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16第十六章遗传工程390404
第十六章遗传工程
教学目的
本章要求理解遗传工程的概念,了解遗传工程的内容,理解细胞工程的主要步骤和染色体工程的一般方法,掌握基因工程的主要步骤、工具酶的种类及其作用特点、常用载体的特点、目的基因的分离提取方法、体外重组的机理、基因表达的控制。
学习指导
遗传工程是七十年代初期才发展起来的一门新技术。
它是以分子遗传学为理论基础,以现代生物化学和微生物学为技术手段,通过对遗传物质DNA进行人工操作,实现对生物遗传性状的定向改造。
遗传工程包括细胞工程和基因工程。
细胞工程是细胞水平上的遗传操作,基因工程是在分子水平上对遗传物质进行体外操作。
学习本章时,应在了解分子生物学的基础之上,广泛参阅有关文献,增加对各种基因工程步骤的了解,了解遗传工程的成就和前景。
基本概念
遗传工程(geneticengineering):
广义的遗传工程是指人为地把一种生物的遗传物质转移到另一种生物的细胞中去,并使这种遗传物质所携带的遗传信息在受体细胞中表达的遗传操作。
包括细胞水平、染色体水平和分子水平等几个方面的遗传操作。
狭义的遗传工程专指基因工程。
细胞工程(cellengineering)是应用细胞生物学和分子生物学方法,借助工程学的试验方法或技术,在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性,以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法。
染色体工程(chromosomeengineering):
将一种生物的特定染色体按照人们的意图予以消除、添加或代换同种或异种整条或部分染色体的方法和技术,是染色体水平上的遗传工程,也称染色体操作。
基因工程(geneengineering):
狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因;广义的基因工程则指按人们意愿设计,通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。
细胞核移植(nucleartransplantation):
用细胞融合或显微操作技术,将一个细胞的细胞核移人另一去核的细胞内,借以改变其某些遗传特性的方法。
细胞器移植(organelletransplantation):
将一个细胞中的细胞器移人另一个细胞中去,借以改变细胞的某些遗传特性的方法。
细胞融合(cellfusion):
用人工方法把两个或两个以上的细胞融合成一个细胞,也称作细胞杂交。
载体(vector,vehicle):
是一种转移因子,DNA载体是能够自我复制的DNA分子,它能将DNA片段从一类寄主转运到另一类寄主中。
基因工程常用的载体有质核、入噬菌体、SV40,柯斯体等。
科斯质粒(cosmid):
又称柯斯体、粘性质粒,是含有COS(cohesveendsit的缩写)位点的,由λDNA和细菌质粒DNA重组构成的杂种质粒,主要由入DNA的COS段片断,质粒的复制起始区和抗药性标记区,一种或几种限制酶的单一切点组成。
克隆(clone):
或称无性繁殖系,是一批遗传上相同的分子、细胞或来自一个共同祖先的生物无性后代群体,在不发生突变的情况下,具有完全相同的遗传结构。
限制性内切酶(restictionendonuclease):
能识别DNA分子中的一定序列,从一个特定的位点将DNA链切开的核酸内切酶。
平末端(bluntend):
碱基完全配对的双链DNA的末端。
粘性末端(cohesiveend):
双链DNA分子被限制性内切酶切割之后产生单链互补节段的末端。
两个具有相对末端的单链可以通过碱基配对连接起来。
基因文库(genelibrary):
用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA的所有片段随机地连接到基因载体上,然后转移到适当的宿主细胞内,通过细胞增殖而构成各个片段的克隆,当制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下,这一组克隆的总体就称为该生物的基因文库。
