苏婧硕士学位论文.docx
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苏婧硕士学位论文
学校代码
10699
分类号
R318
密级
学号
066180772
题目
基于广谱性单克隆抗体的有机磷
农药多残留免疫检测方法的研究
作者
苏婧
学科、专业
生物医学工程
指导教师
薛小平
申请学位日期
2009年3月
硕士学位论文
基于广谱性单克隆抗体的有机磷
农药多残留免疫检测方法的研究
申请人:
苏婧
学号:
066180772
所在学院:
生命科学院
学科专业:
生物医学工程
指导教师:
薛小平
辅导教师:
杨慧
申请学位日期:
2009年3月
ADissertationSubmittedtoNorthwesternPolytechnicalUniversityfortheMasterDegree
DevelopmentofImmunoassaysforMultipleResiduesofOrganophosforusPesticidesusingMonoclonalAntibodies
Author:
SuJing
Specialty:
BiomedicalEngineering
Supervisor:
Prof.XueXiaoping
Tutor:
Dr.YangHui
FacultyofLifeSciences
NorthwesternPolytechnicalUniversity
Xi’anShaanxi,P.R.China
March,2009
摘要
近几十年来,有机磷农药(OrganophosphorusPesticides,OPs)在农业及畜牧业中得到广泛应用。
与此同时,由农药残留引起的食品安全问题也越来越受到人们的关注。
仪器分析法是对有机磷农药残留检测中最经典、最常用的技术,主要采用色谱方法,包括:
薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)和高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)等技术。
这些传统的方法具有灵敏可靠的优点,但是,它们也存在一些明显的不足:
成本高、需要昂贵的仪器设备和专业的分析人员,样品准备程序复杂,并且不利于现场操作。
因此,迫切地需要建立一种简单、快速、灵敏、价廉,并能够适用在实验室和现场进行大批量的检测和筛选试验的检测技术。
免疫检测法是基于抗原抗体特异性识别和结合反应的是一类新的快速、敏感。
简便的检测方法,能够满足以上要求,从而日益受到人们的重视。
传统的农药残留免疫检测技术只针对某一种特定的农药残留进行分析。
本文基于实际应用中常采取多种农药混合搭配使用的特点,以与原药母体结构密切相关的类似物作为通用性半抗原,将通用性半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,分别合成免疫原和检测抗原,免疫小鼠,制备、筛选出一种能识别一类或几类具有相似结构的有机磷杀虫剂的广谱性鼠源性单克隆抗体(mAb),以达到对多农药残留同时检测的目的。
本研究中所制备的抗有机磷组特异性单克隆抗体的效价为1×106(间接ELISA实验),参考工作稀释浓度为1:
16000。
利用间接竞争性ELISA法对几种有机磷农药:
乙基毒死蜱、甲基对硫磷、辛硫磷和三唑磷的标准品进行检测,绘制出竞争抑制曲线。
结果表明:
由于农药化学结构的不同,检测灵敏度有一定的差别;其中对乙基毒死蜱检测灵敏度较高,最低检测限(LOD)为4ng/mL,对甲基对硫磷的LOD为63ng/mL。
而辛硫磷和三唑磷的化学结构与半抗原差别较大,检测敏感度低、一致性差。
胶体金免疫层析技术(Goldimmunochromatographyassay,GICA)是一种将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术。
该方法无需精密检测仪器以及专业的实验操作人员,可以在很短的时间内完成现场检测。
它的原理是:
以条状纤维层析材料为固相,通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动,并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(抗原或抗体)发生高特异性、高亲和性的免疫结合反应,层析过程中形成的免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带),运用可目测的标记物(胶体金)能够直观的观察检测结果(显色条带),也可以借助专用检测设备判读检测结果。
本文在已制备出抗一类有机磷农药的组特异性单克隆抗体的基础上,又通过鞣酸—柠檬酸三钠还原法制备出直径16.08±0.64nm、质地均一的胶体金,并且以此标记单克隆抗体,组装胶体金免疫层析检测板,从而快速地对上述有机磷农药进行检测。
结果表明:
该检测板对乙基毒死蜱具有较好的检测灵敏度,LOD为:
4μg/mL,检测时间为5分钟。
最后,利用酶免疫检测法和胶体金免疫层析检测板对添加乙基毒死蜱的蔬菜、水果、土壤、自来水等模拟样本中进行实验检测,以评价不同样品基质是否对这两种检测方法存在干扰以及干扰程度。
结果表明:
样品基质对酶免疫检测法的检测灵敏度有一定的影响,乙基毒死蜱标准品回收率在70%-90%之间;而对胶体金免疫层析检测板的检测灵敏度基本无干扰,最低检测限没有改变。
关键词:
有机磷农药、多种残留检测、单克隆抗体、胶体金免疫层析
Abstract
Inrecentdecades,Organophosphoruspesticides(OPs)arewidelyusedinagriculturalanddomesticsettings.ForanalysisofOPs,thetraditionalmethods,thin-layerchromatography(TLC),highperformanceliquidchromatography(HPLC)andGaschromatography(GC),withhighsensitivityandspecificityarelaboriousandexpensive.Therefore,thereisgrowingdemandformorerapidandeconomicalmethodsfordeterminingpesticideresidues.Immunoassaysthatcanmeetsuchdemandshaverecentlyemergedasafast,sensitive,andcost-effectivealternativetothetraditionalmethods.
Althoughmostoftheimmunochemicalassaysdevelopedforthedeterminationofpesticidesareaimedatdetectingindividualpesticides,themixofavarietyofpesticidesisusuallyappliedinfield.ThispaperselectedagenericHaptenthathasaO,O-DiethylthiophosphategroupcommoninOPsandconjugatedtheHaptentoBSAandOVArespectivelytogenerateanimmunogenandacoatingantigen.Animmunoassayforclass-specificdeterminationofOPsusingmonoclonalantibodies(mAb)againsttheHaptenwasdeveloped.
ThetitervalueofthemAbwas1×106byindirectenzymelinkedimmunosorbantassays(ELISA),whiletheoptimadilutionforELISAwas1:
16000.ThemAbshoweddesirablepropertiesforuseindeterminationbyindirectcompetitiveELISA.Thelimitofdetecting(LOD)valueofChlorpyriphos-ethylwas0.004μg/mL.TheLODvalueforparathion-methylwas0.063μg/mL.
Goldimmunochromatographyassay(GICA)isbasedonthedistributionofmoleculesinabiphasicsystem.Fortest,anaqueoussampleandthelabeledantibodymigratesbycapillaritytothetestzone.Thebindingoflabeledantibodytoimmobilizedantigenonsolidphaseleadstotheaccumulationofcolloidalgoldandthenaredcolorcanbeobservedrapidlybynakedeyes.Therearenoneedforfussyoperationsasincubation,washingandenzymaticreactionswhichdistinctlyshortenthedetectiontime.Especially,theresultscanbereaddirectlybynakedeyes,whicharemoresuitableforassayson-site.
Thispaperprepareduniformcolloidalgoldparticleswithadiameterof16.08±0.64nmbytheTannin-sodiumcitratereductionmethod,labeledmAbswiththisnano-goldandthenconstructedimmunochromatographic(IC)testingboards.TheICtestingboardwasvalidatedtocompleteadetectionassaywithin5minutes,andtheLODvalueofChlorpyriphos-ethylwas4μg/mL.
Toevaluatetheinterferencesfromcomponentsinvariouslyenvironmentalmatrix,samplesoffruits,vegetables,tapwaterandsoilspikedwithChlorpyriphos-ethylweretest.Theresultsshowedthatthepesticidecouldbedetectedandnointerferencewasobservedintherealsamples.
