流式细胞仪在白血病免疫分型诊断.docx

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流式细胞仪在白血病免疫分型诊断

流式细胞仪在白血病免疫分型诊断

一、概述

近年来白血病的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一。

早年曾用过的荧光显微镜或APAAP方法基本被废弃。

国际上公认的通用的方法是流式细胞术（FCM）。

流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体（McAb）作分子探针，多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。

1．流式细胞仪诊断白血病的依据

⑴　FCM能快速，多参数，客观的定性又定量测定细胞膜、浆、核的抗原表达

⑵　至今尚未发现白血病的特异抗原。

⑶　能用正常血细胞的单抗来进行免疫分型是基于白血病形成的分化阻断学说。

即白血病细胞基因异常，分化受阻于某阶段形成不同亚型的白血病。

这群细胞充盈于骨髓。

正常血细胞从多能干细胞分化、发育、成熟为功能细胞的过程中，细胞膜、细胞浆或胞核抗原的出现、表达增多与减少甚至消失与血细胞的分化发育阶段密切相关，而且表现出与细胞系列及其分化程度相关的特异性。

因此，这些抗原的表达与否可作为鉴别和分类血细胞的基础。

白血病是造血系统的恶性肿瘤，在形态上变化虽相当大，但仍能表达正常血细胞所具有的抗原，因而仍可依据其抗原的表达谱对白血病进行免疫分型。

2．流式细胞仪诊断白血病的意义

⑴　骨髓血细胞是形态学分型的基础，FCM白血病免疫分型是对形态学分型的重要补充和进一步深化，国际白血病MIC分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都是必不可少的，对下列情况意义更大：

①用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。

②形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。

③混合性白血病。

④部分髓系白血病。

目前，免疫分型对粒细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难。

⑤慢性淋巴细胞白血病。

⑥微小残留白血病。

⑵　临床预测；可根据抗原的表达情况预测病情的预后：

如白血病患者有CD7+与CD34+共表达，预后不好。

⑶　疾病监测：

可监测病程的发展，疗效，可进行微小残留白血病的检测。

二、免疫分型常用的免疫标志及其意义

1．白血病系列分化抗原

T淋巴细胞白血病：

CD3、CD5、CD7。

B淋巴细胞白血病：

CD10、CD19、CD22。

NK淋巴细胞白血病：

CD16、CD56、CD57。

髓系白血病：

CD13、CD14、CD33、MPO（髓过氧化物酶）。

红白血病：

GlyA（血型糖蛋白A）。

巨核细胞白血病：

CD41、CD42、CD61。

2．白血病系列非特异性抗原

CD34、HLA－DR为早期细胞抗原，无系列特异性，可与CD38联合运用于免疫分型。

一般而言，干/祖细胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38－，原始细胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38＋，而幼稚细胞（如早幼粒细胞）CD34－、HLA－DR－、CD38＋。

3．白血病分化阶段抗原

T细胞抗原CD4、CD8。

B细胞抗原：

CD10、Cyμ（胞浆μ链）、SmIg（表面膜免疫球蛋白）、CD38和CyIg（胞浆免疫球蛋白）、CD11C。

4．白细胞共同抗原

CD45为白细胞共同抗原，其表达量在淋巴细胞最高，单核细胞，成熟粒细胞，早期造血细胞（blasts）依次减弱。

红细胞（中，晚幼红细胞，成熟红细胞）不表达CD45。

用SSC/CD45PerCP双参数分析可十分容易鉴别骨髓和血液中的原始或成熟细胞。

用两个系列或阶段特异性McAb加CD45进行三色免疫荧光染色，经FSC、SSC、McAbl-FITC、McAb2-PE、CD45PerCP五参数分析，可特异地分析原幼白血病细胞的免疫表型而不受成熟细胞的干扰。