分子杂交(molecularhybridization):
两条具有互补核苷酸顺序的单链核酸分子片断,通过实验手段形成DNA—DNA,DNA—RNA,RNA--RNA双链分子的过程。
转染(transfection):
用去蛋白质外壳的病毒核酸感染细胞或原生质体的过程。
探针(probe):
带有放射性同位素或其他活性物质标记的某种特定的DNA或RNA片段,用于核酸分子杂交技术,以检出标本中的待测核酸分子中与探针互补的顺序。
本章主要内容
遗传工程就是人们根据自己的需要,有目的、有计划地改造现有的生物类型,甚至按照某种预先设计的蓝图,对生物的遗传物质进行分离提取、剪裁增删、修补替换等操作,从而有效地干预活体的遗传结构体制,进而改变生物的遗传特性的技术。
广义的遗传工程是指把一种生物的遗传物质(细胞核、染色体、脱氧核糖核酸等)转移到另一种生物的细胞中去,并使这种物质所带的遗传信息在受体细胞中表达。
故广义的遗传工程包括细胞工程、染色体工程和基因工程。
狭义的遗传工程专指基因工程。
基因工程也有广义与狭义之分,狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因;广义的基因工程则指按人们意愿设计,通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。
第一节细胞工程
一、细胞融合
细胞融合是细胞工程的重要基本技术,是指两个或多个细胞,通过生物学、化学或物理学的办法,使它们彼此融合在一起,产生出兼有两个亲本遗传性状的细胞,从而打破了远缘生物不能杂交的屏障,提供了创造新物种的可能。
它实质上是无性杂交,故又称其为体细胞杂交。
基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体;来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体。
同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并,称自发融合;异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合,称诱发融合。
1.细胞融合的细胞质膜结构基础
细胞膜主要由20%~70%的蛋白质和30~80%的脂类和约10%的碳水化合物组成。
质膜具有流动性,膜结构牛的蛋白质和脂类分子具有相对侧向流动性,亦略可横向倒翻、旋转或移位。
质膜具有镶嵌性,类脂双分子层镶嵌膜蛋白质。
两层脂分子以疏水性尾部相对,极性头部朝向水相。
膜蛋白分为分布在膜的内外表面的外在蛋白和不同程度地嵌入膜的类脂双分子层的内在蛋白两种类型。
外在蛋白处于水介质中,呈水溶性。
内在蛋白具有极性,多肽链的极性区突向膜表面,可与糖类结合成糖蛋白;非极性部分埋在双脂层内部,除去内在蛋白会引起膜结构的破坏。
质膜中的糖类主要是中性糖、氨基糖和氨基糖酸,这些糖类主要是以脂类和蛋白质相结合的形式存在,分布于质膜的外表面。
2.诱导融合因子
诱导融合因子一般分为三类:
病毒、化学试剂和物理作用。
(1)病毒:
仙台病毒又称副流感病毒I,易被灭活,对人类危害小,其融合细胞的能力取决于其蛋白质的被膜。
鸡新城疫病毒介导融合细胞效果很好。
DNA病毒、RNA致癌病毒都可作为融合因子。
(2)化学试剂:
Ca2+能诱导细胞融合,可能与影响质膜的稳定性有关;聚乙二醇(PEG)具有使植物细胞之间、动物细胞之间以及动植物细胞之间融合的通用性,其作用可能与细胞表面结构间形成离子键有关;NaN02,高Ca2+和高pH,聚乙酸乙烯脂,溶血卵磷脂等都可作为融合剂。
(3)物理作用:
包括离心、振荡和显流吸管操作及电脉冲融合技术。
电融合技术是在低压交流电场(100~200v/cm)中将悬浮细胞聚集成串状细胞群,由于膜组分间界面的相互作用、电位差或电场切线力的影响,膜表面颗粒移聚一处,在移开颗粒的区域暴露出脂质,加高压电脉冲(1~1.8KV/cm)将膜击穿,产生脂双层膜孔,引发细胞融合。
