浅论吡格列酮对糖尿病大鼠肾皮质血管内皮生长因子表达的影响.docx
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浅论吡格列酮对糖尿病大鼠肾皮质血管内皮生长因子表达的影响
浅论吡格列酮对糖尿病大鼠肾皮质血管内皮生长因子表达的影响
【摘要】目的:
探讨血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)在糖尿病大鼠肾皮质中的表达及PPARγ激动剂吡格列酮对其表达的影响。
方法:
①雄性SD大鼠经单次腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型,将糖尿病大鼠随机分为糖尿病组(DM组)、糖尿病吡格列酮干预组,并以正常组作对照。
②干预8周后,观察各组大鼠24h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐、血糖及血脂的变化;用免疫组织化学和逆转录PCR检测肾皮质VEGF蛋白及mRNA表达。
结果:
①DM组大鼠24h尿蛋白、BUN、Scr、肾皮质VEGF蛋白及mRNA表达均较NC组明显升高;DP组大鼠24h尿蛋白、BUN、Scr、肾皮质VEGF蛋白及mRNA表达较DM组均有降低。
②DM组血糖、血脂与NC组相比,差异有统计学意义,与DP组比较差异无统计学意义。
结论:
糖尿病大鼠肾皮质VEGF表达增强,吡格列酮可抑制糖尿病大鼠肾皮质VEGF的表达,减少尿蛋白,改善肾功能,延缓糖尿病肾病的发生、发展,发挥非降糖的直接肾保护作用。
【关键词】糖尿病肾病;吡格列酮;血管内皮生长因子
[Abstract]Objective:
Toinvestigatetheeffectofpioglitazoneontheexpressionofvascularendothelialgrowthfactorinthekidneyofdiabeticrats.Methods:
Diabeticmodelwasestablishedbyasingleinjectionofstreptozotocin(STZ55mg/kg),anddiabeticratswererandomlydividedinto2groups:
untreateddiabetesmellitusgroup(DMgroup),pioglitazonetreateddiabetesmellitusgroup(DPgroup10mg·kg-1d-1).Inaddition,thenormalratsservedasanormalcontrolgroup(NCgroup).Eightweekslater,thetwentyfourhoursurineproteinlevel,serumureanitrogen,serumcreatinine,bloodglucoseandserumtipidsweredetected.TheexpressionsofVEGFweredetectedbyimmunohistochemistyandReversetranscriptionPCR.Results:
ComparedwithNCgroup,thetwentyfourhoursurineproteinlevel,serumureanitrogenandserumcreatinineinDMgroupweresignificantlyincreased,andtheexpressionofVEGFwassignificantlyhigher.ComparedwithDMgroup,thetwentyfourshoururineproteinlevel,serumureanitrogenandserumcreatinineweresignificantlydecreasedinDPgroup,whiletherewasasignificantreductioninboththeVEGFandtheVEGFmRNAexpressionaftertreatmentgroup.BloodglucoseandserumlipidsprofileweresignificantlychangedinDMgroupcomparedwithNCgroup,whiletheyhadnosignificantdifferencebetweenDMgroupandDPgroup.Conclusion:
TheseresultssuggestthattheexpressionofVEGFisincreasedinthekidneyofSTZinduceddiabeticrates.PioglitazonecanreducetheexpressionofVEGF,andtheexcretionofurineprotein,andtoamelioraterenalfunction,whosemechanismmaybesomedirectnephroprotectiveeffects.
[Keywords]diabeticnephropathy;pioglitazone;vascularendothelialgrowthfactor糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是严重的糖尿病微血管并发症,早期就会出现肾脏微血管内皮细胞的损害,其发生和发展与许多生长因子的异常表达密切相关,其中血管内皮生长因子是一种内皮细胞特异性的丝裂原。
VEGF在2型糖尿病大鼠模型肾组织中表达异常增高[1],提示VEGF可能参与了DN发病机制。
有实验研究发现PPARγ激动剂在改善糖代谢的同时,可降低尿白蛋白排泄,减轻肾小球硬化,具有潜在的肾保护作用[2]。
