人类胚胎干细胞基础培训教材0.docx
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人类胚胎干细胞基础培训教材0
人类胚胎干细胞基础技术
高级培训班
2010-12
1.
绪论
本操作手册将为您详细介绍人胚胎干细胞/iPS细胞培养的基础知识、技术细节及相关的产品信息。
目的是为了让您更好地培养您购买的细胞,请按照此手册进行培养操作直至获得可靠的冻存细胞。
上海斯丹赛生物技术有限公司专业提供各类胚胎干细胞/iPS细胞及成套产品服务,为您的干细胞研究提供一站式解决方案。
2.
饲养层细胞的制备
材料与仪器
♦成纤维细胞完全培养基,货号EFM-01
♦胰酶,货号M-005-1
♦成纤维细胞冻存液(2x),货号EFFM-01
♦基质胶(Matrigelmatrix),BDPharmingen,货号356235
♦CF-1小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),货号MEF-CF1-01
♦T25透气培养瓶,NUNC,货号156367
♦T75透气培养瓶,NUNC,货号156499
♦2ml移液管,NUNC,货号159617
♦5ml移液管,NUNC,货号159625
♦10ml移液管,NUNC,货号159633
♦15ml离心管,货号366036
♦50ml离心管,货号373660
♦冻存管,NUNC,货号377267
♦Thermo-FisherFinnpipetteF3移液器和灭过菌的枪头
♦生物安全柜,货号
♦CO2培养箱,Thermo,HERAcell150i
♦电子计数器,millipore,货号PHCC00000
♦电动移液器,ThermoScientificFinnpipetteC1,货号4580800
♦低速离心机,ThermoScientificCL10
♦液氮罐,Thermofisher,货号CN50900
2.1从胎鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)
1.拉断颈椎处死怀孕12-13天的CF-1小鼠,浸入70%的酒精中消毒。
2.将小鼠放在超净台无菌的解剖盘中,在腹中线处做一横向切口。
3.剪开的皮肤拉向切口的上下两侧,提起腹膜,将其剪开,充分暴露腹腔。
4.找出子宫,一只手用无菌钝口镊子轻轻提起子宫,另一只手持无菌镊子小心分离子宫周围的结缔组织。
当两侧子宫都与其相连的组织分离好后,用剪刀将左右两侧的子宫在输卵管与子宫角的衔接处剪下,小心剪下子宫的联体部分,置于无菌的60mm培养皿中。
5.用无菌的剪刀在子宫头与子宫尾分别剪去输卵管及子宫角部分。
6.将子宫置于15ml离心管中,用10mlPBS洗三遍。
7.用尖镊子撕开子宫壁和胎膜,取出胎鼠,放在新的培养皿中。
8.用8mlPBS将胎鼠洗三遍。
9.用灭菌的眼科剪刀去除胎鼠的胚囊,释放胚胎,并胚胎计数。
10.将胚胎移到干净的培养皿中,PBS洗三次。
11.用镊子小心的去除胚胎的头和肝脏,PBS洗三次。
12.将胚胎转移至新的培养皿中,用无菌剪刀将组织充分剪碎,加入0.25%胰酶同时吹打几分钟使其消化均一并彻底酶解。
13.用同样体积的MEF完全培养基中和胰酶。
14.一个T75瓶加10mlMEF完全培养基,按照每2-3个胚胎一个T75瓶,将已消化的胚胎加入培养瓶中,放在5%CO2培养箱中培养,培养瓶注明细胞名称,代数及日期。
