医学微生物学试验指导.docx
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医学微生物学试验指导
医学微生物学实验指导
细菌学总论
实验一微生物学实验室常用仪器
熟悉微生物学实验室环境及常用设备,并通过实物概括介绍主要设备的用途、工作原理及使用时注意事项。
内容:
一、显微镜
二、普通电冰箱
三、水浴箱
四、恒温培养箱
五、高压灭菌器
一、显微镜
显微镜是一种贵重仪器。
根据实验目的要求不同,可分别选用普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。
普通光学显微镜进行细菌形态学检查,普通光学显微镜最为常用。
是根据光学透镜成像的原理制成,能将物体放大1600倍。
用自然光或灯光为光源,其波长约为0.4μm,在最佳条件下显微镜的分辨率为波长的一半,即0.2μm,而肉眼能看到的最小形象为2mm,故在普通光学显微镜下用油镜放大1000倍,可将0.2μm的微粒放大成0.2mm,能为人肉眼所见。
一般细菌都大于0.2μm,在普通光学显微镜下都能看到。
暗视野显微镜细菌形体微小半透明,未经染色时与周围对比不明显,在普通光学显微镜下不易看清,如换装上暗视野集光器,此集光器中央不透光,光线只能从周边斜射出来,故背景视野黑暗无光,但斜射到菌体上的光线由于散射作用而进人物镜,到达观察者之眼,因而在黑暗的视野中可看到明亮的被检物体。
用暗视野显微镜检查也叫暗现野照明法,这种方法是利用被检物体表面的反射光线和衍射光线观察物体的,所以只能看到物体的存在和运动,不能认清其构造。
在暗视野照明下,虽看不清结构,但可以分辨0.004μm以上的微粒子的存在。
暗视野照明法多用于活细菌和螺旋体不染色标本的检查。
荧光显微镜是以紫外光或蓝紫光为光源,使经荧光素染色的被检标本激发出波长较长的可见光—荧光,在暗视野中显现出荧光闪烁的被检物体,清晰可见,因紫外光或蓝紫光的波长较短(约为0.2μm)其分辨率得到进一步提高。
荧光显微镜与普通光学显微镜不同之处有以下三个方面:
(1)光源,荧光显微镜通常采用功率为156—200W的高压汞灯为光源,它能发射丰富的紫外光和蓝紫光。
(2)滤光片:
包括激发滤片和吸收滤片,能产生4950A的蓝紫光。
(3)暗视野集光器:
由于背景暗反差大,观察荧光清晰,对放大倍数高荧光弱的标本也能进行观察。
相差显微镜人的肉眼,只在光波的波长(颜色)和振幅(亮度)有变化时才能看到被检物体。
因活的生物体多为无色透明,光波通过时,波长和振幅均不发生变化,故普通显微镜检查很难观察清楚;用暗视野检查也只能看到发光的菌体外形,看不清内部结构。
相差显微镜能弥补这两种方法的不足。
其原理是利用被检物体的光程(折射率与厚度的乘积)之差进行镜检。
如被检物体与媒质之间,或被检物体各部分的折射率或厚度不同,或双方都不同,光线通过时引起光相的差异;相差显微镜通过相差板的光栅作用,改变了直接光的光相和振幅,将光相的差异转换成光的强弱的差异使细胞某些结构比其它部分深暗,衬托出鲜明的对此。
因此,这种方法不仅不需要标本的染色,还能充分利用物镜的镜口率,是做活体标本检查最好的方法。
电子显微镜电子显微镜与光学显微镜不同,电镜是利用电子流代替光线,用电子源代替光源,用磁性线圈代替放大透镜,即电子流为电子透镜所折射,经过两次放大造成最后的像。
电子流波长极短,约为0.05nm,故其放大倍数极高,电镜观察的形象可以投射在荧光屏上显示,也可照相拍摄,还可明磷钨酸负染色,或金属喷涂投影,增加对比度,使图象更具立体感。
电镜的电子速度越快,即电压越高,分辨率越小。