3.动物细胞融合的基本步骤
(1)亲本细胞的选择和制备细胞悬液
根据需要选定用于杂交的亲本细胞。
用于融合的细胞可直接取自于机体,也可以是体外单层或悬浮的细胞。
细胞悬液的制备可用酶法、机械法或二者兼用。
(2)诱导细胞融合
将亲本细胞悬液调到适合的细胞密度,按比例混合,进行诱导融合。
诱导融合因子常用仙台病毒(或鸡新城疫病毒),用前用紫外线或β用丙炔内酯破坏其遗传物质,使其失去感染性。
将需要融合的细胞和仙台病毒一同加入培养基中,混合培养,在仙台病毒的作用下,两种细胞便融合在一起,形成异核体。
异核体经过细胞分裂而产生2个杂种细胞(合核体)。
(3)筛选杂种细胞
仿照微生物学的选种原理,使亲本细胞具有可以互补的缺陷(突变),利用选择性培养基对突变体的选择作用,借此获得具有双亲遗传特性的杂种细胞。
如营养缺陷互补的两个突变体融合后可以在基本培养基上存活生长,而两个亲本细胞则不能存活。
(4)杂种细胞的增殖
筛选出杂交细胞后,根据实验目的进行杂种细胞的纯系培养扩增,以便于应用或遗传学研究。
4.植物细胞融合的基本步骤
(1)原生质体的制备
通常用酶解法处理植物组织,得到原生质体。
可以将果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶按一定比例配成混合液,一次性处理材料,制备原生质体;也可以先用果胶酶处理材料,得到分散的细胞,然后用纤维素酶处理,去掉细胞壁。
制得的原生质体要净化处理,去掉杂质。
(2)原生质体融合
将有活力的两亲本细胞原生质体悬浮液调到一定细胞密度,按比例混合培养;逐渐滴入高浓度的诱导剂,或用物理等方法进行诱导,促进异源原生质体融合。
诱导因子有NaNO3、聚乙二醇(PEG)、高Ca2+浓度高pH法和电脉冲融合技术。
原生质体融合产生的异核体通过同步有丝分裂形成杂合核原生质体。
(3)杂种细胞的筛选
将经过融合的细胞混合液移到特定的筛选培养基上生长,对杂种细胞进行筛选。
杂种细胞可依据遗传互补的原理,使亲本细胞具有可互补的缺陷,通过杂种细胞的基因互补而选择出来;也可用药物敏感差异进行选择;还可用低密度培养法,据杂种能形成细胞团的特性选择。
筛选出来的杂种细胞还需通过细胞学鉴定、生化分析和染色体分析确证。
(4)杂种细胞的分化
杂种细胞经培养可以形成愈伤组织,通过分化培养基的培养,诱导出根、茎、叶,最后可能分化形成体细胞杂种植株。
二、细胞拆合(核移植与细胞器移植)
所谓细胞拆合,就是把核与质分离开来,然后把不同来源的细胞质和细胞核相互配合,形成核质杂交细胞。
利用细胞拆合技术,可研究核酸的合成方式和基因表达受细胞质物质的影响及其机制。
细胞拆合一般指核移植与细胞器移植。
1.核移植
核移植就是将某一特定细胞的核转移和嵌入到另一细胞中的过程。
核移植方法有物理法和化学法两种。
(1)物理法(显微操作法):
在显微镜下用微玻璃针或微吸管将细胞核去掉,也可用短光波,如紫外线或激光把细胞核去掉,然后用微吸管移入其他细胞核。
(2)化学法(细胞松弛素B法):
细胞松弛素B有破坏微丝的作用。
用细胞松弛素B处理哺乳动物细胞,并结合离心技术,可将细胞拆分为外表包一层细胞膜和少量胞浆的核体(也称小细胞)和胞质体。
不同的小细胞和胞质体在仙台病毒或PEG的诱导下融合,形成重组细胞。
2.细胞器移植
细胞器中含有遗传物质,具有半自主的遗传体系。
细胞器移植(organelletransplantation)就是将一个细胞中的细胞器移人另一个细胞中去,借以改变细胞的某些遗传特性的方法。
细胞器移植包括叶绿体移植和线粒体移植。
将组织进行匀浆处理,破坏细胞结构,通过离心沉淀处理,从沉淀物中收集纯化叶绿体或线粒体。
通过显微微量注射或细胞器与原生质体混合培养,利用胞饮作用将异源细胞器移人原性质体内。
经过培养,可得到杂种细胞克隆,植物细胞可诱导形成杂种植株。
第二节染色体工程
染色体工程主要包括染色体的消除、添加与代换;染色体的分离、转移与合成;染色体片断移植与重组。
一、植物细胞的染色体工程