2.2MEF的传代
1.将T75瓶中的MEF培养基吸出。
2.加入大约3ml胰酶,于37℃的CO2培养箱中放置3-5分钟
3.取出瓶子,轻轻晃动,可以看见白色的细胞层开始从瓶子的底壁掉落。
确保瓶盖是拧紧的。
用手掌根轻拍瓶侧3-5次。
在灯下观察细胞是否已从瓶子上脱落。
4.加入同等体积(3ml)的MEF培养基,混匀,吹打几次以形成单细胞悬浮液。
▲Note:
这一培养基是包含血清的,将会完全抑制胰酶的活性。
5.补加42mlMEF培养基到瓶子中,使总体积达到50ml,混匀。
6.将上述细胞悬浮液均分至5个新的T75瓶子中,每瓶10ml。
7.放在5%CO2培养箱中培养,逐日观察。
2.3MEF的冻存
1.吸去培养液,加3ml0.25%胰酶至完全覆盖瓶底(以T75为例)。
2.CO2培养箱中孵育3-5分钟,不时轻拍瓶壁,使细胞层脱落。
3.加入同等体积的MEF培养液中和胰酶,吹打混匀。
4.将其转移至15ml离心管,用电子计数器进行细胞计数后,以1000rpm的速度离心5分钟。
5.移去上清,用少量新鲜的MEF培养液重悬细胞沉淀。
6.缓慢加入等量的MEF细胞冻存液(2x)并混匀。
7.分装上述细胞悬液于2ml冻存管中,每管0.25ml。
8.在冻存管上注明细胞名称,代数,数目,冻存时间。
9.将冻存管放到冻存盒中,-80℃冰箱过夜。
10.最后将冻存管转移至液氮罐中以便长期保存。
2.4MEF的失活
1.MEF传代到3-5代时,当细胞铺满培养瓶后(以T75为例),加3ml0.25%胰酶,放入37℃的CO2培养箱孵育3-5分钟。
2.加入同等体积的MEF培养液中和胰酶,用移液枪吹打几次以形成单细胞悬浮液。
3.将所有细胞悬液混合到一个50ml离心管中,补加适量新鲜的MEF培养液。
4.取0.5ml上述细胞悬液,转移至新的15ml离心管中,用4.5ml培养液稀释,混匀。
5.用电子计数器计数细胞。
6.将原来的50ml离心管封口,使用gama射线辐照仪,50-80戈雷辐照。
7.辐照完后,以1000rpm的速度离心5分钟。
8.移去上清,用适量新鲜的MEF培养液重悬细胞。
用于培养人胚胎干细胞的饲养层细胞标准浓度是∼30,000cells/cm2。
按照此标准铺板。
具体铺板步骤请见3饲养层细胞的准备。
对于暂时不用的细胞,将其冻存,需要时复苏。
具体冻存步骤请见2.3MEF的冻存。
3.
饲养层细胞的准备
材料和仪器
♦CF-1小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),货号MEF-CF1-01
♦成纤维细胞完全培养基,货号EFM-01
♦基质胶(Matrigelmatrix),BDPharmingen,货号356235
♦CO2培养箱,Thermo,HERAcell240
♦Thermo-FisherFinnpipetteF3移液器和灭过菌的枪头
♦T25透气培养瓶,NUNC,货号156367
♦2ml移液管,NUNC,货号159617
♦5ml移液管,NUNC,货号159625
♦10ml移液管,NUNC,货号159633
♦电动移液器,ThermoScientificFinnpipetteC1,货号4580800
3.1加入足量的基质胶均匀铺到瓶(或孔板或皿)底部,以能覆盖全部底部为准,譬如T25透气培养瓶以超过0.5ml为宜。
