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碳纳米管在肿瘤诊断与治疗研究中的新进展

碳纳米管在肿瘤诊断与治疗研究中的新进展

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【摘要】碳纳米管具有独特的结构及性质，被广泛应用于生物医学领域。

本文对碳纳米管在生物医学特别是肿瘤早期诊断以及治疗方面的研究现状进行了综述，分析了现有的研究特点，并展望了该领域的发展趋势。

【关键词】碳纳米管,碳纳米角,生物医学,肿瘤,诊断,治疗，评述1引言　　碳纳米管（CNTs）自1991年被发现以来[1]，以其独特的结构以及优异的热学、电学和力学性质如较大的比表面积、良好的传热性、导电性及较高的机械强度引起广泛关注，成为纳米材料领域的研究热点。

大量的研究工作表明，碳纳米管在电子器件、复合材料、储氢材料、催化剂载体、分子吸附剂、化学和生物传感器等方面均具有巨大的应用潜力。

近年来，碳纳米管应用在生物医学特别是在药物载体上的研究逐渐成为新热点[2～6]，随着肿瘤发病率的逐年上升，虽然治疗手段有所进步，生存率有所提高，但死亡率仍然居高不下，而传统的诊断及治疗手段仍然存在不少缺点。

因此，需要更为有效安全的手段以实现肿瘤的早期诊断以及治疗[7～10]。

本文综述了碳纳米管在生物医学领域特别是肿瘤早期诊断和治疗的研究现状，分析了现有的研究特点，并展望了这一研究领域的发展趋势。

　　2肿瘤细胞诊断　　2.1磁共振成像　　磁共振成像（MRI）技术中造影剂（CAs）的应用越来越广泛，以其磁性的不同可分为3大类：

顺磁性、超顺磁性和铁磁性物质，而基于碳纳米材料的磁共振成像造影剂研究主要集中在前两类。

　　2.1.1顺磁性顺磁性造影剂以钆的螯合物为主，由于具有未成对电子使Gd3+具有顺磁性，从而缩短周围水中质子的纵向弛豫时间。

Hashimoto等[11]报道了一种把Gd3+选择性地沉积在碳纳米角亲水性孔洞的新方法（图1a）。

碳纳米角（CNHs）是一种特殊的单壁碳纳米管（SWNTs），具有圆锥型的帽状末端并以放射型聚集状态存在。

由于帽状末端以及管壁存在着缺陷，可以通过氧化作用破坏碳管造成空洞从而使Gd3+以氧化物形式聚集在碳纳米角的中央[11]。

Sitharaman等[12]进行了相似的研究，把CdCl3沉积到超短的SWNTs内部（图1b），其弛豫度为商用造影剂的40～90倍，其成像性能的极大提高　　图1GdoxNH的透射电镜图（a）[11]和Gd3+n@UStubes的高分辨透射电镜图（b）[12]　　Fig.1（a）TEMimageofgadoliniumoxidizednonohorns（GdoxNH）[11]and（b）highresolutionTEMimageoftheGd3+@ultrashotnanotubes[12]推测为碳管对管内金属离子簇合物的限制作用而引起。

后续的研究[13]证明，该复合物在pH7.0～7.4范围内其弛豫度对酸碱度极其敏感。

由于癌组织与正常组织之间pH值存在差异，因此，有望应用于肿瘤的早期诊断。

Richard等[14]则把两性的金属钆螯合物吸附在多壁碳纳米管（MWNTs）上。

该复合物不仅具有阳性造影剂的顺磁性，在动物实验的T2权重图像中还造成信号的负增强，推测为碳管管壁电子的运动造成磁矩而使碳管本身带磁感而引起。

由于碳纳米管的长度较大，为了达到分子影像学的要求，碳纳米管的长度需要减短，以便于细胞的吸收，提高生物相容性以及实现最终在生物体内的消除。

　　2.1.2超顺磁性超顺磁性铁氧化物（SPIO）由于具有较大的磁化率以及较低的毒性同样受到广泛的关注。

Miyawaki等[15]把Fe3O4沉积到氧化的碳纳米角的表面形成超顺磁性的碳纳米角。

动物实验表明，磁性纳米角在磁共振成像中信号显著减弱，且信号在脾脏以及肾脏随时间变化。

当剂量在8mg/kg以下对小动物未表现任何毒性。

磁共振成像技术虽然具有较高的空间分辨率，但较低的灵敏度限制了其在生物医学以及分子成像领域的应用，开发具有更高成像性能的造影剂成为一条有效途径。

借助其良好的传递能力和对造影剂分子特殊的空间限制作用，碳纳米管在磁共振成像中具有广阔的应用前景。

　　2.2近红外成像　　由于生物体在近红外光区（NIR）基本上不产生荧光，而SWNTs却能产生较强烈的荧光，因此能在复杂的生物体环境中被检测。

文献[16,17]证明，SWNTs进入细胞以后仍然能够观察到其近红外荧光信号，借此可研究碳管在注射入小动物以后的药物动力学行为[18]，而碳管本身的拉曼光谱信号及荧光信号的改变能在不影响细胞的正常生长的情况下作为标记物长达3个月之久[17]。

Choi等[19]以DNA包裹碳纳米管铁氧化合物的复合物，构成了具有磁共振成像以及近红外荧光成像能力的双功能化合物，经该复合物孵化的小鼠巨噬细胞不仅具有MRI信号，而且借助进入细胞内部的碳纳米管的近红外荧光能清楚观察到细胞的边界。

