覆盆子鉴别与含量测定方法学确认方案.docx

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覆盆子鉴别与含量测定方法学确认方案

覆盆子鉴别与含量测定

方法学确认方案

文件审批

部门

姓名

签名

日期

起草人

质量部

XXX

年月日

审核人

质量部

XXX

年月日

批准人

质量部

XXX

年月日

1、目的

本试验对覆盆子鉴别与含量测定检验方法进行确认，为了确保检验数据的科学性、准确性和可靠性，制定本确认方案，以确定建立的鉴别与含量测定检验方法能够对该产品进行准确的检验，为我司化验室以后的覆盆子检验方法提供依据。

2、范围

本方案适用于我公司覆盆子鉴别与含量测定检验方法的确认。

3、职责

职务

岗位

姓名

职责

组长

质量部部长

XXX

1.确认方案及报告的审核；确保方案及报告内容符合GMP及检测要求。

2.组织实施确认工作，确保确认工作严格按照方案实施；

3.确认过程中偏差和变更的审核，组织确认过程中发生的偏差的调查；

小组成员

QC主任

XXX

负责确认方案及确认报告的起草，确认实施记录的审核

QC

XXX

按照确认方案进行确认工作，填写记录，并判定是否符合认可标准要求

4、确认依据文件

《中国药典》2015年版

5、确认程序

5.1先决条件的确认

5.1.1仪器经过校准确认

所需仪器经过校准并在有效期内，确认记录见附表01。

5.1.2.人员培训确认

确认小组人员参加了本方案的培训，以及仪器的操作、维护和保养培训、偏差处理、变更控制等SOP的培训，确认记录见附表02。

5.1.3相关SOP的确认

制定仪器操作、校验、维护和保养标准程序并批准，确认记录见附表03。

5.1.4药品的确认

确认方案确认过程中使用的药品符合规定，并在有效期内。

确认记录见附表04。

5.2鉴别方法学确认

专属性：

供试品溶液制备取山柰酸-3-O-芸香糖苷含量测定项下供试品溶液，即得。

对照品溶液制备取椴树苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。

阴性溶液制备照供试品溶液制备方法除取样品外，同法制成阴性溶液。

测定照《薄层色谱法标准操作规程》试验，吸取上述供试品溶液与阴性溶液各5μl，及对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸（90∶4∶4∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝溶液，在105℃加热5分钟，在紫外光灯（365nm）下检视。

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性液在相应位置上不显斑点（见薄层色谱图05-1）。

确认记录见附表05。

5.3含量测定方法学确认

5.3.1鞣花酸含量测定

5.3.1.1检查方法：

照《高效液相色谱法标准操作规程》测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.2%磷酸溶液（15∶85）为流动相；检测波长为254nm。

理论板数按鞣花酸峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备　取鞣花酸对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1ml含5μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品粉末（过四号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置5ml量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品按干燥品计算，含鞣花酸（C14H6O8）不得少于0.20%。

5.3.1.2系统适用性确认

5.3.1.2.1色谱条件

高效液相色谱仪

XXXXX

色谱柱

AglilentTC-C18

（2）250*4.6mm5um

流速

1.0ml/min

检测波长

254nm，UV检测器

柱温

25℃

进样量

10μl

运行时间

30min

5.3.1.2.2溶液配制

名称

配制方法

流动相

分别量取乙腈（色谱纯）与超纯水，以乙腈-0.2%磷酸溶液（15∶85）的比例混合，用0.45µm水系微孔滤膜滤过，超声脱气10min，即得。

必要时可根据实际使用情况调整配制溶液的体积。

空白溶剂

样品处理用70%甲醇溶液。

对照品溶液

取鞣花酸对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1ml含5μg的溶液，即得。

平行制备2份，分别为对照品溶液1、2。

供试品溶液

取本品粉末（过四号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置5ml量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

平行制备2份，分别为供试品溶液1、2。

5.3.1.2.3试验操作

待仪器稳定后，按下列进样序列注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以鞣花酸峰面积计算5针对照品溶液1的RSD；按外标法以对照品溶液1的鞣花酸峰面积计算对照品溶液2的回收率。