如在电子流的通路上有游离气体分子,就好象光镜上有尘埃一样,与电子碰撞使其改变通路引起象的散乱,因之,镜筒要保持干燥真空状态。
故电镜不能观察活的微生物。
二、普通电冰箱
普通电冰箱是实验室最常用的仪器之一,在微生物学实验室中,是用来保存培养基,菌(毒)种、血清以及检验标本等的一种制冷设备。
使用电冰箱时应注意
1、电冰箱应放通风处,不受日光照射,远离热源(电炉、暖气等),以免影响散热,冰箱背面远离墙10cm以上,使空气畅通利于散热。
2、应尽量减少开门次数,箱内物品间应留有空隙,需冰冻保存应置于冰盒内。
3、热物品应冷至室温温度,再放入箱内。
4、蒸发器上结霜不宜过厚,冰霜过厚应及时化霜,以免影响热的传导。
5、电冰箱应保持内外整洁。
三、水浴箱
水浴箱也称水温箱,系由金属制成的长方形箱,箱内盛水,箱底装有电热丝,由自动调节温度装置控制。
有37℃和59℃两种恒温水箱,箱盖均呈斜面,使水蒸气凝结水沿边而下,以免水滴落入箱内标本中。
水浴箱通过电炉丝加温,由自动恒温器自动控制,使水浴恒定在实验所需的温度上,为血清学试验常用的设备。
四、恒温培养箱
简称温箱,又名孵育箱,为培养微生物的主要设备,目前常用的为电热式温箱,箱体为双层铁扳中夹石棉,前面有圾璃门(内层)和铁门(外层),箱内有数层隔网,箱顶装有温度计,箱壁装有温度调节箱,箱底夹层中安装有电炉丝串连成电热箱,接通电源,发热器产热,借助温度调节器的自动调节维持箱内的恒定温度。
五、高压灭菌器
高压灭菌器也叫高压消毒锅,是应用最广、效果最好的灭菌器,可用于不怕高温破坏的培养基、生理盐水、废弃的培养物以及手术器械、手术敷料、手术衣等的消毒灭菌,高压灭菌器有手提式、直立式及卧式等多种,但其结构与灭菌原理基本相同,以手提式高压灭菌器为例,简介如下:
手提式高压灭菌器为一种携带方便的小型灭菌器。
其结构为一金属厚壁圆筒,上方有一金属厚盖,盖周围装有螺旋,借以紧闭锅盖,使蒸汽不至外溢,盖上装有压力表、安全活塞及排气门,锅内有一托架。
使用时锅内加入蒸馏水,放入要灭菌物,加盖紧闭,然后加温至5磅,打开排气门放出冷气,关好气门继续加温至气表指针指15磅温度为121.3℃时,维持15分钟,缓缓放出蒸汽,即达灭菌目的。
灭菌时应注意:
(1)锅内装物品不应过紧;
(2)注意排出冷气,否则气压表虽已达15磅,温度达不到121.3℃,不能保证灭菌效果;(3)灭菌后排气时不能过急,以免容器中液体外溢或引起破裂;(4)不耐高热高压之物品,不能用此法灭菌。
实验二显微镜油镜使用法
观察细菌形态,需要放大,过去的实验课观察标本时,多用低倍镜、高倍镜放大。
观察细菌标本时,必须用放大倍数更高的油镜才能清楚地看到细菌形态特点。
因之微生物学实验主要使用油镜。
油镜的特点是前透镜很小,油镜头的标记也因厂牌不同而异,一般多刻有放大率如(90×,100×)、镜口率(N.A=l.25或1.30)、Oil,国产镜头刻“油”字等。
内容:
油镜的标记,油镜的使用法
油镜用油的原理,油镜的保护
一、实验目的与原理
熟练地掌握显微镜油镜的使用和维护方法。
油镜可以使标本放大1000—2500倍,研究细菌形态必须用油镜。
油镜观察时,在标本与镜头之间必须滴加镜油,否则视野不清。
原因是油镜前透镜很小,光线通过玻片标本后在空气中发生折射,进入镜头的光线少,致使视野暗物象不清。
如在标本与镜头间加一滴(切勿散开)与玻片折光率(N=l.52)相近的香柏油(N=l.515)则进入镜头的光线增多,视野明亮物象清晰(图1),滴油又能增加油镜孔径数值,提高显微镜的分辩率等。
图1油镜加香柏油的原理
二、实验材料
普通光学显微镜(以下简称显微镜)
镜油(香柏油)
擦镜纸
被检细菌标本片
三、实验方法
(一)对光:
将标本(涂面向上!