3.237℃培养箱放置至少30min。
3.3从培养箱中取出瓶(或孔板或皿),轻轻推送板子将未被基质胶覆盖的地方再次覆盖,然后立即吸弃基质胶。
3.4加入适量成纤维细胞完全培养基(37℃预孵育超过10min),譬如T25透气培养瓶以加入4ml为宜。
3.5从液氮中取出冻存的失活过的MEF细胞,立即投入37℃水浴中,迅速解冻(1min之内)。
3.6根据预实验将相应数量的饲养层细胞加到之前已经准备好的瓶(或孔板或皿)中,混匀。
推荐的饲养层细胞密度为3万cells/cm2。
Point
Ø饲养层细胞需在ES/iPS细胞传代前两至三天准备。
Ø饲养层细胞的密度最适宜是80-90%,太密或是太稀疏都容易使干细胞分化。
Ø请在铺被前先做预实验估算细胞的复苏存活率,以一个T25培养瓶计算,若存活率为90%,则铺入的细胞量应为83.3万。
▲Note:
饲养层细胞铺了10天之后推荐不再使用。
Table1培养容器的类型和需要的基质胶的体积
培养容器的类型
基质胶体积
24-well
0.1-0.2ml
12-well
0.2-0.4ml
6-well/35mm
0.4-0.5ml
60mm/T25Flask
0.5-1ml
100mm/T75Flask
2-3ml
Table2培养容器的面积和需要接种的MEF细胞悬浮液的体积(接种细胞的浓度为1.5×105cells/ml)
培养容器的类型
细胞悬浮液的体积
24-well
0.4ml
12-well
0.8ml
6-well/35mm
2ml
60mm/T25Flask
5ml
100mm/T75Flask
15ml
▲Note:
上述细胞接种密度按人类ES/iPS细胞培养的标准计。
4.
ES/iPS细胞的复苏
材料和仪器
♦人类ES/iPS细胞(SiDSH-01,SiDSH-03),货号HIPS-01/03
♦人类胚胎干细胞完全培养基,货号HESM-01-500
♦CO2培养箱,Thermo,货号HERACell240
♦Thermo-FisherFinnpipetteF3移液器和灭过菌的枪头
♦电动移液器,ThermoScientificFinnpipetteC1,货号4580800
♦T25透气培养皿,NUNC,货号156367
♦5ml移液管,NUNC,货号159625
♦15ml离心管,NUNC,货号366036
4.1解冻人ES/iPS细胞,从液氮中取出冰冻的人类ES/iPS细胞冻存管,立即投入37℃水浴中快速的旋转以迅速解冻(控制在1min之内)。
▲Note:
水不要淹没瓶盖
4.2当只有一片冰晶存在时,从水中取出冻存管。
用消毒酒精棉将冻存管外壁擦拭一遍,以去除水缸中的微生物。
4.3将细胞转移到一个预装有2ml人类胚胎干细胞完全培养基的15ml离心管中,混匀。
200×g(1000rpm),离心5分钟。
4.4吸弃上清液。
用4ml的人类胚胎干细胞完全培养基重悬细胞沉淀。
4.5转移悬浮液到一个预铺有饲养层细胞的T25瓶中,补加人类胚胎干细胞完全培养基至总体积为5ml。
4.6将瓶放入37℃的CO2培养箱中,观察细胞每天的生长情况。
Point
Ø复苏的第二天无需更换培养液,从第三天起每天更换新鲜的人类胚胎干细胞完全培养基。
Ø复苏后第5天左右可以看见微小的克隆出现,之后逐渐长大。
Ø复苏后第10-12天传代,具体情况视ES细胞生长情况而定。
5.