序号

样品名称

进样体积（ul）

进样针数

1

空白溶剂

5

1

2

对照品溶液1

5

5

3

对照品溶液2

5

2

5.3.1.2.4系统适用性回收率

按以下公式计算对照品溶液2的回收率：

式中：

AR1、AR21、AR22：

分别为对照品溶液1连续5针的平均峰面积和对照品溶液2第一针和第二针的峰面积；

MR1、MR2：

分别为对照品1、2的称样量；

CR1和CR2：

分别为对照品1、2中鞣花酸的含量；

RcR21和RcR22：

分别为对照品溶液2第1针和第2针的回收率；

5.3.1.2.5可接受标准

5针对照品溶液1鞣花酸主峰的保留时间的RSD均不大于2.0%，鞣花酸主峰面积的RSD均应不大于1.0%；对照品溶液2的回收率应在98.0%～102.0%。

理论板数按鞣花酸峰计算应不低于3000。

注：

若系统适用性不符合标准应立即停止进样，排查原因后再重做系统适用性，系统适用性合格后方可进行如下试验。

确认记录见附表06。

5.3.1.3含量测定

5.3.1.3.1操作

系统适用性合格后，接着系统适用性进样序列取供试品溶液1、2，用0.45um（尼龙66）一次性针式过滤头弃去5ml后取续滤液，进样，进样序列如下（序号4、5、6）：

序号

样品名称

进样体积（ul）

进样针数

1

空白溶剂

5

1

2

对照品溶液1

5

5

3

对照品溶液2

5

2

4

供试品溶液1

5

2

5

供试品溶液2

5

2

6

对照品溶液1

5

2

注：

在对照品溶液1运行完成后一般间隔10针（以时间最短的计）后，应重新插入2针对照品溶液1，作为系统跟踪，以此来评价系统稳定性。

5.3.1.3.2计算

综合前面5针对照品溶液1和后面2针对照品溶液1计算鞣花酸峰面积的RSD，当RSD不大于2.0%时，按以下公式计算覆盆子的含量：

注：

综合供试品溶液的前面5针对照品溶液1和后面2针对照品溶液1计算鞣花酸峰面积的RSD不符合规定时，应排查原因后，再按5.3.1.2项重新测定。

5.3.1.3.3可接受标准：

按干燥品计算，含鞣花酸（C14H6O8）不得少于0.20%。

确认记录见附表06。

5.3.2山柰酸-3-O-芸香糖苷含量测定

5.3.2.1检查方法：

照《高效液相色谱法标准操作规程》测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.2%磷酸溶液（15∶85）为流动相；检测波长为344nm。

理论板数按山柰酸-3-O-芸香糖苷峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备　取山柰酸-3-O-芸香糖苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇分别制成每1ml含80μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品粉末（过四号筛）约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50ml，称定重量，加热回流提取1小时，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣加水20ml使溶解，用石油醚振摇提取3次，每次20ml，弃去石油醚液，再用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品按干燥品计算，含山柰酸-3-O-芸香糖苷（C27H30O15）不得少于0.03%。

5.3.2.2系统适用性确认

5.3.2.2.1色谱条件

高效液相色谱仪

XXX

色谱柱

AglilentTC-C18

（2）250*4.6mm5um

流速

1.0ml/min

检测波长

344nm，UV检测器

柱温

25℃

进样量

10μl

运行时间

35min

5.3.2.2.2溶液配制

名称

配制方法

流动相

分别量取乙腈（色谱纯）与超纯水，以乙腈-0.2%磷酸溶液（15∶85）的比例混合，用0.45µm水系微孔滤膜滤过，超声脱气10min，即得。

必要时可根据实际使用情况调整配制溶液的体积。

空白溶剂

样品处理用70%甲醇溶液。

对照品溶液

取山柰酸-3-O-芸香糖苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇分别制成每1ml含80μg的溶液，即得。

平行制备2份，分别为对照品溶液1、2。

供试品溶液

取本品粉末（过四号筛）约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50ml，称定重量，加热回流提取1小时，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣加水20ml使溶解，用石油醚振摇提取3次，每次20ml，弃去石油醚液，再用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

平行制备2份，分别为供试品溶液1、2。

5.3.2.2.3试验操作

待仪器稳定后，按下列进样序列注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以山柰酸-3-O-芸香糖苷峰面积计算5针对照品溶液1的RSD；按外标法以对照品溶液1的山柰酸-3-O-芸香糖苷峰面积计算对照品溶液2的回收率。

序号

样品名称

进样体积（ul）

进样针数

1

空白溶剂

5

1

2

对照品溶液1

5

5

3

对照品溶液2

5

2

5.3.2.2.4系统适用性回收率

按以下公式计算对照品溶液2的回收率：

式中：

AR1、AR21、AR22：

分别为对照品溶液1连续5针的平均峰面积和对照品溶液2第一针和第二针的峰面积；

MR1、MR2：

分别为对照品1、2的称样量；

CR1和CR2：

分别为对照品1、2中山柰酸-3-O-芸香糖苷的含量；

RcR21和RcR22：

分别为对照品溶液2第1针和第2针的回收率；

5.3.2.2.5可接受标准

5针对照品溶液1山柰酸-3-O-芸香糖苷主峰的保留时间的RSD均不大于2.0%，山柰酸-3-O-芸香糖苷主峰面积的RSD均应不大于1.0%；对照品溶液2的回收率应在98.0%～102.0%。