)置于载物台上,勿将镜台倾斜,以免液体标本和镜油流出。
用低倍镜对光,左眼通过目镜观察,用手调节反光镜(天然光源用平面镜,人工光源或光源弱的地方用凹面反光镜),使视野光亮均匀。
检查染色标本用强光(将集光器升到最上,光圈完全打开),检查不染色的活体标本则宜用弱光(集光适当下降,光圈适当缩小)。
(二)调节焦距:
1、于标本上滴加镜油一滴(不要多加!
使呈滴状切勿散开),然后用眼从侧面观察,转动粗螺旋,使载物台缓缓上升(或油镜头缓缓下降),至油镜浸入油中接近玻片为止(注意调节粗螺旋时不要用力过猛、过急、以免损坏镜头或压坏标本。
)
2、左眼通过目镜观察,同时再缓缓转动粗螺旋下降载物台或上升油镜头,当见到模糊图象时,转动细螺旋,上下调节即可见到清晰的物象。
然后一边移动标本片,一边观察,寻找理想的视野仔细观察。
观察标本时,两眼宜同时睁开。
减少眼睛疲劳。
最好用左眼观察,右眼配合绘图和记录。
(三)显微镜油镜的保护
1、关于显微镜的一般保护法不再重述。
2、油镜用毕,先将油浸镜上提,取下标本片,然后以擦镜纸拭去香柏油,(不许用手、布或其它纸张擦拭。
)如油己干可用擦镜纸沾少量二甲苯擦净,并立即擦去二甲苯。
因透镜片是用胶纸粘固的,二甲苯能溶解胶质,日久镜片将移位或脱落。
实验三 细菌的形态观察
内容:
一、细菌的基本形态;球菌、杆菌、弧菌
二、细菌的特殊结构:
荚膜、鞭毛、芽胞
一、实验目的与原理
认识与记忆细菌的基本形态及特殊结构特点。
各种细菌在一定条件下,均维持一定的形态和结构。
细菌的形态与结构是鉴别细菌种类的根据之一,细菌结构又与其致病性强弱,免疫发生机理均有一定关系。
二、实验材料
1、显微镜
2、观察标本
(1)球菌、葡萄球菌、链球菌涂片标本
(2)杆菌:
大肠杆菌、枯草杆菌涂片标本
(3)弧菌:
水弧菌涂片标本
(4)荚膜:
肺炎双球菌荚膜标本
(5)鞭毛:
伤寒杆菌或变形杆菌鞭毛标本
(6)芽胞:
破伤风梭菌芽胞标本
三、实验方法与结果
在玻片标本的正面,滴加镜油,用油镜观察。
1、注意观察细菌基本形态(1、2、3号标本),比较其形状、大小、排列及染色性。
2、注意辨别细菌特殊结构。
(1)观察4号标本荚膜的特点,如大小、颜色、与菌体的关系。
(2)观察5号标本鞭毛的特点,如鞭毛的形态、数目及位置。
(3)观察6号标本芽胞,注意芽胞的形状、颜色及位置。
3、左眼观察标本的同时,右眼将图画在实验报告纸上,并加以适当地描述。
四、实验报告
图示细菌基本形态及特殊结构,并加以适当描述。
实验四 细菌动力显微镜检查法
细菌鞭毛与其动力有关,有无鞭毛,细菌的运动方式不同,依其运动特点可间接判定细菌有无鞭毛,也是鉴定细菌方法之一。
证明细菌有无鞭毛,除显微镜直接观察其运动特点外,还可以通过鞭毛染色法直接观察有无鞭毛及其特点,也可以通过半固体穿刺培养法间接证明。
本实验介绍的方法中,以压滴法最简单,较为常见。
内容:
一、悬滴法