ES/iPS细胞的传代
材料和仪器
♦人类胚胎干细胞培养液(含bFGF货号HESM-01-500;不含bFGF货号HESM-02-500)
♦Ⅳ型胶原酶(货号M-001)
♦已经包被好饲养层细胞的培养瓶/板
♦Thermo-FisherFinnpipetteF3移液器和灭过菌的枪头
♦T25透气培养皿,NUNC,货号156367
♦5ml移液管,NUNC,货号159625
♦15ml离心管,NUNC,货号366036
♦电动吸引器
Point
Ø当出现以下情况之一即可以进行细胞传代:
1.MEF滋养层细胞生长超过两周。
2.克隆太大,或太密集。
3.当培养的ES克隆中出现越来越多的分化。
人的ES细胞传代(以T25培养瓶为例)
5.1从培养瓶中吸出旧的人胚胎干细胞培养液
5.2立即加入3-4ml的Ⅳ型胶原酶到瓶中,温柔的摇晃培养瓶使之覆盖到所有的细胞。
▲Note:
Ⅳ型胶原酶需在37度预热。
5.3将T25瓶重新放回37度培养箱中,放置约20min-30min。
5.4消化期间可以处理预铺了饲养层细胞准备用来传代的新的培养瓶,处理如下:
吸弃里面的成纤维细胞完全培养基,加入1ml人类胚胎干细胞培养液(不含bFGF)洗涤feeder(只要将瓶底盖过),吸弃,然后加入4-5ml新的人类胚胎干细胞完全培养基,以备传代。
5.5待克隆消化下来后,取出培养瓶,将瓶中液体连同脱落的克隆转移到15ml离心管里。
加入2ml的人类胚胎干细胞培养液(不含bFGF),混匀。
5.6待干细胞团块沉降下来后,吸弃上清液。
5.7加入2ml新鲜的人类胚胎干细胞培养液(不含bFGF)洗涤细胞(即吹打重悬),待细胞沉降下来后,吸弃上清。
5.8加入2ml新鲜的人类胚胎干细胞完全培养基重悬细胞,并用移液枪吹打克隆到适合大小,然后根据自己需要按比例传代。
Point:
Ø在消化过程中,最好每隔10min拿出来观察一下,看是否已经开始消化。
随着克隆的消化,克隆边缘部分卷起,当克隆大部分卷起,直至轻轻晃细胞就会脱落时,表明消化充分。
注意:
消化时间约为20-30min,根据经验,这一时间段可以将未分化的干细胞克隆消化下来,而分化的克隆就不会消化下来,所以,消化时间不宜过长,这样可以剔除分化的克隆。
而如果消化不充分,会导致传代后的细胞结块。
所以,要掌握好时间。
Ø如果细胞不易沉降,则可以1000-1200rpm离心30sec-1min使细胞沉降。
Ø传代比例通常为1:
6或1:
8。
Ø传代后的注意事项:
1.传代后的第一天,不需更换新的培养液,从第二天起,每天换液。
2.传代周期为6-7days,但要视细胞状态而定,传代可以改善细胞状态。
3.传代的前两至三天预铺feeder。
6.
ES/iPS细胞的冻存
材料和仪器
♦人ES/iPS细胞(生长到可传代的状态,同上描述)
♦人胚胎干细胞培养基(货号:
HESM-01-500)
♦Ⅳ胶原酶(货号M-001)
♦人胚胎干细胞冻存液(2x)(货号:
HESFM-01)
♦15ml离心管,NUNC,货号366036
♦液氮罐,Thermo,货号CN50900
♦冰
♦镊子
♦ThermoF3移液器和灭过菌的枪头
♦2ml冻存管,NUNC,货号377267
♦冻存管架,NUNC,货号376589
Point:
Ø人的胚胎干细胞可以在液氮中长期冻存。
Ø为了得到人类胚胎干细胞的高存活率,在开始冻存步骤之前,准备好所有的材料和仪器。
冻存管在使用之前应该在冰上预冷,且应该事先将必须的信息(如细胞的名称,传代次数,细胞数目,冻存日期等)标记在管子的标签上。
冻存步骤(以T25瓶为例):
6.1当细胞生长良好时,消化细胞(具体步骤同上述传代过程)。
6.2将消化下的细胞洗涤两次。
6.3用2ml新鲜的人胚胎干细胞培养基重悬细胞并吹打至传代大小。
6.4待克隆沉降下来后,吸弃上清。
6.5加入0.25ml新鲜的人胚胎干细胞培养基重悬细胞
6.6加入0.25ml人胚胎干细胞冻存液(2x),快速混匀。
6.7将上述0.5ml细胞悬液转移至2ml冻存管中。
6.8迅速将冻存管放入冻存盒中,-80℃冰箱过夜。
6.9最后将冻存管转移至液氮罐中以便长期保存。
7.