但PPARγ激动剂吡格列酮是否通过抑制肾皮质VEGF的表达而阻遏DN的发生、发展尚不清楚,本研究旨在观察吡格列酮对糖尿病大鼠肾皮质VEGF表达的影响,进一步探讨吡格列酮对肾脏的保护作用。
1材料与方法
动物模型的建立与分组
健康雄性SD大鼠36只,体质量g,随机分为3组,每组12只:
对照组(NC组),糖尿病组,吡格列酮干预组(10mg·kg-1·d-1,江苏恒瑞药业提供)。
禁食24h后,DM及DP组单次腹腔注射链尿佐菌素;NC组单次腹腔注射同等剂量的枸橼酸缓冲液。
72h后采尾静脉血,以美国强生血糖仪测定血糖,高于mmol/L者入组。
DP组予以吡格列酮混悬液灌胃,NC,DM组予以相应量生理盐水灌胃。
标本收集
干预8周后,处死大鼠。
处死前代谢笼收集24h尿,记尿量,待测尿蛋白。
处死当天尾静脉采血测血糖,以氯胺酮腹腔注射麻醉各组大鼠,心脏取血3ml,分离血清,待测血肌酐、血尿素氮及血脂。
肾脏经生理盐水灌洗后除肾包膜测肾重,肾脏肥大指数(KI)以肾重/体质量×1000表示。
右侧肾脏-70℃冻存以备逆转录PCR检测。
左侧肾脏取部分肾皮质于4%低聚甲醛固定,石蜡包埋,制成4μm切片,以备肾脏病理检查及免疫组织化学检测。
血、尿标本检测
用日本爱科来GT1810型血糖仪尾静脉采血测定血糖,用日本奥林帕斯AU2700全自动生化分析仪测定血脂、血Cr、血BUN,用双缩脲法测定24h尿蛋白。
免疫组织化学检测
所有标本按常规方法固定,包埋,切片厚4μm,行HE染色。
采用EnVision法检测肾组织中VEGF。
石蜡切片脱蜡至水后加抗原修复液,滴加兔抗大鼠VEGF抗体(1∶200,博士德公司),4℃过夜,加生物素标记的羊抗兔二抗,滴加新配制的ABC复合物、DAB显色剂,苏木精复染,脱水,透明,甘油明胶封固,以PBS代替一抗为阴性对照。
胞质棕色为阳性着染。
先低倍镜下观察,然后在200倍光镜下,随机分别采集皮质区30个视野内的肾小球,用全自动图像分析系统(Imageproplus)分别计数其积分光密度值,取其均值分析。
RTPCR测定肾皮质VEGFmRNA
从大鼠右侧肾脏取肾皮质100mg,采用Trizol严格按照说明书步骤要求提取总RNA,参照逆转录试剂盒操作规程合成20μlcDNA,PCR扩增VEGF基因片段。
PCR扩增反应条件:
94℃预变性,94℃变性40s,54℃~59℃退火40s,72℃延长1min,共30个循环,72℃10min。
引物序列为VEGF:
上游5′GACCCTGGTGGACATCTTCCAGGA3′,下游5′GGTGAGAGGTCTAGTTCCCGA3′,462bp;以β肌动蛋白作为内参照,上游5′CTCGCGCTACTCTCTCTTTC3′,下游5′CATGTCTCGATCCCACTTAAC3′,330bp;由上海生物工程公司提供。
反应后扩增产物在含mg/L溴乙啶的%琼脂糖凝胶中电泳分离,于凝胶成像仪上扫描定量。
统计分析
应用软件,计量数据用(±s)表示,各组间均数差异比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法。
为差异有统计学意义。
2结果
大鼠24h尿蛋白及一般状况的变化
DM及DP组12只大鼠均成模,实验8周末,DM组及DP组各死亡2只大鼠。
DM组和DP组体质量(BW)下降、肾脏肥大指数(KI)、血糖(BG)及尿蛋白增高,与NC组相比,差异均有统计学意义,DP组较DM组KI及24h尿蛋白均有下降,差异均有统计学意义。
见表1。
大鼠血BUN、血Cr及血脂的变化
8周末DM组和DP组大鼠血BUN、血Cr、三酰甘油及总胆固醇均较NC组增高,差异有统计学意义;DP组与DM组大鼠比较,血BUN、血Cr降低;DP组与DM组大鼠TG,TC差异均无统计学意义。
见表2。
表1各组大鼠一般指标的变化表2各组大鼠肾功能及血脂的变化
免疫组化结果
NC组大鼠肾小球及小管均少见或未见VEGF蛋白表达颗粒;与NC组相比,DM组大鼠肾小球细胞胞质及部分肾小管上皮细胞胞质均可见棕黄色颗粒,颜色加深且数量增多,肾皮质VEGF蛋白表达显着上调;DP组肾小球细胞胞质中棕黄色颗粒较DM组明显减少,VEGF蛋白表达较DM组明显下调,但仍强于NC组。
见图1。
DM组大鼠肾皮质VEGF蛋白IOD均值显着高于NC组,。
DP组大鼠肾皮质VEGF蛋白IOD均值较DM组明显降低,;但仍高于NC组,。
RTPCR结果分析
DM组大鼠肾皮质VEGFmRNA表达比NC组(±)明显增加,。
DP组大鼠肾皮质VEGFmRNA表达低于DM组,;但仍高于NC组,。
见图2。
3讨论
DN早期许多细胞因子参与肾脏病理生理发病机制,其中血管内皮生长因子在糖尿病并发症中的作用已经引起了人们的重视。
因此研究糖尿病肾病肾皮质足细胞中VEGF表达变化,成为探讨糖尿病肾脏早期发病机制新的研究方向。
VEGF在肾脏主要由足细胞产生,在正常肾脏中呈低水平表达,VEGF特异作用于血管内皮细胞,具有增加微小静脉通透性、促进血管生成和维持血管功能等作用,可以促进血管发生及形成,内皮细胞增殖、迁移,增强血管通透性[3]。
研究表明高于生理浓度的VEGF促进肾小球毛细血管内皮细胞分裂,促进新生血管的生成,增加了肾小球滤过面积,同时促进内皮细胞释放纤溶酶原、胶原酶等血管活性物质,使内皮细胞之间孔隙增加,并增加了血管内皮产生扩血管因子氧化亚氮,增加了毛细血管对大分子物质的通透性,导致尿蛋白形成[4];VEGF在肾脏的高表达可以增加肾小球系膜外基质的堆积,使系膜增厚,进一步加剧了尿蛋白生成,给STZ诱导的糖尿病大鼠注射VEGF单克隆抗体可以有效阻断VEGF活性,大鼠肾脏高滤过,尿白蛋白排泄以及肾小球肥大明显得到抑制[5
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- 浅论吡格列酮 糖尿病 大鼠 皮质 血管 内皮 生长因子 表达 影响