二、压滴法
三、暗视野显微镜检查法
一、实验目的与原理
了解细菌动力的显微镜检查法,观察有鞭毛与无鞭毛菌运动的特点。
有鞭毛的细菌运动称真正运动或固有运动,其特点是细菌从一个地方游到另一个地方,可以改变位置,无鞭毛的细菌运动叫布朗运动,特点是不能改变位置,只在局部闪动,是因液体分子的冲击,致使细菌在局部颤动,这种运动也称分子运动。
二、实验方法及实验结果
(一)悬滴法
1、材料
(1)菌种:
变形杆菌、葡萄球菌8-12小时幼龄培养物。
(2)凹玻片、盖玻片、凡士林。
(3)显微镜
图2悬滴法(正面及侧面)
2、方法
(1)取洁净凹面玻片一张,在凹窝周围涂以凡士林(图2)
(2)取一环变形杆菌或葡萄坏菌培养物,放于干净的盖玻片中央。
(3)将涂凡士林的凹面载物片反转(凹向下),凹窝对准盖玻片的菌液滴置于其上,粘住盖玻片后再反转凹面载片(此时液滴悬于盖玻片下)用接种环柄轻压盖片周围,使与凹窝边缘粘紧。
(4)凹面载片置于镜台上,先以低倍物镜观察(聚光器下降,使视野稍暗)找到液滴边缘后,将边缘移到视野中央,再换高倍镜观察,上下转动微螺旋,即可看到在较暗的视野中有反光较强的闪动或流动的菌体。
3、结果
变形杆菌有鞭毛,有改变位置的运动,即真正运动。
葡萄球菌无鞭毛,只在局部闪动,即布朗运动。
(二)压滴法
1、材料
(1)菌液同前。
(2)载物玻片、盖玻片、显微镜等。
2、方法
(1)用接种环取菌液置于洁净的载物玻片中央。
(2)将擦净的盖玻片置于菌液上,覆盖时,先用盖片一边接触菌液(或先使中央与液滴接触)缓缓放下盖片,防止玻片间产生气泡(否则视野过亮影响观察结果),滴加菌液量以加盖片后无菌液溢出盖片为度。
(3)将载片置于镜台上,用低倍物镜找到标本,再换高倍物镜观察。
3、结果:
同悬滴法。
(三)暗视野显微镜检查法
暗视野显微镜检查主要用于不染色标本的活体细菌、螺旋体等的形态与动力观察,尤以观察活螺旋体用暗视野观察效果更佳。
暗视野检查法是将普通光学显微镜上明视野集光器换上暗视野集光器即可,这种集光器的特点是透镜中间不透光,光线只能从周围斜射在玻片标本上。
因光线不能直接进入镜筒,故视野是暗的。
但斜射到细菌等微粒上的光线,由于散射作用而发出光亮反射到物镜内,故可在黑暗的视野中看到发亮的菌体,如夜空的星星一样,点点发光,极易观察,但不能观察内部微细结构。
1、材料
(1)菌种:
牙垢
(2)载物片(厚1.2mm以下)、盖片(0.16mm以下)及生理盐水等。
(3)暗视野显微镜(或普通光学显微镜、暗视野集光器和特制镜头)、光源。
2、方法
(1)载片上加生理盐水一滴,用牙签取牙垢少许于生理盐水中混匀,覆以盖片。
(2)在暗视野集光器上滴加镜油一滴,然后将次台稍向下移。
(3)将制好的标本置于载物台上,缓缓上升集光器使镜油与载物玻片下面接触,注意切勿产生气泡。
(4)用低倍物镜对光,当视野中出现圆形光环时,转动集光器上的调节柄,将光环移至视野中心。