高等植物的染色体工程目前仅在六倍体普通小麦与其他种、属之间做过,主要是采用有性杂交的方法,获得一些非整倍体类型,如单体、缺体和三体。
还可用同种或异种染色体来替代某特定染色体,旨在把已知的具有抗病或其他有利性状的某一染色体来替代另一具有其他性状的染色体,以改良作物品种。
二、动物细胞的染色体工程
动物细胞的染色体工程又称为染色体转导或染色体介导的基因转移。
分为两种类型:
一是微细胞转移法。
用低浓度的秋水仙素长时间处理,可使细胞微核化,经去核处理,可得到只含几个或一个染色体的微细胞,通过细胞融合,将染色体导人完整细胞内,可望在异核体内表达。
二是脂质体转移法。
用秋水仙素抑制微管的合成与装配,使细胞阻抑于分裂中期,破碎细胞,再经离心处理,可得到大量的中期染色体,将染色体包裹在类脂囊中,利用PEG使之与受体细胞融合而实现染色体的转移。
第三节基因工程
基因工程技术诞生于20世纪70年代初,是一门崭新的生物技术科学,从诞生至今已经取得了十分辉煌的成就,成为当今生命科学研究领域中最具生命力和最引人注目的前沿学科之一。
基因工程(geneengineering)也称作基因操作(genemanipulation)或重组DNA技术(recombinationDNAtechnique),其主要原理是用人工的方法,把生物的遗传物质,通常是脱氧核糖核酸(DNA)分离出来,在体外进行基因切割、连接、重组、转移和表达的技术:
基因的转移已经不再限于同一类物种之间,动物、植物和微生物之间都可进行基因转移,改变宿主遗传特性,创造新品种(系)或新的生物材料。
基因工程与过去培育生物繁殖后代的传统做法完全不同,它很像技术科学的工程设计,即按照人类的需要把这种生物的这个“基因”与那种生物的那个“基因”重新“施工”,“组装”成新的基因组合,创造出新的生物。
一、基因工程的诞生
从20世纪40年代起,科学家们从理论和技术两方面为基因工程的产生奠定了坚实的基础。
①确定了各种生物遗传物质的统一性:
遗传物质都是核酸,碱基配对原则一致,遗传密码统一。
②60~70年代发现了工具酶(限制性内切酶,连接酶,末端转移酶等),并且利用这些酶完成了遗传物质的切割、连接。
③已经能够分离基因,以及人工合成基因,并且可以体外完成DNA重组。
④发现了基因载体。
⑤已经了解基因表达的控制机制。
具备了以上的理论与技术基础,基因工程诞生的条件已经成熟。
1972年,Berg等将两种不同来源的DNA片段成功地在体外重组成一个新的DNA分子,证明了完全可以在体外对基因进行操作,这标志着基因工程的诞生。
他作为“重组DNA技术之父”,于1980年获诺贝尔化学奖。
从此以后,基因工程作为一个新兴的研究领域得到了迅速的发展,无论是基础研究还是应用研究,均取得了喜人的成果。
二、基因工程的基本步骤
①目的基因的制备与获得;
②基因载体的选取与工具酶的准备;
③目的基因和载体的体外重组;
④DNA重组体导入受体细胞;
⑤受体细胞的繁殖扩增;
⑥重组体的筛选和鉴;
⑦目的基因的表达。
三、目的基因的获取
基因工程的原料就是目的基因。
所谓目的基因,就是指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或DNA片段,一般能编码某一产物或控制某一性状。
1.从生物基因组中分离基因
(1)鸟枪射击法(散弹射击法):
用一种或几种限制性内切酶把供体细胞的DNA分子切成碎片,使这些DNA片段与载体相结合,引人大肠杆菌中,得到基因文库。
使供体的DNA片段在大肠杆菌细胞内复制,得到许多拷贝。
对基因文库中的克隆细胞进行鉴定,挑选出含有目的基因的克隆即可分离出目的基因。
(2)离心沉降法:
根据不同的基因含G-C碱基对的比例不同,(如rDNA中G-C占45%~60%,而一般基因G-C比例为40%),用限制性核酸内切酶把供体细胞的DNA切成基因大小的片断,然后进行CsCl梯度密度超速离心,G-C含量高的DNA片段即被离心于CsCl密度较大的区域。
(3)DNA双链变性法(单链酶法):
G-C碱基对多的区段在受热变性时比A-T含量高的区段晚,通过选择性地变性,使A-T含量高的区段变性为单链,而G-C含量高的区段不变性,用核酸酶切去单链部分,剩下的即为G-C含量高的DNA片段。
