内生细菌提高向日葵幼苗在水分胁迫条件下的生长能力产生水杨酸并抑制病原菌生长模板.docx

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内生细菌提高向日葵幼苗在水分胁迫条件下的生长能力产生水杨酸并抑制病原菌生长模板

内生细菌提高向日葵幼苗在水分胁迫条件下的生长能力，产生水杨酸，并抑制病原菌生长

摘要

从灌溉或干旱条件下选择植物生长促生菌（PGPB）的内生细菌菌株SF2（与木糖氧化无色杆菌99.9%同源）和SF、SF4（与短小芽孢杆菌99%同源）。

本研究旨在讨论水胁迫条件下栽种的向日葵接种SF2、SF3、SF4，来评估这些菌株在控制介质或在WA=—20.3MPa条件下水杨酸（SA）的产生，分析外源水杨酸、茉莉酸（JA）、细菌颗粒和细菌培养上清对病原真菌链格孢、菌核菌和黄藻生长的影响。

通过两个自交系来研究细菌接种的生长反应（水分胁迫敏感B59和水胁迫B71）和商业混合帕莱索24。

水分胁迫和正常条件下，植物生长后接种对于帕莱索24和水分胁迫敏感B59比水胁迫B71增强更强烈。

所有3个菌株在控制介质中生产水杨酸（SA）的能力SF3、SF4较SF2高。

水杨酸的生产显著高于WA=—2.03MPA。

外源水杨酸和茉莉酸导致了菌核病生长的显著降低，轻微降低了链格孢和轮枝菌的生长。

真菌的生长相较于细菌上清液被细菌颗粒更加强烈的影响。

我们的研究表明，在水胁迫条件下，这些内生菌能够显著提高向日葵幼苗的生长能力，产生水杨酸，并抑制病原真菌。

这些特性对于制定提高向日葵生长及作物产量的菌剂配方非常有用。

缩写

JA茉莉酸PGPB植物生长促生菌SA水杨酸

引言

向日葵是全世界内被广泛种植的油料作物。

总的来说，向日葵的栽种面积因其适度的栽培需要和高产油量而稳步增加。

在阿根廷，向日葵种植的潜在地区从北部的查科拓展到南部的潘帕斯草原。

向日葵经常暴露在该地区的干旱期，越向西干旱期越长。

大豆种植的扩增近年来已经影响到了其他作物的种植面积，向日葵也被置换到了边远地区。

对于向日葵来说，由于恶劣的气候和土壤条件，一个高收益和生产的主要障碍就是缺乏同步周期的作物。

在农业生产中，微生物的应用对于减少化学肥料的使用非常重要。

接种细菌可以促进植物的生长，加速种子的萌发，抑制植物病虫害，提高出苗率，更好的应对外部威胁，并改变根的生长模式。

一个可能的策略来帮助植物处理环境压力就是在植物的根际土壤中引入益生细菌。

在某些情况下，这些细菌可以规范和提高植物的性能来应对环境压力，从而保持或提高产量。

这种方法提高了仙人掌和长春花在水分胁迫条件下的生长。

在长期胁迫条件下与植物相联系的细菌生长与植物共同进化，并为植物提供了显著的收益。

这些可能会在根际、根部表面或土壤中自由生长的微生物，被称为植物生长促生菌（PGPB）。

植物生长促生菌在以下几个方面促进植物的生长：

（一）直接提高植物的代谢，短时间内的供应来增加物质水平，例如，固定大气中的氮，溶解磷铁，或增强植物激素的生产；

（二）提高植物对环境胁迫如干旱、盐碱的耐受性;（三）通过减轻影响植物生长的细菌、真菌、线虫和病毒来间接促进。

不同的细菌（包括无色杆菌属、固氮螺菌、芽孢杆菌、假单胞菌属和根瘤菌）都被证明有植物生长促生菌的功效。

尝试在农业作物的根际土壤中引入有益的细菌一般都遇到了不同程度的失败，主要的困难时将野生种定植于已经驯化了的微生物群落。

通常情况下，从一种特定的植物根际分离的包含高效基因型的土生菌种来促进植物生长和执行这些功能比外来物种更好。

病原真菌，尤其是链格孢属、核盘菌、黄萎病菌，对阿根廷向日葵造成了非常严重的经济损失。