三、白血病及淋巴瘤免疫分型

1．AML

MO：

有低的SSC和FSC。

在CD45－SSC图上出现在淋巴细胞位置上，至少表达一个特异性标志如CD13或CD116，但MPO比CD13与CD33更灵敏。

一般淋系标志阴性，但也可表达CD7或CD4。

一般HLA－DR、CD34阳性，有些研究表明CD7与CD34共表达在AML且预后差。

M1：

流式上M1与M0相似不易区分，M1一般CD13＋、CD33＋、HLA－DR－，但CD34表达少于M0，可能表达部分CD15。

M2：

M0与M1的主要区别是成熟度增加，blasts减少，CD15较M1较显著，CD34弱于M1，CD13有时表达强于CD33，多数病例HLA－DR（-）。

CD45－SSC图显示从髓系blast区至成熟骨髓细胞区的连续细胞带，CD45－SSC图有助于确定blasts比例。

M3、高颗粒性，具较高的SSC，但CD45较成熟C少，多数情况HLA－DR（-）或表达减少，CD34少于M2、一般CD13弱（＋），可有CD2表达。

M4与M5：

两型表型相似，但M4较M5表达更多的CD34（＋），较之M0、M1，M4与M5有更大的FSS和SSC，CD45－SSC图上，成熟C出现在单核区，重要的表型为CD13、CD33、HLA－DR、CD14和CD15，CD33可表达强于CD13，CD33（＋）、CD13（－）、CD34（－）很可能为M5，但只出现在少数病人中，部分M5可见CD56（＋）。

M6：

M6较少见且特征不明显，一般HLA－DR，CD34、CD13、CD33阳性，CD45－SSC图显示主要为红系成份。

M7：

巨核细胞白血病，在AML中少于1％。

一般CD61（GpⅢa）和/或CD41（GpⅡb-Ⅲa）阳性，而注意由于血小板粘附在blasts上造成的假阳性，可以用流式双色分析在EDTA存在下，测GpⅡb/Ⅲa与CD34以减少激活血小板的粘附。

2．ALL：

ALL是儿童中最常见的恶性肿瘤，约占全部肿瘤的25％，在成人，ALL约占急性白血病的25％，我们将ALL分为B祖细胞型，CD10＋或CD10－，前B细胞型，B细胞型，T细胞型。

B祖细胞型ALL：

在幼儿约占ALL的65％～70％，青少年为55％～60％，成人为50％。

在儿童，约90％病例CD10＋，在幼儿只有少于50％病例CD10＋，blasts一般FSC、SSC很少，是FAB标准的L1或L2，一般TdT（+）HLA-DR（+），CD19（+），此型又分为2个亚型，CD10＋和CD10－，前者预后好，多数病例CD24＋，CD34＋，CD20表达随成熟度增加而增加，B祖细胞被定义为sIg-。

前B细胞型ALL：

此亚型约占儿童ALL的25％，细胞一般为CD19＋，CD24，HLA－DR＋，胞浆CD22＋，CD10＋，TdT随CD20变化，CD34多为阴性，前B亚型被认为比B祖型预后更差，这与t（1；19）出现相关并由此产生E2A－PBX1融合蛋白，它的表型为CD19＋、CD10＋、CD9＋，不同程度CD20表达，CD34－，确认此表型有助于诊断基因上不确定的病例。

B细胞型ALL：

成熟B细胞型ALL约占ALL2％～5％，B细胞型ALL较之B祖细胞型ALL有更大的FSC和SSC，在CD45－SSC图上出现在淋巴和单核细胞区域，即FAB标准的L3，表型为CD19、CD20、CD22、CD24且sIg（多数为IGM）多数病例CD10＋。

但成熟抗原及sIg使之区别于更早的B系ALL，极少数成熟B细胞ALL无FAB－L3形态。

T－ALL：

多数病例有大的FSC、SSC，在CD45－SSC图上可能出现在淋系未成熟细胞和髓系未成熟细胞或单核细胞区，多数表现为胸腺亚型，最常见亚型为皮质晚期表达，CD1、CD2、CD5、CD7、CD4/CD8双阳与极少膜表面CD3、TdT多为阳性。