人类胚胎干细胞的无滋养层培养
材料与仪器
7.1人类胚胎干细胞条件培养基(CM)的收集
1.配制人类胚胎干细胞培养液。
2.培养瓶加入适量明胶(覆盖瓶底即可),放入5%CO2培养箱孵育30分钟左右。
3.吸掉明胶,将辐照过的饲养层细胞按照55,000cells/cm2浓度铺板。
4.待细胞贴壁后,换人类胚胎干细胞培养液培养液(按照0.5ml/cm2)。
5.24小时左右开始收集培养液,之后每天收集,可持续收集7-10天。
6.CM可存放在-20℃冰箱中一个月。
7.2无饲养层人胚胎干细胞系的培养及传代
1.在培养瓶中加入适量matrigel(覆盖瓶底即可)放入培养箱孵育1小时左右。
2.吸去matrigel,将饲养层培养的人胚胎干细胞传代洗涤后,最后细胞转移到此培养瓶中,加CM培养。
3.在人胚胎干细胞克隆生长5天左右传代。
吸去培养液,加dispase5%CO2培养箱消化至克隆大部分脱壁。
4.加适量培养液,用移液管轻轻吹打使克隆脱壁。
5.将细胞悬液转移到15ml离心管中,用移液管吹打几次使细胞克隆至适当大小。
6.吸取适量混匀的悬液至小离心管中,离心沉淀,用胰酶消化成单细胞,加培养液中和,细胞计数。
7.以1000rpm的速度离心5分钟。
8.吸去上清,加CM培养液重悬细胞。
9.按照∼90,000–170,000cells/cm2将细胞接种到已铺好matrigel的培养瓶中,补加适量CM。
轻轻晃动培养瓶,使克隆均匀分布在瓶底,放入5%CO2培养箱培养。
8.
拟胚体的形成
材料与仪器
拟胚体(embryonicbody,EB)来源于多能干细胞,且由多种分化的细胞类型组成。
它可以模拟胚胎早期发育的过程,是一种很好的在体外研究早期发育中细胞和分子间作用的模型。
拟胚体的制备:
将得到的iPS细胞系扩增培养后,按正常传代步骤消化下来,洗涤去除MEF细胞,将细胞吹打至小团块(比正常传代大小再小一些),然后悬浮培养在MEF培养液中。
3天后换第一次液,之后每2-3天换液一次,直至收集。
收集EB后用TRIZOL裂解,抽提RNA,反转录,通过real-timePCR的方法(见real-timePCR检测的具体protocol)检测各胚层marker的表达情况。
9.
胚胎干细胞全能性的鉴定
胚胎干细胞全能性的鉴定主要包括以下几个方面:
●碱性磷酸酶活性检测
●干细胞表面marker的免疫染色检测
●干性因子的去甲基化分析
●干细胞内源基因的表达分析
●端粒酶活性检测
●核型检测
●拟胚体形成
●畸胎瘤形成实验
下面分述各种鉴定的方法以及详细的操作步骤:
9.1碱性磷酸酶活性检测
材料
✓PBSbuffer
✓4%Paraformaldehyde
✓AlkalinePhosphataseDetectionKit:
Sidansai,货号AP-1kit
✓1xRinseBuffer(e.g.TBST:
20mMTris-HCl,pH7.4,0.15MNaCl,0.05%Tween-20)
碱性磷酸酶染色步骤:
a.AspiratemediaandfixESoriPScellswithafixative(e.g.4%ParaformaldehydeinPBS)for1-2minutes.Note:
Donotoverfix.Fixingcellslongerthan2minuteswillresultintheinactivationofalkalinephosphatase.
b.AspiratefixativeandrinsewithPBSbuffer.