链格孢产生黑褐色斑点的叶子，病变的部分联合，导致叶片的枯萎。

茎部的病变从狭窄深色的斑点扩大。

这些病变部位合并，形成大的断裂的黑色区域，导致茎部破损。

菌核在土壤中或植物碎片中越冬。

当它们接触到向日葵根部时，菌核发芽。

幸存的向日葵可能会小于正常的植株，并且有可能不产生种子。

症状是叶片突然枯萎，根部腐烂，茎部溃疡，在向日葵干部产生菌核。

棉花黄萎病菌感染的最初症状是坏死的叶片区域有枯萎黄边，并且总是从叶片的底部向上部蔓延。

受影响的叶片很快会完全干枯，在茎部的界面，维管系是棕色的，在可见光下可看到一个棕色环。

报告显示，几种植物激素（包括水杨酸和茉莉酸）都具有抗真菌活性。

例如，水杨酸减少菌丝的生长和尖孢镰刀菌的数量;茉莉酸抑制稻瘟病菌孢子的萌发和大麦白粉菌附着胞的分化。

在此前的一份研究中，我们从向日葵在灌溉或干旱条件下生长营养阶段的结束时期从土壤中分离出大量的菌株。

在固氮能力，溶磷能力，蛋白水解和纤维素酶活性，抑制病原真菌和生产JA、脱落酸能力的基础上筛选出三个菌株，被鉴定为芽孢杆菌属（SF3和SF4）、无色杆菌属（SF2）。

在本研究中，我们研究了

（一）将SF2，SF3，SF4菌株接种于自交系向日葵系B59（对水分胁迫敏感），B7-l（宽容的水应力），和商业混合帕莱索24，来研究在水分胁迫条件下幼苗的生长能力；

（二）在正常和胁迫条件下SF2，SF3，SF4生产水杨酸的能力：

（三）菌株培养液离心沉淀和上清液对生长着的病原真菌（链格孢属、核盘菌、黄萎病菌）的抑菌能力（四）在生长着的真菌上施加外源水杨酸和茉莉酸的影响

材料与方法

接种程序和植物生长

自交系向日葵B59和B71，由阿根廷国家农业技术研究所（INTA）培育而成，特征分别为对水分敏感型和耐水分胁迫型。

商业混合帕莱索24进行接种试验。

5粒种子被放置于包含无菌蛭石的罐子里，放置于一个16小时光照（28C）/8小时暗（20C）的光周期室内。

第四天，幼苗分别接种SF2、SF3、SF4（108CFUml-1），1mlLB培养基添加到未接种的幼苗上（对照），幼苗通过毛细管虹吸蒸馏水浇灌。

一组接种的幼苗用半强度的霍格兰溶液浇灌。

其它两组用6000浓度的聚乙二醇来产生Wa=-048和Wa=-0.96与半强度的霍格兰溶液混合浇灌。

接种后的第14天，收获种苗。

记录根和茎的干物质（DM）的值。

每一组实验的每一个处理都设置了4个重复，得到4个重复的实验结果。

水杨酸（SA）的评价

从用LB培养基培养的稳定期的细菌菌株中选出25ml（96h）（细胞密度为1010 CFU ml-1）或选用13.7%聚乙二醇6000（WA =-2.03 MPa）培养的菌体（细胞密度为108 CFUml-1），用于SA测定。

25ml不含有细菌的LB培养基（WA = -1.12 MPa）作为对照。

将它们以8000rpm离心，4 C，20分钟。

取两毫升的上清液过滤和用盐酸酸化至ph2.5。

以50纳克为标准添加（2H4）-SA。

每个样品均分两步进行2ml乙酸乙酯添加和蒸干。

将残渣用50II甲醇溶解，每10II注入LC-MS/MS。

实验设置5个重复。

高效液相色谱法

使用联盟2695（分离模块，沃特斯，美国）配备自动取样器的四元泵来执行分析。

RestekC18（Restek，USA）柱（2.1 9 100毫米，5Im）在28C注射10II体积使用。

二元溶剂系统用于以200IImin-1的恒定流速梯度洗脱0.2%醋酸的水（溶剂B）和甲醇（溶剂A）。

将溶剂A用以下的比例线性梯度（V/V）[t（min）,%A]:

（0,40）,（25,80）,再平衡7min。

质谱法

MS/MS实验在MicromassQuatroUltimaTMPT双四级质谱仪（micromass，曼城，英国）上进行，所有对水杨酸的分析都使用涡轮离子喷雾源在负离子模式下进行如下设置，双毛细管电压V – 3000，能量35 V锥，射频lens1（20），射频lens2（0-3）源的温度-100C，溶剂温度 380C，气锥100Ih-1，气体溶剂701Ih-1，碰撞（50），乘（650）。

MS/MS试验参数的优化使用在A/B（40:

60,v/v）.流动相中稀释为浓度为10纳克II-1个人的水杨酸标准溶液。

MS/MS产物离子通过在双四极质谱计的碰撞细胞中选定的前体离子碰撞活化解离产生，质量用仪器的第二分析仪分析。

在负离子模式下，用去质子化的分子[M–H]-做水杨酸谱。

由于许多化合物可能存在相同的标称分子量，通过注射样品的多反应检测（MRM）就行定量。

用源质量或独特碎片离子的结合来检测水杨酸在细菌培养液中的使用。

每个过度停留1000毫秒，通过监测水杨酸（2H4）-SA（内部标准）的137/93和141/97的跃迁来监测MRM的采集。

病原真菌的生长试验

之前的研究发现，某些细菌能够抑制植物病原真菌的活性。

我们通过研究链格孢、核盘菌和黄萎病菌的生长来研究细菌沉淀和上清液对其的影响。

通过对研究水杨酸和茉莉酸对油菜核盘菌的影响进行测试。

为了获得菌株SF2、SF3和SF4的颗粒和澄清液，对在指数生长期的20ml各菌种进行在4C条件下8000转离心20min，在25HZ条件下超声处理10min，在20C条件下冻结30min，解冻。

在含有麦芽提取物的琼脂平板上，每一种真菌菌丝颗粒都在进行蔓延。

分别对细菌澄清液1ml，水杨酸（4pmolml-1），或茉莉酸（2pmolml—1）在37C生物麦芽提取物无菌琼脂转移平板进行电容测定。

真菌的菌丝体在25C条件下平板之间培养7天（直径1cm），用水杨酸、茉莉酸和上清液作为对照组，没有含有真菌菌丝体的颗粒。

对菌丝生长的抑制（%）作用的计算公式为I=[（C-T）/C]9100,控制C菌丝和T菌丝在每个平板的直径，实验设置六个重复。

统计分析

在水杨酸水平对抗真菌的效果进行对根和茎DM的进行统计测试水平的方差分析，并对数据进行事后多重范围试验。

使用非参数检验（Kruskal–Wallis）来检测细菌颗粒对黄萎病的效果（图6）和水杨酸/茉莉酸对链格孢和核盘菌的影响（图5a，b），使用软件为StatgraphicsPlus,v.3（Manugistics,Rockville,MD,USA）.。