(5)在盖片上滴加镜油,以油镜观察。
3、结果
在黑暗的视野中,菌体光亮,形状清晰,螺旋体的螺旋及运动方式,清晰可见。
实验五细菌的染色标本检查法
形态学检查是鉴定细菌的重要一环。
但细菌个体小,无色透明,不染色在镜下不易观察清晰,使菌体着色后,即可在镜下清晰地观察其形态特征,有助于菌种的鉴定。
进行细菌染色时因其等电点低(PH2~5),常用美兰、复红、结晶紫等碱性染料,易于着色。
染色方法有单染色与复染色之分。
只用一种染料使细菌着色的方法称单染色法;用二种以上染料染色的方法叫复染色法,主要有革兰染色法、抗酸染色法;此外还有多种特殊染色法。
内容:
一、涂片制备及革兰染色法
二、抗酸染色法
一、涂片制备与革兰染色法
(一)实验目的与原理
初步掌握细菌涂片标本的制备法及革兰染色方法。
革兰染色原理尚未完全明了,可能与下述三个方面有关:
(1)革兰阳性菌等电点(PH2~3)比阴性菌等电点(PH4~5)低,一般染色时溶液的酸碱度在PH7.0左右,故阳性菌较阴性菌带有较多的负电荷,与碱性染料结合力较强,结合的染料较多,不易脱色。
(2)革兰阳性菌细胞内有某种特殊的化学成分,一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物,它与染料—媒染剂复合物相结合,使已着色的细菌不易脱色。
(3)革兰氏阴性菌细胞壁通透性高,脱色剂(酒精)较易通过细胞壁,将碘和染料的复合物溶解洗出,容易脱色,而阳性菌则由于细胞壁通透性低不易脱色,保留了紫色。
(二)实验材料
1、菌种:
大肠杆菌和葡萄球菌的混合液。
2、染液:
革兰染色液
3、显微镜、载物玻片及接种环等
(三)实验方法
1、染色涂片制备法:
涂片厚薄适度,否则效果不好。
(1)涂片:
取洁净载物玻片一张,点燃酒精灯,左手持菌液试管,右手以持手笔方式拿接种环,在火焰外焰中烧灼灭菌后取混合菌液一环,轻轻涂于玻片的偏中央,涂面直径1厘米左右,厚度适宜均匀(以透过涂面能看清字迹为宜)。
接种环于火焰上再次烧灼灭菌后放还原处。
(2)干燥:
涂片最好在空气中自然干燥,如欲加速干燥,可将涂面向上,距火焰稍远处烘干,切忌紧靠火焰,以防菌体变形,无法观察。
(3)固定:
涂片干燥后,涂面向上在火焰最热部分往返通过三次(一般钟摆速度)即可。
固定的目的是杀死细菌,使菌体蛋白凝固与玻片粘附较牢,改变对染料的通透性(一般染料难于进入活细胞内)使之容易着色。
2、革兰染色法
①初染:
在已固定好的涂片上滴加结晶紫液1—2滴(以盖满涂面为度),染1分钟后,用水轻轻冲洗。
②媒染:
加卢戈液1—2滴,作用1分钟后,水洗。
③脱色:
滴加95%酒精2—3滴,轻轻侧动玻片(以助脱色),使酒精流去,再滴加酒精,如此反复,直到流下的酒精无色或呈淡紫色为止,一般约20~30秒钟,及时用水徐徐冲洗。
④复染:
滴加沙黄液1—2滴,染色2分钟,水洗。
⑤待干或用滤纸吸干(一定要吸干!