Keywords:
organophosphoruspesticides,multi-residuedetecting,monoclonalantibody,goldimmunochromatographyassay
目录
第一章绪论1
1.1有机磷农药使用现状及危害1
1.2有机磷农药残留检测方法及快速检测技术的研究现状2
1.2.1色谱法2
1.2.2快速检测法3
1.3农药残留酶免疫分析技术的国内外研究现状5
1.4胶体金免疫层析技术的研究进展6
第二章抗原合成与单克隆抗体的制备9
2.1材料与方法10
2.1.1主要试剂与仪器10
2.1.2实验动物11
2.1.3溶液系统11
2.2实验方法12
2.2.1半抗原合成12
2.2.2人工免疫原及检测抗原的制备13
2.2.3人工免疫原及检测抗原的鉴定14
2.2.4杂交瘤细胞株及单克隆抗体的制备15
2.2.5单克隆抗体鉴定15
2.3实验结果与分析16
2.3.1半抗原合成16
2.3.2人工免疫原及检测抗原的制备及鉴定17
2.3.3杂交瘤细胞株及单克隆抗体的制备20
2.3.4单克隆抗体的纯化与鉴定21
2.4讨论23
第三章有机磷农药多残留检测研究-竞争性酶联免疫吸附实验27
3.1材料28
3.2实验方法28
3.2.1抗体、抗原最佳工作浓度选择28
3.2.2间接竞争ELISA检测方法标准曲线的建立28
3.2.3样品添加回收率测定29
3.3实验结果与分析29
3.3.1抗体、检测抗原最佳工作浓度29
3.3.2间接竞争ELISA检测方法标准曲线的建立30
3.3.3样品添加回收率31
3.4讨论32
第四章有机磷农药多残留检测研究-
(2)胶体金标记侧向流免疫检测技术35
4.1材料36
4.2实验方法36
4.2.1胶体金制备36
4.2.2胶体金标记单克隆抗体36
4.2.3胶体金单克隆抗体结合物的免疫反应性鉴定37
4.2.4紫外-可见光谱扫描37
4.2.5荧光光谱分析37
4.2.6电镜鉴定37
4.2.7DLS分析38
4.2.8侧向层流胶体金免疫试纸条的制备38
4.2.9胶体金试纸条对毒死蜱标准液的反应38
4.3实验结果与讨论39
4.3.1胶体金单克隆抗体结合物的免疫性39
4.3.2紫外-可见光谱扫描结果40
4.3.3荧光光谱分析40
4.3.4电镜鉴定41
4.3.5DLS分析42
4.3.6胶体金试纸条对毒死蜱标准液的反应43
4.4讨论44
第五章小结47
参考文献49
发表论文和参加科研情况说明54
致谢55
缩略语表
英文全称
英文简称
中文全称
Antigens
Ag
抗原
Antibodies
Ab
抗体
Bovineserumalbumin
BSA
牛血清白蛋白
Colloidalgold
CG
胶体金
Dicyclohexylcarbodiimide
DCC
二环己基碳二亚胺
dynamiclightscattering
DLS
动态光散射
dimethylformamide
DMF
二甲基甲酰胺
Enzymeimmunoassay
EIA
酶免疫分析
Enzyme-linkedimmunosorbentassays
ELISA
酶联免疫吸附实验
Gaschromatography
GC
气相色谱
Highperformanceliquidchromatography
HPLC
高效液相色谱
Horseradishperoxidase
HRP
辣根过氧化物酶
Immunochromatography
IC
免疫层析
Massspectra
MS
质谱
Monoclonalantibodies
mAb
单克隆抗体
N-hydroxy-succinamide
NHS
N-羟基琥珀酰亚胺
Ovalbumin
OVA
卵清蛋白