理论板数按山柰酸-3-O-芸香糖苷峰计算应不低于3000。

注：

若系统适用性不符合标准应立即停止进样，排查原因后再重做系统适用性，系统适用性合格后方可进行如下试验。

确认记录见附表07。

5.3.2.3含量测定

5.3.2.3.1操作

系统适用性合格后，接着系统适用性进样序列取供试品溶液1、2，用0.45um（尼龙66）一次性针式过滤头弃去5ml后取续滤液，进样，进样序列如下（序号4、5、6）：

序号

样品名称

进样体积（ul）

进样针数

1

空白溶剂

5

1

2

对照品溶液1

5

5

3

对照品溶液2

5

2

4

供试品溶液1

5

2

5

供试品溶液2

5

2

6

对照品溶液1

5

2

注：

在对照品溶液1运行完成后一般间隔10针（以时间最短的计）后，应重新插入2针对照品溶液1，作为系统跟踪，以此来评价系统稳定性。

5.3.2.3.2计算

综合前面5针对照品溶液1和后面2针对照品溶液1计算山柰酸-3-O-芸香糖苷峰面积的RSD，当RSD不大于2.0%时，按以下公式计算覆盆子的含量：

注：

综合供试品溶液的前面5针对照品溶液1和后面2针对照品溶液1计算山柰酸-3-O-芸香糖苷峰面积的RSD不符合规定时，应排查原因后，再按5.3.2.2项重新测定。

5.3.2.3.3可接受标准：

按干燥品计算，含山柰酸-3-O-芸香糖苷（C27H30O15）不得少于0.03%。

确认记录见附表07。

6、偏差处理

在确认过程中，应严格按照确认方案进行操作和判定，出现个别指标不符合标准的结果时，针对不合格指标应展开调查分析，对于确认是因操作不当等自身原因造成，应重新进行测试。

确认过程中所产生的偏差记录在附表08中。

7、变更控制

涉及到方案变更时，填写“变更申请表”，需要对其进行原因分析，根据分析结果决定是否需要重新制定确认方案还是修改可接受标准，并将涉及到的变更情况记录在附表09中。

8、附表清单

编号

附表名称

编号

附表名称

01

仪器校验确认记录表

06

鞣花酸含量测定方法确认记录表

02

人员培训确认记录表

07

山柰酸-3-O-芸香糖苷含量测定方法确认记录表

03

相关SOP确认记录表

08

偏差处理确认记录

04

药品确认记录

09

变更控制确认记录

05

鉴别方法确认记录表

9、变更记录

版本号

批准日期

变更描述

00

/

新文件。

附表01：

仪器校验确认记录表

仪器校验确认

仪器名称

型号

检定有效期至

检定证书编号

符合要求

电子天平

XXX

□是□否

XXX

□是□否

高效液相色谱仪

XXX

□是□否

玻璃仪器校验确认

玻璃仪器名称

规程

编号

校正日期

符合要求

容量瓶

10ml

□是□否

25ml

□是□否

50ml

□是□否

100ml

□是□否

移液管

□是□否

□是□否

10ml

□是□否

50ml

□是□否

是否存在偏差或不一致项：

□是偏差或不一致记录在偏差报告中，偏差编号：

。

□否

结论：

所有仪器均经校验且在有效期内。

检查人/日期

复核人/日期

附表02：

人员培训确认记录表

培训记录

覆盆子鉴别与含量测定方法学确认方案

XXX电子天平标准操作与维护规程

XXX型高效液相色谱仪标准操作与维护规程

偏差处理标准管理规程

变更控制标准管理规程

培训时间

培训地点

课时

讲师

姓名

是否已接受培训（是用“√”表示，否用“×”表示）

是否存在偏差或不一致项：

□是偏差或不一致记录在偏差报告中，偏差编号：

。

□否

结论：

执行本方案的人员已得到必要的培训。

检查人/日期

复核人/日期

附表03：

相关SOP确认记录表

SOP名称

检查标准

检查结果

XXX电子天平标准操作与维护规程

已批准生效

□是□否

XXX型高效液相色谱仪标准操作与维护规程

已批准生效

□是□否

偏差处理标准管理规程

已批准生效

□是□否

变更控制标准管理规程

已批准生效

□是□否

是否存在偏差或不一致项：

□是偏差或不一致记录在偏差报告中，偏差编号：

。

□否

结论：

相关SOP均已批准生效。

检查人/日期

复核人/日期

附表04:

药品确认记录

名称

批号

来源

符合要求

覆盆子

留样室

□是□否

椴树苷对照品

中国食品药品检定研究院

□是□否

鞣花酸对照品

中国食品药品检定研究院

□是□否

山柰酸-3-O-芸香糖苷对照品

中国食品药品检定研究院

□是□否

是否存在偏差或不一致项：

□是偏差或不一致记录在偏差报告中，偏差编号：

。

□否

结论：

样品、对照品符合要求。

检查人/日期

复核人/日期

附表05:

鉴别方法确认记录

人员

项目

薄层板

点样方式

温度

湿度

图谱

判定标准

结果符合要求

专属性

市售

手动

见05-1

供试品与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；阴性液不显斑点。

□是

□否

是否存在偏差或不一致项：

□是偏差或不一致记录在偏差报告中，偏差编号：

。

□否

结论：

椴树苷鉴别分析方法已确认符合规定。

检查人/日期

复核人/日期

附表06:

鞣花酸含量测定方法确认记录

色谱柱

柱温

检测器

波长

流动相

进样量

系统适用性确认

项目

理论板数

对照品1

对照品2

供试品1

供试品2

鞣花酸

可接受标准

按鞣花酸峰计算应不低于3000

是否符合规定

□是□否

□是□否

项目

分离度

对照品1

对照品2

供试品1

供试品2

鞣花酸

可接受标准

与相邻色谱峰之间的分离度应大于1.5

是否符合规定

□是□否

□是□否

项目

重复性

对照品1RSD值

对照品2回收率

鞣花酸

可接受标准

5针峰面积的相对标准偏差（RSD值）应不大于2.0%；对照品溶液2的回收率应在98.0%～102.0%

是否符合规定

□是□否

□是□否

项目

保留时间

空白溶剂

对照品溶液

供试品溶液

鞣花酸

可接受标准

空白溶剂在相应保留时间处没有峰；供试品与对照品在相应保留时间处出现峰。

是否符合规定

□是□否

□是□否

含量测定确认

项目

平均峰面积

对照品1

对照品2

供试品1

供试品2

鞣花酸

含量测定结果

供试品1

供试品2

平均值

可接受标准：

按干燥品计算，含鞣花酸（C14H6O8）不得少于0.20%。

是否符合规定

□是□否

是否存在偏差或不一致项：

□是偏差或不一致记录在偏差报告中，偏差编号：

。

□否

结论：

覆盆子的鞣花酸含量测定分析方法已确认符合规定。

检查人/日期

复核人/日期

附表07：

山柰酸-3-O-芸香糖苷含量测定方法确认记录

色谱柱

柱温

检测器

波长

流动相

进样量

系统适用性确认

项目

理论板数

对照品1

对照品2

供试品1

供试品2

山柰酸-3-O-芸香糖苷

可接受标准

按山柰酸-3-O-芸香糖苷峰计算应不低于3000

是否符合规定

□是□否

□是□否

项目

分离度

对照品1

对照品2

供试品1

供试品2

山柰酸-3-O-芸香糖苷

可接受标准

与相邻色谱峰之间的分离度应大于1.5

是否符合规定

□是□否

□是□否

项目

重复性

对照品1RSD值

对照品2回收率

山柰酸-3-O-芸香糖苷

可接受标准

5针峰面积的相对标准偏差（RSD值）应不大于2.0%；对照品溶液2的回收率应在98.0%～102.0%

是否符合规定

□是□否

□是□否

项目

保留时间

空白溶剂

对照品溶液

供试品溶液

山柰酸-3-O-芸香糖苷

可接受标准

空白溶剂在相应保留时间处没有峰；供试品与对照品在相应保留时间处出现峰。

是否符合规定

□是□否

□是□否

含量测定确认

项目

平均峰面积

对照品1

对照品2

供试品1

供试品2

山柰酸-3-O-芸香糖苷

含量测定结果

供试品1

供试品2

平均值

可接受标准：

按干燥品计算，含山柰酸-3-O-芸香糖苷（C27H30O15）不得少于0.03%。

是否符合规定

□是□否

是否存在偏差或不一致项：

□是偏差或不一致记录在偏差报告中，偏差编号：

。

□否

结论：

覆盆子的山柰酸-3-O-芸香糖苷含量测定分析方法已确认符合规定。

检查人/日期

复核人/日期

附表08：

偏差处理确认记录

偏差处理单号

发生日期

记录标题

偏差解决日期

处理结果

符合要求

□是□否

□是□否

□是□否

□是□否

检查人/日期

复核人/日期

附表09：

变更控制确认记录

变更号

日期

变更描述

批准日期

处理结果

符合要求

□是□否

□是□否

□是□否

□是□否

□是□否

□是□否

□是□否

检查人/日期

复核人/日期