另一常见亚型为皮质早期表达CD2、CD5、CD7、TdT强表达。

髓质期亚型表达CD2、CD5、CD7、与CD3＋CD4＋/CD3+CD8+,很少见TdT表达。

前T细胞亚型，表达CD7胞浆CD3＋且无其它T细胞抗原，T细胞肿瘤的特征是丧失T细胞抗原而表现出其它异常抗原组合。

杂合型白血病：

随着流式技术的广泛应用，我们发现许多病例并不能严格划分为淋系或髓系，真正的双表型病人多为t（9；22）或（11q23），现在杂合型的误诊率很高。

最常导致误诊的原因是在分析中未能排除非白细胞，过度强调弱的非特异性结合，忽略了某些抗体缺乏系特异性，最重要的系特异性抗原在B系、T系、髓系分别为CD22、CD3和MPO。

3．CML：

由于慢性期显著的细胞分化，在CD45－SSC图上除了髓系细胞占主导外，只显示一个正常骨髓像，CML可确诊，CML起病与发展相对缓慢，慢性期的持续1年左右最终发展为加速期和急变期。

流式细胞技术对急变期亚型的诊断具有极高价值。

直接影响到治疗效果。

急变期CML主要表现为髓系，偶为淋系，髓性急变可表现出多种形态包括未分化细胞。

淋性急变具典型形态特征，为CD10＋B祖细胞ALL极少有T细胞型ALL。

4．CLL：

CLL细胞主要为较正常淋巴细胞稍大的小淋巴细胞。

免疫分型主要为：

SIgM、SIgD弱表达，B系抗原为CD19、CD20、CD43、CD79a与CD5共表达，CD23表达使得CLL区别于帽细胞淋巴癌MU，即（CLL：

CD23＋，MCL：

CD23－），CD10－、CD23－、CD11c和CD25、CD20常弱表达，尽管CLL起病慢，但CLL病人的生存率变化很大，有染色体异常的病预后不良，最常见的三联体trisony12、14q、13q、11q，免疫表型上没有特异的变化而免疫表型的变化并不是提示染色体异常。

最近，有研究表明，三联体trisony12与SIg、CD20表达量高度相关，与CD23－相关与FMC7相关。

B型前淋巴细胞白血病（B－DLL）较CLL更为严重，流式细胞技术在区分B－DLL和CLL上发挥很大作用，B－DLL多为CD5－，CD22＋，表达更强的sig。

MU病人平均生存率不超过5年，与CLL在形态上很难区分，与CLL相似有CD5＋B祖细胞，但Sig表达强于CLL，且CD22－。

另一与CLL难于区分的是FCC，细胞为强Sig、CD5－、CD10＋、CD23＋，具B系表型：

对于诊断为CLL，CD5、FMC7、CD22与SIg，CD20异常强表表达的病例我们要考虑是否为DLL、MCC或CLL的亚型（trisomy12）因为它们危险性更大。

四、流式细胞仪免疫分型实验

1．样本采集、运输、保存和操作

⑴样本类型：

适用于多种临床标本，如外周血、骨髓穿刺液、骨髓活检物、淋巴样组织活检物、浆液、脑脊液、皮肤、黏膜（内窥镜活检物）、细针穿刺物等等。

⑵抗凝剂的选择：

外周血标本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。

如果用同一份血标本做白细胞计数和流式分析，则应用EDTA抗凝。

骨髓穿刺可用肝素。

其他体液用EDTA、ACD或肝素均可，但保存的样本活性可能会降低，EDTA的优点是成熟髓性细胞贴壁造成的损失及血小板聚集较小，但细胞散射光特征丢失较肝素标本快；由于相对大量的ACD会通过改变pH而影响骨髓细胞活性问题，通常不推荐用ACD做骨髓穿刺抗凝剂。

⑶样本的保存：

样本的完整性和细胞活性与抗凝剂的选择、运输、保存和温度息息相关。

①理想状态下，样本应在采集后立刻进行处理和染色。

②短期保存（1小时或更短）应在室温（18-22℃）;

③长时间保存血或骨髓标本室温即可，有些样本可能4℃为佳。

④标本保存的时间上限取决于标本类型及其保存条件。

⑤肝素抗凝的血和骨髓通常可保存至48-72小时；

⑥EDTA抗凝的血和骨髓可保存至12－24小时。

⑦ACD抗凝的血和骨髓可保存至72小时，但

⑧对于只做胞内染色的样本，可固定细胞以长期保存。

但?