(4)分子杂交法:
先提取出目的基因的mRNA,或用逆转录酶以mRNA为模板合成单链cDNA。
提取供体细胞的DNA,使之变性形成单链,然后固定于滤纸上。
将mRNA或cDNA与制成的单链DNA混合,根据互补原则,mRNA或cDNA就与目的基因的单链DNA配对形成杂种DNA双链。
若用放射性同位素标记mRNA或cDNA,则很易确定杂种分子的位置。
通过密度梯度离心,可分离出双链分子。
用核酶外切酶处理,得到含目的基因的双链分子。
把分离出的双链分子变性,可得到没有放射性标记的单链DNA,人工复制后得到目的基因。
(5)逆转录酶合成法:
提取细胞中的mRNA,在体外逆转录酶酶促合成cDNA。
用单链cDNA酶促合成双链cDNA。
双链cDNA经修饰加工,加上目的基因表达所必需的启动子、操纵基因、内含子、转录终止区等结构,最终合成目的基因。
(6)生物学方法:
用温和噬菌体或病毒提取目的基因。
病毒结合到宿主(供体)的染色体上之后,受到外界条件影响从重组体上脱落下来时,可携带部分宿主的DNA片段,由此可以分离出目的基因。
2.化学合成法
化学合成法制备目的基因是用单核苷酸和寡核苷酸一个一个地或一个片段一个片段地缩合制备目的基因的方法。
采用纯化学方法合成,反应专一性不强,副反应多,合成片段越长,分离纯化越困难,产率越低。
采用化学合成与酶促合成相结合的方法,先化学合成10~15个核苷酸片段,使双链片段具有粘性末端,再用DNA连接酶连接两个片段,直至合成完整的基因。
四、载体
载体是DNA片段的“运载工具”,在基因工程中占有十分重要的地位。
目的基因能否有效转入受体细胞,并在其中维持和高效表达,在很大程度上取决于克隆载体。
1.理想载体的条件
①本身是一个复制子,在宿主细胞内能自我复制。
②分子量小,有许多限制性内切酶的切点,具有能使外源DNA片段插入的克隆位点。
对于每个限制酶,最好酶切后并不损坏载体的复制能力、作为选择标记的基因及多拷贝型。
③具有选择标记,以便筛选承载外源DNA的受体细胞,如抗性基因。
④能携带适当大小的DNA,并能自由进出其宿主细胞,并在宿主细胞内稳定地保存。
目前原核受体细胞的载体主要有细菌质粒(松弛型)和λ噬菌体两类。
真核细胞受体的载体主要有SV40病毒(用于动物转化)和Ti质粒(用于植物转化)。
2.应用载体
大肠杆菌载体:
质粒,包括天然质粒如PSCl0l,和改良质粒,如PBR322;λ噬菌体;M1噬菌体;科斯质粒。
酵母载体:
酵母整合质粒YIP,酵母复制子质粒YRP和酵母附加体质粒YEP。
植物基因载体:
花椰菜斑纹病毒DNA和Ti质粒DNA。
动物基因载体:
SV40病毒。
五、工具酶
1.限制性核酸内切酶
限制性内切酶(restrictionendonuclease)是基因工程中的“剪刀”,是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列,并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶,切断的双链DNA都产生5磷酸基和3'羟基末端,它们不同于一般的脱氧核糖核酸酶(DNase),切点大多很严格,要求专一的核苷酸顺序,即识别序列。
难以深入研究的DNA大分子,借此可以切割成特定的小片段来分析。
限制性核酸酶的发现,为基因结构、DNA碱基顺序分析和基因工程的研究开辟了新途径。
根据酶的性质,限制酶可分为三种类型。
如表16-1。
表16-1三种限制性内切酶的特性
限制酶的类型
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
DNA底物
双链DNA
双链DNA
双链DNA
辅助因子
Mg2+,ATP,SAM
Mg2+
Mg2+,ATP
识别顺序
特异
特异
特异
切割位点
非特定(于识别顺序前后100~1000bp范围内)
特定(于识别顺序之中或近处)
特定(于识别顺序之后的25~27bp位置上)
与甲基化作用的关系
限制酶酶蛋白同时具有
甲基化酶作用
酶蛋白不具有甲基化作用