)用油镜检查。
3、实验报告:
记录革兰染色方法、结果,绘图并进行分析。
二、抗酸染色法
(一)实验目的与原理
分枝杆菌属均具有抗酸性,抗酸染色法是主要用于分枝杆菌属染色的一种鉴别染色法。
染色原理一般认为,石炭酸与复红是按分配系数分布于细菌、染色液和脱色剂中。
分枝杆菌含脂类较多,石炭酸与染料在菌体内保留的较多。
脱色时,溶于抗酸菌细胞内的量也较溶于脱色剂中为多,故菌体保留有颜色,而非抗酸性菌细胞内的石炭酸与染料易离开菌体,不被着色。
此外,抗酸染色与细菌细胞壁的完整性也有关系,如因机械作用或自溶而细胞破裂时,抗酸染色性消失。
抗酸菌细胞壁能限制染料进入体内,因此染色时须加温,以促进细菌着色。
常用的抗酸染色法是萋一纳氏染色法
(二)实验材料
1.菌种:
卡介苗和变形杆菌混合液。
2.液:
石炭酸复红,3%盐酸酒精,碱性美兰液
3.载物玻片,显微镜等。
(三)实验方法
1、用卡介苗、变形杆菌混合菌液如前法制备涂片,干燥固定。
2、染色法
(1)在涂面上加满石炭酸复红液,在微火上加热使产生蒸汽但勿使煮沸,防止玻片爆裂。
为防止烤干,随时补加染液,维持5分钟,待冷水洗。
(2)滴加3%盐酸酒精脱色30~60秒钟,轻轻摇动玻片,直至无红色流下为止。
然后水洗。
(3)用碱性美兰复染60秒,水洗、吸干后,油镜检查。
(四)实验报告:
图示抗酸染色结果。
实验六细菌的人工培养
内容:
一、常用培养基的制备原则
二、细菌培养的接种方法
细菌分离培养接种法
细菌纯培养接种法
三、细菌生长状态观察
一、常用培养基的制备原则
(一)实验目的与原理
了解细菌培养基的制备原则和基本程序,熟悉常用培养基的种类与名称。
人工培养细菌时除了需要合适的温度、气体外,最重要的是给细菌提供所需的营养物质,这种营养物的制品称为培养基。
(二)方法
1、培养基的制备原则:
①适当的营养成分。
②合适的酸碱度。
③配制后经灭菌后方可使用。
2、培养基配制的基本程序
按一定配方称量各种物质→溶解→测定及调整PH→滤过→分装→灭菌、备用。
3、常用培养基的种类:
按用途可分为
(1)基础培养基:
含有细菌所需要的最基本营养成份,可供大多数细菌生长。
最常用的是肉汤培养基与普通琼脂养基。
(2)营养培养基:
在基础培养基中加入一些血液、血清等营养物质,可供营养要求较高的细菌生长,如血琼脂平板。
(3)鉴别培养基:
利用各种细菌分解的作用物及其代谢产物的不同,可应用含有一定作用物和指示剂的培养基来培养细菌,作鉴别细菌之用,如糖发酵培养基。
(4)选择培养基:
是利用细菌对各种化学物质的敏感性不同,在培养基中加入一定的化学物质,抑制非目的的细菌生长,有利于需要分离细菌的生长,如SS琼脂平板。
(5)厌氧培养基:
厌氧菌必须在无氧的环境中才能生长。
造成厌氧环境的方法较多,如在培养基中加入动物组织(如肉渣)或还原性化学物质(如巯基乙酸钠、半胱氨酸等),并在培养基表面用凡士林或石蜡封住,使与外界空气隔绝。
常用的厌氧培养基有肉渣(庖肉)培养基。
按物理性状可分为
(1)液体培养基;
(2)固体培养基,在液体培养基中加入2~3%琼脂。
固体培养基倾倒平皿上即成“平板”,倾入试管内即可制成“斜面培养基”;
(3)半固体培养基:
在液体培养基内加入0.2~0.5%琼脂。
二、细菌人工培养的接种方法:
(一)细菌分离培养接种法——平板划线分离培养法
自然界中,病人被检材料(痰、便、脓汁及病灶)中常有多种细菌混杂在一起,欲证明材料中有无某种细菌存在或专门研究其中某一种细菌时,必须先使各种细菌分散开后,方能获得某种单一细菌的培养物,这种技术称为分离培养接种技术。
方法有多种:
如平板划线法,平板倾注法及动物接种分离法等,前者最为多用。
1、实验目的与原理
初步练习平板划线分离细菌的方法。
使用混杂在一起的细菌分散生长。
将粘有混杂菌材料的接种环,从平板培养基表面的一点开始反复而不重叠地连续划线,随着划线的延长,接种环上粘有的细菌逐渐减少,至划线的最后部分细菌可单个地留在培养基上生长繁殖,形成单个菌落。
2、实验材料
(1)菌种:
白色葡萄球菌和大肠杆菌的混合液。
(2)普通琼脂平板培养基,接种环等。
3、实验方法
(1)右手持接种环在火焰上灭菌待冷(约2~5秒钟)取一环菌液。
(2)左手抓握平板培养基,微开皿盖,伸入接种环将材料涂于培养基“甲”部(图3—1,3—2)。
图3-1平板区划线法图3-2陪养后菌落的散布情况
(3)烧灼接种环冷却后,通过“甲”部左右反复连续密划线(不重叠)并向下移,至培养基一半的地方如图“乙”部。
(4)再烧灼接种环待冷,将培养基逆时针转90度,接种环通过“乙”部,再划线至培养基所余的一半,如图“丙”部。
(5)如上法灭菌,将培养基再逆时针转90度,通过“丙”部反复划线,划完最后的“丁”部。
(6)划完,盖好皿盖,并在皿底部贴好标签,说明接种者班组、姓名,培养皿倒置,送温箱中培养。
(7)37℃24小时后取出,观察菌落的大小、形状、边缘、表面结构、颜色、透明度等性状。
(二)细菌纯培养接种法
细菌分离成纯种培养后,常需接种至各种有关培养基,以进一步测试其生化反应等生物学性状。
根据培养基的物理状态不同,纯种接种法有斜面培养基接种、液体培养基接种和穿刺接种法三种。
1、斜面培养基接种法:
主要用于纯培养及保存菌种。
①菌种:
大肠杆菌18~24小时琼脂斜面培养物。
②培养基:
琼脂斜面培养基。
(2)实验方法
图4斜面培养基接种法
①左手拇指、食指、中指及无名指分别握持菌种管与待接种的培养基管,使菌种管位外,培养基管位里。
斜面部均应向上,管口稍高,以免管底凝固水浸湿培养基表面或沾湿棉塞。
②右手拇、食指先转动两管棉塞,以便接种时易于拔取。
③右手持接种环,烧灼灭菌,柄部也要迅速通过火焰2~3次杀灭表面的杂菌,灭菌后拿在手中,勿与其它物接触。
④以右手无名指与小指拔取菌种管棉塞,再用手掌与小指拔取待接种管,随后将两管管口迅速通过火焰灭菌。
⑤用灭菌后冷却的接种环伸入菌种管,从斜面上挑取少许菌苔,退出管后再伸入待接种管,自斜面底部轻轻向上部蜿蜒划线或在斜面作上下涂布(勿触破培养基表面,沾菌的接种环进出试管时不应触及试管内壁)。
⑥接种毕,接种环火焰灭菌后放下。
两管口迅速通过火焰2~3次灭菌,先将指掌间棉塞塞入接菌管内,后将无名指小指间棉塞塞入菌种管上,将管放回原处。
⑦37℃孵育18~24小时,观察生长情况。
2、液体培养基接种法:
主要用于增菌培养及检测细菌的生化反应。
①菌种:
大肠杆菌18~24小时斜面培养物。
②培养基:
肉汤培养基。
(2)实验方法
①如斜面培养基接种法,左手握持菌种管及待接种管。
②接种环火焰灭菌,伸入菌种管取少量菌苔,再伸入肉汤管中在接近上面液面管壁上轻轻研磨(图5)并沾取少许肉汤调和,使菌混于肉汤中。
③接种毕,接种环灭菌后放下。
分别塞好棉塞(方法同前),37℃孵育18~24小时,观察生长情况。
图5液体培养基接种法
3、半固体培养基接种法
制成呈柱形直立于试管中的半固体培养基,应用穿刺法接种。
(1)实验材料
①菌种:
大肠杆菌及白色葡萄球菌18~24小时斜面培养物。
②培养基:
半固体琼脂培养基
③接种针
(2)实验方法
①左手握持菌
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