quot;固定－染色"的方法取决于要分析的抗原特性和染色方式，采用之前一定要进行新鲜标本的对照和验证实验。

2．样本制备

⑴单细胞悬液的制备

①血和骨髓：

天然单细胞悬液。

当有血凝块时，应用50um尼龙网过滤，同时进行细胞计数和血涂片以判断靶细胞群体是否仍然存在。

②组织块：

机械分离和酶分离两种方法。

分离不仅是要获得最大产量的单细胞悬液，还要尽量保证细胞结构的完整性和抗原性。

大多数淋巴样组织可用轻柔的机械方法快速分离，并保持收获细胞的相对完整。

某些组织由于细胞间连接紧密，需在机械分离的基础上用蛋白水解酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶。

骨髓标本亦可能因骨细胞成分污染而需要酶消化。

但使用酶法一定要确认酶的使用没有改变、减弱靶抗原的表达，细胞活性没有显著降低。

⑵分离靶细胞群体

样本的任何处理方式都可能导致靶细胞群体的丢失。

所以应尽可能使用最接近原始标本状态的处理过程。

去除红细胞是流式分析要求的至少步骤。

两种方法：

①红细胞裂解：

较佳。

操作简单、快、并最可能保持原始标本的白细胞分布。

溶血剂的选择应基于其选择性去除成熟红细胞而最小程度的影响其他细胞的特点。

最好在染色后溶血。

若在染色前溶血，需确认：

抗原性不被溶血过程改变；溶血剂被彻底洗去，细胞和抗体结合的动力反应未受影响；所用溶血剂不含固定剂，否则会影响细胞活性及表面标记结果。

②度梯度离心：

白血病细胞回收较好并可能得到富集，同时去除死细胞。

但费时，白血病细胞的相对频率较难分析，某些重要细胞群体可能选择性丢失。

根据密度梯度原理，若白血病细胞没有与淋巴细胞相似的浮力密度即可能丢失。

所以用此方法时应检查各层细胞特性以防止靶细胞的丢失。

⑶估细胞悬液

①样本外观：

有严重溶血和血凝块的标本可能会有白细胞的损坏以及细胞亚群的丢失或改变，应弃用。

②细胞丢失和分布：

确认细胞形态和原始标本相似。

密度梯度离心之后更应检查细胞分布。

可做血涂片判断。

③细胞计数和浓度调整：

厂家推荐的抗体浓度通常是假定靶细胞数量在正常范围内（500,000-1,000,000／testAb）。

白细胞数量上的显著变化会带来染色模式的变化。

而白血病标本常常有异常的白细胞数量，骨髓标本也可能被外周血稀释，这些标本的细胞性可能有极大的变异。

因此有些标本没有足够的细胞做流式分析，有些则由于细胞量大，正常浓度下的抗体相对不足，不能饱和所有的结合位点，导致假阳性结果。

所以染色前的细胞计数非常必要。

推荐方法：

WBC<1000/uL:

用200uL全血并调整相应溶血剂用量；WBC:

1000-10000/uL,用100uL全血并用溶血剂标准量；WBC:

10000-20000/uL,用50uL全血并调整相应溶血剂用量；WBC>20000/uL，用稀释至

（2）（3）范围内。

骨髓标本常常要在PBS1:

10稀释后计数。

应该指出，由于不同的标本中不同系列的细胞比例不同，调整细胞总数不一定合适每一个系列特异的抗体。

实验室若选择不同于厂家推荐的方法（如自己稀释抗体），抗体一定需要进行测试以得到抗体和细胞的最佳比率。

④细胞活性：

死细胞对许多抗体有非特异性染色，有些抗原同时存在于胞膜和胞浆，这就使样本的细胞活性检测变得重要，尤其毖揪顺な奔涞脑耸浜痛⒋妫蚨匝镜闹谱鞴滩惶宄薄＜觳獾姆椒ㄍǔＳ辛街郑阂皇鞘凳钡牧魇郊觳猓豪糜馊玖螾I、7-AAD或EMA（ethidiummonoacide）。