结果

正常条件下和水分胁迫条件下幼苗接种SF2、SF3、SF4的效果

在有无接种菌株的条件下监测不同基因型的向日葵对水分胁迫敏感度的反应，评估胁迫对根与芽影响的早期植物响应。

在正常生长条件下（Wa=-0.2MPa），三株菌株都接种的商业混合帕莱索24幼苗干物质均有增加（Fig.1a）。

在Wa=-0.48MPa，与未接种菌株的种苗相对比，SF3和SF4接种的芽干物质分别增加了1.29倍和1.43倍（图1b）。

在Wa=-0.96MPa，接种任意3株菌株的芽的干物质都只是有少量的增加。

在Wa=-0.2MPa，接种SF3幼苗的根部干物质显著增加而接种SF2和SF4增加程度较小（图1d）。

在适度的胁迫条件下（Wa=-0.48MPa），SF3和SF4增加了根部的干物质。

在严重胁迫条件下（Wa=-0.96MPa）,三株菌株均能显著增加根部的干物质（图1f）

图1正常生长和水分胁迫条件下，商业混合帕莱索24幼苗接种菌株对芽和根干物质的影响（N为未接种，每个实验包括4个重复，去除结果显著不同的幼苗）

图2在正常和胁迫条件下生长的抗逆性基因型B71接种细菌对植物根和芽干物质的影响符号和实验设计如图1所示

接种了3株菌株的水分胁迫抗性基因型B71显著增加了芽在胁迫和水分正常条件下的干物质（图2a-c）。

根部干物质的增加也与之相似（图2d-f）。

在严重胁迫条件下，只有SF2菌株没有增加根部的干物质（图2f）

对于水分胁迫敏感型基因型B59，SF2和SF3增加了芽在正常生长条件下的干物质（图3a）。

在适度胁迫条件下，SF3和SF4（尤其是SF4），与接种SF2相比能显著增加芽的干物质（图3b）。

相反的，在严重胁迫条件下，接种菌株的向日葵幼苗干物质不受影响。

在正常生长条件下，接种细菌也没有明显植物根部的干物质（图3）。

在适度胁迫条件下，接种3种菌株的植物根部干物质显著增加（图3e）。

在严重胁迫条件下，接种SF3也能轻微增加其根部干物质（图3f）。

图3在正常和胁迫条件下生长的水分敏感型基因型B59接种细菌对植物根和芽干物质的影响符号和实验设计如图1所示

利用细菌生产水杨酸

在72h菌株培养达到稳定时，测量细菌生产水杨酸的量。

在LB培养基上培养SF2、SF3、SF4（Wa=-1.12MPa）。

在聚乙二醇存在的条件下，产生-2.03MPa的水势来进行激素评价。

在LB培养基中，Wa=-1.12MPa条件下，SF3和SF4产生大量的水杨酸。

SF2生产的水杨酸含量（16pmolml-1）低于SF3（238pmolml-1）和SF4（270pmolml-1）。

在水分胁迫条件下（Wa=-2.03MPa），3株细菌生产水杨酸的能力均显著增加（图4）。

图4在LB培养基（WA = -1.12 MPa）和LB与PEG混合培养基（WA = -2.03 MPa）上生长的SF2、SF3、SF4菌株发酵生产水杨酸

实验设置5个重复。

值表示不同字母表示在0.05差异显著P

水杨酸、茉莉酸、细菌颗粒和细菌上清液对病原真菌生长的影响

外源添加水杨酸或茉莉酸减少链格孢13%的生长（图5A），也减少了黄属类似的生长量（图5C）。

两种激素对核盘菌的生长产生了更大程度的下降：

24%由水杨酸，17%由茉莉酸（图5B）。

图5外源水杨酸和茉莉酸对向日葵内病原真菌的影响

a链格孢菌b核盘菌c黄萎病菌值表示不同字母表示在0.05差异显著P

三株菌株的上清液均能少量降低链格孢（图6a）和黄属（图6c）真菌的增长。

核盘菌的生长受到SF2上清43%抑制，SF3上清33%抑制，SF4上清22%抑制（图6b）。

三株菌株颗粒抑制链格孢生长的程度类似：

52%-53%（图6D）。

核盘菌生长被SF4颗粒58%抑制，被SF3颗粒52%抑制，被SF2颗粒50%抑制（图6c）。

黄属的生长被SF2颗粒57%抑制，被SF4颗粒54%抑制，被SF3颗粒47%抑制（图6f）。

图6SF2、SF3、SF4细菌上清液和细菌颗粒对病原真菌生长效果的影响

a-c细菌上清液d-f细菌颗粒值表示不同字母表示在0.05差异显著P

因此，细菌颗粒对病原真菌的抑制作用大大高于细菌上清液或水杨酸、茉莉酸。

讨论

作物的生产和产量对众多的环境胁迫因素非常敏感。

保存和提高植物产量的一个重要战略是在植物的根际土壤中接种益生菌来帮助提高抗逆性。

例如在玉米种接种巨大芽孢杆菌，能够提升营养同化，尤其是对氮磷钾的同化。

对麻风树的种子（巴巴多斯坚果）接种芽孢杆菌，能够非常明显的改进幼苗各项指标的活力。

在我们试验中使用的各种基因型向日葵，水分胁迫并未对未接种菌株的商业混合帕莱索24和耐旱自交系B71茎或根的生物量造成显著的减少。

这种现象可能主要与他们的耐水基因型的能力有关。

相反的，在菌株存在的情况下，受水分胁迫的敏感型基因型B59植株根系生物量急剧增加，可能是他能够提高水分的吸收。

在严重环境胁迫条件下，芽孢杆菌（菌株SF3和SF4）和无色杆菌（菌株SF2）能够明显增加向日葵幼苗根上部和根系干物质的生长。

轻度水分胁迫条件下,SF3和SF4增加帕莱索24芽和根的干物质，而SF2对此没有影响。

在严重水分胁迫条件下，所有三个菌株对帕莱索24和B71的生长均有促进作用（除了SF2值对B71根部干物质无明显影响），SF2和SF4不能改变重度水分胁迫对压力敏感自交系B59的效果。