Polyclonalantibodies
pAb
多克隆抗体
Phosphatebufferedsaline
PBS
磷酸盐缓冲盐水
Transmissionelectronmicroscope
TEM
透射电镜
Thinlayerchromatography
TLC
薄层色谱
Tetramethylbenzidine
TMB
四甲基联苯胺
Ultra-violet/visiblespectrum
UV-Visspectrum
紫外-可见光光谱
第一章绪论
1.1有机磷农药使用现状及危害
在现代农业生产中,农药以其快速、高效、经济等特点,成为农作物病虫害综合防治的重要手段,迄今为止没有其它手段可以完全代替。
与此同时,也带来日益严重的化学农药残留污染问题,残留农药通过污染自然环境、生物富集和食物链在动植物体内积贮,最终造成人类急性或慢性中毒。
随着人类物质生活水平的提高,农药残留的污染问题已引起普遍关注,各国对各种农副产品中农药残留都规定了越来越严格的限量标准。
在世界贸易一体化的今天,某些发达国家以农药最高残留限量为技术壁垒,限制对我国农副产品的进口。
严重污染食品的农药主要是有机磷、有机氯、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类的杀虫剂和除草剂。
世界上农药常用品种约500种,我国的农药品种只有200多种。
有机磷农药已有70多年的使用历史,并仍被广泛使用。
常用的有机磷农药有乐果、氧化乐果、甲胺磷、甲基对硫磷、对硫磷等。
由于有机磷农药对于防治农业病虫草害具有经济、高效、方便等特点,使其在农药中占有重要地位,并且在今后相当长一段时间内仍被广泛使用。
但是由于有机磷农药的高残留性,已经引起社会的高度重视,也制定了较为严格的限量标准,如有机磷农药在蔬菜中的最高残留国家标准。
根据美国《食品质量保护法》的规定,有机磷农药被美国环保局列为首先接受再登记和残留限量再评价的一类农药。
其中批准登记的有40种,久效磷、速灭磷等有机磷农药已被严格禁止施用。
有机磷农药主要抑制酯酶系统,特别是位于突触和红细胞膜上的乙酰胆碱酯酶以及血浆中的丁酰胆碱酯酶。
虽然急性丁酰胆碱酯酶受抑制不引起显著的临床症状,但乙酰胆碱酯酶的抑制,可导致乙酰胆碱大量蓄积,刺激位于自主神经系统、中枢神经系统和神经-肌肉连接处突触的乙酰胆碱受体,产生以下四类临床症状:
毒蕈碱样症状,包括支气管痉挛、气道分泌物增加、瞳孔缩小、流泪、流涎、呕吐、腹泻、尿失禁、低血压、心动过缓;烟碱样症状,有心动过速、瞳孔扩大、高血压、出汗;中枢神经系统症状,嗜睡、激惹、昏迷、呼吸衰竭;神经肌肉接头烟碱样症状有肌无力、瘫痪、肌束震颤。
有机磷农药可通过皮肤进入人体,在喷洒过程中产生的气雾可由呼吸道吸入,误服者可由消化道吸收。
急性有机磷农药中毒在我国非常多见,特别是在乡村地区县医院,几乎占急诊病人的1/10以上。
其原因在于我国是农业大国,有8-9亿人口在农村,另外,我国也是农药大国,几乎农用杀虫剂均含有机磷成分。
在生产过程中,因防护措施不力及农药容易获得、不易有效控制而常被用于自杀。
这导致有机磷农药中毒成为所有中毒事件中最为常见的一种,而且危害极大。
鉴于农药残留对人体健康危害极大,研究农药残留快速、高效的检测方法,加强食品中农药残留量的检测和监督管理对保证食品安全和人民生命健康具有重要意义。
1.2有机磷农药残留检测方法及快速检测技术的研究现状
我国农药残留分析检测始于上世纪50年代,其分析步骤一般包括样品的采集和保存、农药的提取和浓缩、试样的净化、农药的定性定量分析等。
最初的农药残留检测技术仅限于化学法、比色法和生物检测法,这些方法灵敏度低且缺乏专一性。