活细胞将拒染这些染料。

此方法的优势是细胞表面标志和活性分析可同时进行，通过设门即可得到活细胞的染色特性。

尤其适用于高度坏死的样本。

样本染色后需固定。

应在加固定剂之前洗去多余的7AAD，以保证区分的是固定前细胞的死活状态。

但随着时间延长，7AAD会在固定的细胞群体重新分配，死活细胞的区分变难。

对于染色后常规固定并在固定后12小时以上分析的标本，最好用EMA。

EMA与死细胞DNA稳定的共价结合保证了长时间固定后仍能很好地区分固定前的死活状态。

二是手工检测：

使用Trypanblue或其他细胞活性染料。

⑷细胞染色

①细胞表面染色：

大多数可帮助白血病免疫分型的抗原都在细胞膜上。

但由于许多抗原也同时存在细胞内，所以在细胞表面抗原检测时应特别注意保持细胞膜的完整以保证检测的特异性。

例如免疫球蛋白重链在细胞内和表面的存在有着不同的意义，检测表面标记必须是未固定的活细胞。

②细胞内染色：

有些胞内特异性抗原的检测对白血病的免疫分型尤为重要，如TdT,MPO,cCD3,cCD22,以及胞浆内Ig的表达。

胞内染色的关键是使细胞膜通透，把抗体导入胞浆而不影响细胞结构的完整性。

要保证固定和透膜的步骤不影响有关标记的抗原性以及和抗体的结合。

③胞膜和胞内的同时染色：

通常，先胞膜染色，固定，膜通透和胞内染色，最后是DNA染色。

固定剂和通透剂都可能对细胞和参数有不同的多重影响，应根据情况选择。

每一步染色对荧光素的选择和抗体的选择都很重要。

如，用于表面标记的荧光素应不被随后的固定和通透步骤所影响，而对于胞内染色，所用的荧光素应足够小能穿透到胞膜内。

3.抗体组合的确定：

选择抗体组合的技术性考虑：

基于血液肿瘤的复杂性，提供一个通用的抗体选择策略是不现实的。

国际上迄今也没有一致性的抗体组合。

应该意识到，没有一个神奇的既小又功能齐全的抗体组合可以解决所有的临床相关答案。

一个局限性的小组合也可能影响对样本的正确评估和分类。

确认细胞异常的能力与所用抗体的数量直接成正比。

⑴选择抗体组合的基本原则如下：

1）所选的抗体组合应足够宽，可以鉴别样本中的所有细胞亚群包括正常和异常群体。

抗体的数量越多，检测的灵敏度越高。

应该指出，由于肿瘤细胞常常缺少细胞的正常标记或表达异常，所以特异性抗体一定程度上的重复选择有时是必要的。

2）抗体的选择应可以区分正常和异常细胞，正常细胞可作为实验的内参照，异常细胞的表达比例也更准确。

如现在用CD45抗体来区分正常和幼稚细胞，此方法尤其在幼稚细胞含量少时更显优势。

3）荧光强度和表位密度应同时考虑。

对表达少的抗原表位应尽可能选择强度强的荧光素。

4）必要时用活性检测排除死细胞较强的非特异性染色。

国外统计，约70%组织样本和48%血或骨髓标本有活性检测结果。

5）实验人员应了解所用抗体的反应细胞谱，以及与特定荧光素结合后的染色模式。

相同的CD编号的不同抗体可能有不同的结合模式。

⑵常用的方案考虑：

大而全的抗体组合：

全面了解抗原表达，无需额外染色，省时但费用高。

先用筛查试剂了解样本的一般情况，再根据所得信息采用第二线特异性更高的抗体组。

经济，但费时，也需要正确的抗体选择的策略性决定。

但考虑到所用时间和设备费用，只有约30%国外实验室采用此法。

基于临床或形态学的资料，选用有目标性的抗体组合以确认可疑的诊断或分类。

4.　样本获取

通常，每个标本应获取1-2x104个有核细胞的荧光和散射光信号，微小残余病变分析则需5x104个细胞。

恶性细胞常有较宽的大小和粒度范围，获取时最好收集无门的数据以保留所有未知异常细胞群体的所有特性。

免疫荧光信号要求对数放大和至少256道的分辨率。

无论选择对数或线性放大都要以保证异常细胞都能被检测到。

5.　数据分析

只有通过多参数分析，才能最大程度地区分异质的样本中的正常和异常细胞。

多参数分析意味着综合细胞的光散射和多色荧光特征。

最少的要求应是4个参数（2个光散射和2个荧光参数）。

采用的参数越多，分析步骤越复杂，流式免疫分型的灵敏度越高。

⑴分析技术：

数据的分析方式随样本的特性、抗体组合及临床情况的不同而变化。

但总的原则是要用多参数的数据创造可以区分正常和异常细胞的图形，如FSCvs.SSC,FLvs.FL,Scattervs.FL等，散射光与荧光参数的综合分析常常能提供有效的信息。