总之，这些研究结果表明，与无色杆菌相比，芽孢杆菌属能够更有效地帮助向日葵幼苗来适应水分胁迫。

观察向日葵3种基因型接种SF2、SF3、SF4的差异。

在水分胁迫条件下和正常条件下，帕莱索24和B71接种细菌的效果最好。

接种细菌的帕莱索24和B71在水分胁迫条件下根部干物质的增加可能是由于其能够促进向日葵幼苗对土壤中水分的吸收。

给B59接种后，只有在轻度水分胁迫条件下芽和根的干物质有所增加。

与帕莱索24和B71相比，B59所观测到的不同的结果被认定是不同植物基因型对细菌菌株的影响。

这可能是由于这些细菌通过促进向日葵产生的具体激素来促进其生产的增长。

短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌已经被证明能够大量促进生长素和赤霉素的产生。

短小芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌能够促进红辣椒幼苗的增长。

SF2、SF3和SF4能够增强其它生长调节剂的生产（例如茉莉酸、脱落酸），同样能够提升植物对抗土壤胁迫条件的能力。

已知以下几个属的细菌，包括假单胞菌能够合成水杨酸。

我们可以考虑使用向日葵内生菌SF2、SF3和SF4合成水杨酸的能力，在LB培养基中（Wa=-1.12MPa）。

在水分胁迫条件下（Wa=-2.03Mpa），能够增加水杨酸的生产。

通过细菌合成水杨酸不仅在植物抵抗病原体感染，也在调节植物对非生物胁迫反应，都发挥了重要的作用。

若菌株失去了产生水杨酸的能力，那它们促进植物产生抗病性也会丧失。

外源水杨酸的添加导致链格孢属、核盘菌和黄萎病病菌8%-17%的抑制作用。

这表明有其它的化合物与水杨酸和茉莉酸一起共同抑制病原真菌的生长。

特别是不同的芽孢杆菌产生的肽和脂肽如fungicine，iturinbacillomicine，和一些其它物质，都具有抗菌特性。

在我们的研究中，茉莉酸比水杨酸能够更有效的抑制病原菌的生长。

与本研究相关的其它研究表明，水杨酸抑制白绢病、小菌核病等病原真菌的生长。

高浓度的水杨酸（270mgL-1）对褐腐病菌有直接的毒害作用，能够显著抑制这种病菌菌丝体的生长。

外源水杨酸处理显著降低了菌丝的生长和西瓜尖孢镰刀菌的生物量。

在本研究中，SF2、SF4和细菌颗粒对黄伟病菌的生长抑制作用最强，尽管SF2在3株菌株中有最低的水杨酸生产量。

众所周知，芽孢杆菌能够产生多种抑制植物病原真菌的化合物。

例如，从向日葵头状花序分离的芽孢杆菌菌株bnm112能够抑制许多种病原真菌的生长，排泄代谢产物。

菌株SF2和SF3对病原真菌的抑制作用可能是由于他们能够生产水杨酸、茉莉酸或一些其它抗生素化合物。

这些化合物主要是在细菌颗粒中被发现，其对真菌的抑制作用明显高于上清。

目前的研究结果表明，在有限选择的植物环境因素影响如水分胁迫下，向日葵内生菌、植物的基因型以及细菌菌株的多样性均能有助于促进植物在胁迫条件下的生长。

在水分胁迫条件下，细菌产生水杨酸以及细菌颗粒对特定病原真菌的抑制效果都是制定有效孕育剂所要考虑的重要因素。

细菌菌剂在许多方面促进植物的生长。

例如加快种子萌发，提高出苗，改变根生长模式，响应外部压力，保护植物免受病虫害。

种子和幼苗阶段是在植物生命周期中确定植物产量的关键阶段。

我们的研究结果表明，如果将向日葵接种一个合适的植物促生菌如SF2、SF3或SF4，那么它们可以高效的种植在水分胁迫的条件下。

对于在向日葵幼苗中接种的这些分离菌株的特征和影响能够有效改进菌剂的配方，促进生长，提高向日葵的作物产量。