20世纪60年代气相色谱法(GC)应用于农药残留分析,大大提高了农药残留的检测水平,20世纪80年代以来,高效液相色谱法开始广泛应用于对热不稳定和离子型农药及其代谢物的分析,色谱法虽然定量准确、灵敏度高,但所需设备昂贵,需要专业人员操作,且分析时间长不利于现场监测。
近几年来,随着技术的不断进步,越来越多的分析检测方法涌现[1,2],目前用于有机磷农药残留的检测方法主要有两大类──农药残留快速检测法和色谱检测法。
农药残留快速检测法是一类快速检测农药残留的方法,主要用来阻止有机磷和氨基甲酸酯类农药残留严重超标的蔬菜和水果流入市场。
1.2.1色谱法
(1)薄层色谱法(TLC)
薄层色谱法无需特殊设备,简便易行,可同时分析多个样品,多用于复杂混合物的分离和筛选。
TLC通过使用特殊的显色剂观察斑点颜色以及使用Rf值进行定性检。
由于该方法灵敏度不高,近年来很少使用,多作为分离手段。
(2)气相色谱法(GC)
气相色谱法(GC)具有高选择性、高分离效能、高灵敏度、快速等优点,是目前应用最多的方法,占有关色谱法报道的70%以上。
凡是易气化、气化后又不发生分解等现象的农药均可采用气相色谱法检测。
我国食品理化检验国家标准方法采用了气相色谱检测有机磷农药,检出限为1ng[3]。
近年来,气相色谱联用技术发展迅速。
其中,气相色谱—质谱联用技术(GC-MS)得到了广泛的应用[4]。
它既有气相色谱的高分离性能,又有质谱准确鉴定化合物结构的特点,可达到同时定性、定量的目的,在农药代谢物和降解物检测方面具有突出优点。
(3)高效液相色谱法(HPLC)
高效液相色谱法(HPLC)可以分离及检测极性强、分子量大或离子型农药,尤其对不易气化或受热易分解的化合物更能显示出它的突出优点。
近年来,采用高效色谱柱、高压泵和高灵敏度的检测器、柱前或柱后衍生化技术以及计算机联用等,大大提高了液相色谱的检测效率、灵敏度、速度和操作自动化程度,现已成为农药残留检测不可缺少的重要技术,其缺点是溶剂消耗量大,检测器种类较气相色谱少,灵敏度不如气相色谱高。
1.2.2快速检测法
(1)酶抑制法
酶抑制法是一种相对成熟的快速检测技术,适合现场检测及大批样品的筛选。
在一定条件下,有机磷农药对乙酰胆碱酯酶的活性有抑制作用,因此可以利用农药靶标酶-乙酰胆用碱酯酶受抑制的程度来检测有机磷农药。
该法无须昂贵的仪器,操作简便快速,但灵敏度较差,重复性、回收率还需要进一步的提高。
很多学者利用乙酰胆碱对农药残留快速检测进行了大量研究,并开发了许多快速检测方式或方法。
通过酶抑制率判定蔬菜、果品及农产品中农药残留的存在情况。
利用纸片或电极作为载体将酶吸附,并制成速测箱,是一种快速、灵敏、经济的现场检测手段。
近年来,酶抑制技术进入了开发速测与应用的新阶段,美国堪萨斯研究所开发出一种称为农药检测器(Detector)的“酶片”(EnzymeTicket),该酶标签对乙酰胆碱酯酶的抑制剂灵敏,可用于测定水中有机磷和氨基甲酸酯农药,检测限在0.1~10mg/kg[5]。
近年来,我国自行研制的农药速测仪正向着体积小、重量轻、便携式、灵敏度高、重现性好、经济、简便、自动化程度高的方向发展。
李元光等成功研制了有机磷农药现场快速检测仪,该仪器响应时间为3min,对敌敌畏、对氧磷的线性检测范围分别为0.5~43.1μg/mL和0.1~15.0μg/mL[6]。
(2)化学发光技术
化学发光法利用发光物质鲁米诺、光泽精、洛酚、没食子酸和过氧草酸等与有机磷农药进行特殊的化学反应,在反应中吸收了释放出的化学能,而处于电子激发态的反应中间体或反应产物由激发态回到基态时产生光辐射[7]。
其中鲁米诺是最有效的化学发光物质之一。
化学发光法通过4个参数:
颜色、强度、产生速率及强度的衰减来表征。
pH值、试剂浓
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