⑵　分析步骤：

首先分析所有细胞的抗原表达情况，鉴别出正常细胞和异常细胞群体，正常细胞的表现可以作为整个实验染色过程的内部参照，提供实验一致性与否的客观证据，异常细胞则通过进一步设门分析确定表型特点。

⑶　设门：

即选择特殊的细胞群体分析其各个参数的表现，是一个基本的分析技巧。

把分析局限在门内的细胞群体的前提是门内的细胞代表所有感兴趣的细胞，而且没有其他细胞的污染。

一般来说，不同疾病的设门策略亦不同，常用的FSCvs.SSC的设门方式可能不总是适用于L&L分析，如在急性白血病中，CD45和SSC的双参数显示是鉴别幼稚细胞的一个简单而有效的方法；在B细胞淋巴瘤中用一个全B细胞的抗体设门来看抗κ链和抗λ链的表现；T细胞淋巴瘤时用一个全T细胞抗体设门使肿瘤细胞的分型更加明确。

另外，通过细胞特异的抗原表达确定其光散射区域的"backgate"的方法也很实用，如通过CD14vs.CD45的双参数分析区分多个区域的淋巴、单核和粒细胞群体。

⑷　分析异常细胞群体：

确定异常细胞群体后要进一步分析其免疫分型。

分析抗原表达要注意：

①在L&L中，定性的描述（阳性或阴性）通常要比阳性百分率的计算更有价值。

只有在设门内细胞全部是感兴趣的细胞而且荧光分布的形状可以非常清楚地区分阳性和阴性亚群的情况下，阳性百分率才有意义。

当然，在某些抗原异质表达的群体中，可进行定性或定量的分析（X%幼稚细胞CDX阳性）；百分率也可用于描述异常和正常细胞的比例。

②评估抗原表达强度是分析的重要组成部分。

对于一个特异的抗体而言，荧光强度是抗原密度的反映，同时也与所用的荧光素和独特的荧光素抗体复合物有关。

有时确认异常群体是因为没有表达应该表达的抗原，但有时只能从抗原表达的异常强度来判断。

如用一些髓性抗原CD14，CD33，CDw65的相对表达强度和散射光特征一起来确认单核细胞系和粒细胞系的发展成熟过程。

荧光强度的评估在大多数情况下可以采用定性的资料，但由于试剂和机器上的不同，仅仅基于荧光道数的简单标准可能并不足够，最好以其在相同条件下相对正常细胞的强度来表示。

如CD45，CD8或CD38等在不同细胞上的表达密度相差几个对数范围，CD22或CD4等抗原则在所谓阳性范围内在不同细胞类型上的区别较小。

③区分弱阳性和阴性群体：

在某些情况下对诊断有较大的价值，如B细胞恶性肿瘤的CD5弱表达，但弱表达的判断却常常很难。

现行的标准如"20%阳性"等都仍是人为的标准。

依照直方图上与对照组相比向右移动来判断阳性所需的最小位移也是人为的标准。

可用K-S统计来比较直方图的区别。

亦可选用强的荧光染料，或用过量未标的抗体阻断非特异染色，从而判断弱阳性染色的特异与否。

6.数据解释

虽然对流式免疫分型结果的解释最好与形态学结果综合考虑，但流式的作用仍远远多于对形态学结果的简单证实。

流式可能帮助形态学确认某些诊断，也可能提出之前没有考虑的诊断，甚至在一些典型表现下流式免疫分型可以在其他方法的辅助下诊断疾病，但应尽量解释任何流式结果和其他方法结果上的不一致，流式结果应与临床、形态学、细胞遗传等其他方法综合考虑。