丹参滴丸对细静脉血管直径的影响
在本实验的观察时间范围内,正常对照组、光化学反应组、光化学反应+复方丹参滴丸组的细静脉管径无显著变化。
3.1.复方丹参滴丸对血栓形成时间的影响
正常对照组在观察期间内没有见到血栓的形成。
光化学反应组光照射9.8±1.02s后细静脉管壁开始出现血栓。
复方丹参滴丸显著地延长了从照射开始到血栓出现的时间(表1)。
3.2.复方丹参滴丸对血栓与血管面积比的影响
光化学反应组在照射后15秒时血栓与血管面积比增加到0.2±0.06,在照射后30秒时,血栓与血管面积比增加到0.4±0.08,并持续到75秒。
复方丹参滴丸组在照射后15秒、30秒、75秒时的血栓与血管面积比分别是0.07±0.04、0.15±0.05、0.3±0.06。
复方丹参滴丸显著地抑制了光化学法诱导的血栓与血管面积比的增加(表2)。
表1.PR、PR+CP组光化学反应诱导的大鼠肠系膜静脉血栓形成的时间
#p<0.05vsPR
表2.PR、PR+CP组光化学反应诱导的大鼠肠系膜静脉血栓面积的经时变化*p<0.05vsControl,#p<0.05vsPR
3.4.复方丹参滴丸对粘附于细静脉壁白细胞的影响
正常对照组在观察结束时粘附在细静脉管壁上的白细胞仅为1.0±0.3/200μm。
光化学组在30秒时,200μm长的细静脉管壁上粘附的白细胞多达17±3/200μm,这个值持续到45秒。
复方丹参滴丸组在紫外光照射30秒时和45秒时粘附在200μm长的细静脉管壁上的白细胞数目分别为13±3/200μm和11±3/200μm。
复方丹参滴丸显著地抑制了光化学法引起的白细胞与细静脉壁的粘附。
3.5.复方丹参滴丸对外周血粒细胞黏附因子CD11b、CD18表达的影响
与正常对照组(44.2±3.4)相比,光化学反应组外周血粒细胞粘附因子CD11b的表达显著增加(65.5±1.2),复方丹参滴丸显著地抑制了光化学反应引起的外周血粒细胞粘附因子CD11b表达的增高(52.6±3.9)(表3)。
表3.Control、PR、PR+CP组大鼠抗中性粒细胞粘附分子CD11b的荧光强度
*p<0.05vsControl,#p<0.05vsPR
关于外周血粒细胞粘附因子CD18的表达,正常对照组的平均荧光强度为69.8±8.8。
光化学反应组为104±2.9,显著地高于正常组。
复方丹参滴丸显著地抑制光化学反应引起的外周血粒细胞粘附因子CD18表达的增高(82±11.7)(表4)。
表.4.Control、PR、PR+CP组大鼠抗中性粒细胞粘附分子CD18的荧光强度
*p<0.05vsControl,#p<0.05vsPR
3.6.复方丹参滴丸对外周血血小板黏附因子CD31表达的影响
本实验中正常对照组,光化学反应组、复方丹参滴丸组血小板黏附因子CD31的表达没有显著的差异(表5)。
表5.Control、PR、PR+CP组大鼠抗血小板粘附分子CD31的荧光强度
4.讨论
本研究以光化学反应所诱导的大鼠肠系膜血栓为模型,用微循环连续观察方法证明了复方丹参滴丸可以延长光化学反应诱导血栓形成的时间,减小血栓面积,抑制白细胞与细静脉壁的粘附,并用细胞流式计数方法证明了复方丹参滴丸可以抑制光化学反应后粒细胞粘附因CD11b、CD18的表达。
给大鼠注射血啉甲醚光敏剂经紫外光照射后,在局部产生单态氧,进而损伤血管内皮,活化白细胞和血小板,引起白细胞和血小板与血管壁的粘附[10,11]。
白细胞表面的粘附因子CD1lb/CD18与血管内皮细胞粘附因子ICAM-1的结合是白细胞粘附于血管壁的主要原因[12]。
抑制白细胞表面的粘附因子CD1lb/CD18的表达能抑制白细胞与静脉内皮的粘附[13]。
但是迄今尚未见报道光化学反应是否影响粒细胞粘附因子CD11b、CD18和血小板粘附因子CD31的表达。
本研究证明了光化学反应引起白细胞与细静脉内皮的粘附的同时,外周血粒细胞粘附因子CD11b和CD18的表达显著增加。
而复方丹参滴丸可以抑制光化学反应后白细胞与细静脉内皮的粘附,并抑制了血栓的形成。
并进一步证实了:
复方丹参滴丸可以抑制粒细胞粘附因子CD11b、CD18的表达。
提示复方丹参滴丸抑制光化学反应引起的血栓形成的作用与抑制粒细胞粘附因子CD11b、CD18的表达有关。
血小板表面有CD31,CD61,CD62p等多种粘附因子,其表达可以引起血小板与血管内皮和白细胞等的粘附,在血栓形成中起重要作用[14,15]。
本研究的光化学反应没有引起的血小板粘附因子CD31表达的增加,也没有发现复方丹参滴丸对血小板CD31的影响。
由于本研究没有检测血小板粘附因子CD61,CD62p和血管内皮细胞粘附因子ICAM-1的表达,复方丹参滴丸对这些与血栓形成相关的粘附因子的影响尚需进一步探讨。
5.结论
复方丹参滴丸具有抑制光化学反应诱发的大鼠肠系膜细静脉血栓形成作用,该作用可能与其抑制粒细胞黏附因子CD11b、CD18的表达并进而抑制粒细胞与细静脉内皮粘附相关。
本研究结果表明,复方丹参滴丸在临床上可以用于血栓相关疾病的预防和治疗。
参考文献
[1]J.Y.Han,Y.Akiba,H.Suzuki,H.Nagata,S.Miura,M.OdaandH
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- 复方 丹参 对光 化学反应 诱发 大鼠 肠系膜 血栓形成