c.Aspirateandrinsewith1XRinseBuffer.DONOTallowwellstodry.
d.PreparereagentsforAlkalinePhosphatasestaining(BufferA:
BufferB:
BufferC=100:
38:
28)
e.Addenoughstainsolutiontocovereachwell(e.g.0.5mLforawellofa24-wellplate).Incubateindarkatroomtemperaturefor15minutes.
f.Aspiratestainingsolutionandrinsewellswith1XRinseBuffer.Covercellswith1XPBStopreventdryingandthencountthenumberofcoloniesexpressingAP(redstemcellcolonies),versusthenumberofdifferentiatedcolonies(colorless).
9.2干细胞表面marker的免疫染色检测
可用的试剂盒包括:
货号
包装
所鉴定的抗体
A-P1-1KT
10test
Oct4,Sox2,Nanog,SSEA4,Tra-1-60,Tra-1-81
A-P2-1KT
10test
Oct4,Sox2,Nanog,SSEA1,SSEA3,SSEA4,Tra-1-60,Tra-1-81
A-P3-1KT
10test
Oct4,Nanog,Sox2,SSEA1
表达于人类ES/iPS细胞中的标志物包括:
Stage-specificembryonicantigen-3(SSEA3)
Stage-specificembryonicantigen-4(SSEA4)
Tumor-relatedantigen-1-60(TRA-1-60)
Tumor-relatedantigen-1-81(TRA-1-81)
OCT4
SOX2
Nanog
表达于小鼠ES/iPS细胞中的标志物包括:
Stagespecificembryonicantigen-1(SSEA-1)
OCT4
SOX2
Nanog
免疫染色步骤:
1.首先把细胞固定在4%多聚甲醛(4%PFA)中,室温放置30min;
2.在无水乙醇中浸泡两次,每次20min(或3次,10min/次)
注意:
此步骤仅限于核蛋白,如Oct4,Nanog或Rex1等,不能用于膜蛋白如SSEA和Tra等
3.将上述溶液吸干,先用1XPBS洗涤一次,再用抗体稀释液(0.2%BSA和0.1%TritonX100溶于PBS)洗涤两次;
4.(此步骤可不操作,进行此步骤是为了更好的封闭非特异反应)用封闭液(含1%BSA+4%normalserum+0.4%TritonX100的PBS溶液)封闭细胞;
5.将一抗稀释在抗体稀释液中,加到样品上,室温2h或4度放置过夜;
6.用PBT(0.1%TritonX100)洗涤细胞3-5次;
7.将二抗稀释在抗体稀释液中,并加到细胞样品上,室温放置1h;
注意:
从步骤7开始,样品要注意避光!
8.用PBT洗涤3次;
9.将DAPI(1mg/mlinPBS)母液以1:
1000用PBS稀释,室温放置5min;
OR:
将JASMIN(hochest)母液以1:
1000用PBS稀释,室温放置5min;
10.用PBS洗涤5min,两次;
11.再用4%多聚甲醛室温固定30min;
12.最后再用PBS洗涤两次,每次5min.
9.3干性因子的去甲基化程度分析
BisulphiteSquencing法分析甲基化状态
(一)Bisulphite处理基因组DNA
1、将基因组DNA置于冰上,液体石蜡冰上预冷。
2、给每个样品准备6个Ep管,每管加300ul液体石蜡。
3、准备样品:
1)每个样品取210ng的DNA,稀释到21ul。
2)新配2M的NaOH(用超纯水配,1.6gNaOH/20ml水),每管样品中加4ul(使之终浓度为0.3M)NaOH。
3)50℃,15min。
4、准备2%低熔点argrose:
0.02g/ml,用双蒸水配。
100℃5min,之后置于50℃待用。
5、向3中的DNA液中加入50ul2%低熔点argrose,混匀(保持50℃)。
6、吸取上述argose和D
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