酶蛋白同时具有甲基化酶作用
SAM:
腺苷酰甲硫酸
在基因工程中具有实用价值的是Ⅱ型限制酶,其识别顺序为4~6个核苷酸。
多数Ⅱ型酶的识别序列为具有双轴对称的回文顺序,酶切后产生粘性末端或平整末端。
2.DNA连接酶
DNA连接酶能够封闭5'-磷酸基和3'-OH基的缺口。
基因工程常用T4-DNA连接酶,它能连接粘性末端,也能连接乎整末端。
3.DNA多聚酶I
为一个多功能酶,全酶具有5种活性:
其一,通过核苷酸聚合作用使DNA沿5'→3'方向延长;其二,循3'→5'方向由3'-OH端水解DNA链,表现3'→5'核酸外切酶活性;其三,从5'端降解双链DNA的一条链,释放单或寡核苷酸,主要功能是除去酶前的先导链,使该部分由与模板严格互补的新合成链所替代,故有切补修复的功能;其四,具有焦磷酸解活性,即在焦磷酸过量时,由3'端使DNA链降解;其五,无机焦磷酸基与脱氧核苷三磷酸的焦磷酸基交换。
该酶主要用于合成ds-cDNA缺口转译标记DNA以及DNA顺序分析。
4.末端转移酶(末端脱氧核苷酸转移酶)
可以催化脱氧核苷酸添加到DNA分子的3'-OH末端上,而不需要模板,若所用的底物是一种脱氧核苷,则形成同聚尾。
5.逆转录酶
可以以RNA为模板反向转录形成互补DNA(cDNA)。
六、DNA分子的体外重组
DNA的体外重组就是用人工方法,使目的基因与载体相结合。
在DNA体外重组前,先将DNA分子用限制性内切酶处理,从而产生互补粘性末端或平末端,然后在连接酶的作用下,将其连接在一起,形成重组DNA分子。
1.粘性末端连接
使两种DNA分子具有粘性末端,以碱基互补配对使两种DNA分子相接,DNA连接酶封口。
若粘性末端相同,会出现DNA分子的自我环化。
用不同限制酶酶切产生异源端等方法可以防止线性分子的自我环化。
2.平整末端的连接
可以用T4-DNA连接酶连接;用末端转移酶在3'端加均聚核酸,使载体的末端均聚核苷酸尾与外源DNA的均聚核苷酸尾的碱基可互补配对,再行粘性相接;用T4-DNA连接酶在平整末端上接带某种限制酶切点的接头,然后用该酶酶解得到粘性末端再重组相接。
七、重组DNA分子引入受体细胞
1.转化
用质粒作载体将外源DNA分子引入到受体细胞。
2.转染
用病毒或噬菌体作载体将外源DNA引入到受体细胞,所用的病毒或噬菌体无蛋白质的外壳。
转染是转化的一种特殊形式,转化成功的关键是使受体细胞处于感受态。
3.转导
用噬菌体作载体,在离体条件下给重组DNA包上外壳。
4.注射
细胞较大的动植物细胞可用微注射法把重组DNA分子导人。
5.基因枪
使目的基因(液)形成高速喷射流,直接进入受体细胞或受体细胞核内。
八、重组DNA分子的选择(克隆基因的鉴定与分离)
1.遗传标记选择法
利用克隆载体本身所具有的遗传标记(如抗药性标记或营养标记)检出接收了带有目的基因的重组DNA的受体细胞。
2.原位分子杂交法
用放射性同位素标记RNA或DNA探针,根据碱基配对原则,检测导入受体细胞中的异源DNA片断。
把要筛选的菌落影印到铺放在琼脂平板表面的硝酸纤维素滤膜上,培养,长出菌落后取出硝酸纤维素滤膜,用碱液处理,使DNA变性,80℃烘干,用同位素标记的探针与之杂交,用放射自显影获得曝光胶片,由此找到含有目的基因的菌落。
3.免疫法
用某种有效的特异性抗体,直接检测重组克隆表达的多肽产物来鉴定菌落。
九、重组DNA分子的表达
作为现代遗传工程的关键技术,基因工程的目的是外源重组DNA分子的稳定高效表达。
促进重组DNA表达通常采取以下措施:
其一是增加基因的拷贝数。
通过采用多拷贝的质粒或病毒,使重组DNA在受体细胞内有较多的拷贝数。
其二是选择合适的外源基因插入位置。
在形成重组DNA分子时,在载体的启动基因和核糖体结合顺序的后面的适当位置上连接外源基因;也可将外源基因插人到载体的结构基因中的适当位置上,将转录翻译的结果——融合蛋白提纯、分离后,可得到所需要的蛋白质。
习题
一、问答题
1.植物细胞融合一般有四个基本环节,试说明每一环节中的主要工作内容。
2.简述叶
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