除了活细胞，碳管的近红外荧光还可以应用在活体成像上。

Leeuw等[20]利用SWNTs所发射独特的近红外荧光，对果蝇活体内分布的SWNTs进行非破坏性成像（图2）。

实验结果证明，摄入的SWNTs对果蝇没有不良生理影响。

Welsher等[21]在SWNTs表面分别修饰了Rituxan和Herception两种抗体,特异性地对表面具有相应受体的细胞进行近红外成像，结果显示在限制了碳管对生物体的非特异性键联的情况下，由于抗体的存在，受体表达差异的不同细胞的近红外信号具有较大的对比。

由于SWNTs的近红外荧光源自碳管本身的结构，图2（a）果蝇幼虫消化道内的SWNT和（b）果蝇幼虫消化道内含SWNT的食物的近红外荧光图[20]　　Fig.2NIRimageofSWNTsinthegutofalivinglarva（a）andBolusesoffoodcontainingSWNTsinaloopofthegutofalivinglarva（b）[20]因此不需要对碳管修饰其它荧光基团，同时具有较高的抗猝灭以及抗光漂白性能。

然而，SWNTs的近红外荧光要求碳管本身的结构完整，同时碳管需要呈单分散，因此只能以非共价作用力修饰碳管，这在一定程度上限制了其应用，可保证碳纳米管对近红外的吸收的更有效的修饰方法还有待研究。

　　2.3正电子发射断层扫描　　传统的医学影像技术显示的是疾病引起的解剖和结构变化，而正电子发射断层扫描（PET）技术显示的则是人体的功能变化，特别适用于在没有形态学改变之前、早期诊断疾病、发现亚临床病变以及评价治疗效果。

目前在肿瘤、冠心病和脑部疾病这3大类疾病的诊疗中尤其显示出重要的价值。

早期研究[22,23]证明PET可用于跟踪碳纳米管在活体中的分布。

Liu等[24]以放射性核64Cu标记并以带RGD肽段的磷脂通过非共价作用力修饰SWNTs，从而对癌细胞进行靶向，在荷瘤动物实验中发现碳管能特异性的累积在癌细胞部位，从而呈现PET信号。

McDevitt等[25]研究了以86Y标记的SWNTs在活体中的分布行为（图3），并通过共价键合放射性金属螯合物，荧光基团以及特异性识别肿瘤细胞的单克隆抗体，从而实现对肿瘤细胞的选择性多功能标记[26]。

通过修饰的方法使碳管表面具有放射性信号，同时碳纳米管具有较强的进入细胞的能力，结合PET显示功能性变化的优点，可望应用于疾病的早期发现、诊断。

　　3肿瘤细胞治疗　　3.1载体　　碳纳米管能携带肽段、蛋白以及核酸等生物活性分子进入细胞而对细胞不产生毒性，因此可以作为一种治疗肿瘤的有效载体。

　　3.1.1肽段肽段在分子生物学中有着重要的作用。

研究证明，肽段可共价键合到SWNTs表面并保持其免疫学性质[27,28]。

同时，肽段的存在可使碳管呈分散状态，从而应用到生物医学领域[29]。

2004年Pantarotto[30,31]首次利用共聚焦荧光显微镜观察经荧光标记的SWNTs将小肽段携带进细胞的过程，这一开创性工作为随后该领域的众多研究奠定了基础。

　　3.1.2蛋白蛋白质可以通过非共价作用力[32]或共价作用力[34]连接在SWNTs表面，并可通过表面活性剂和聚合物对碳管的功能化来抑制蛋白在碳管表面的非特异性吸附[33]。

Kam等[34]在SWNTs表面共价键合biotin并与荧光标记的streptavidin作用，发现该复合物能有效的把蛋白质以细胞内吞作用方式带进细胞，不同的蛋白质能以非特异性作用吸附在经酸处理的碳管表面，进入细胞后更能够发挥其生物学功能[35]。

碳纳米管进入细胞的机理目前还不尽清楚，普遍存在两种观点：

与能量无关的主动插入扩散过程[30]和与能量有关的细胞内吞过程[34～36]。

　　3.1.3核酸核酸在生物医学方面有极重要的作用。

现已发现近2000种遗传性疾病都和DNA结构有关，肿瘤的发生、病毒的感染、射线对机体的作用等都与核酸有关。

通过共价键可以把核酸连接在碳管表面[37～39]，并能选择性的对具有互补序列的DNA分子进行杂交[38,39]。

　　功能化碳纳米管能通过静电作用与质粒DNA结合并以较低的毒性穿透细胞膜从而被细胞吸收[40,41]，结合DNA的量则与碳管的表面积以及其所带的静电荷有密切关系[42]。

Bianco的研究[43]证明，SWNTs能有效地携带含CpG基序的寡聚脱氧核苷酸CpGODN到目标细胞并能增强其免疫激活功能。

此外，利用外磁场的驱动力诱导含镍的碳纳米管可有效的携带质粒DNA进入细胞，其转染效率可达到过滤性病毒载体技术的水平[44]，而该方法同时具有相当高的生物相容性[45,46]。

通常，DNA在碳管上的固定是通过静电作用力完成的，因此只能形成亚稳定状态的复合物，同时其转染效率与碳管表面的化学基团的性质有很大的关系[47]。

应用聚乙烯亚胺（PEI）、聚酰胺（PAMAM）等聚合物可以解决以上问题。

Liu等[48]利用聚PEI使DNA牢固的结合在MWNTs表面，其转染效率比PEI高3倍，而比单独的DNA高4个数量级。

潘碧峰等[49]探讨了碳纳米管PAMAM树形分子递送Survivin反义寡核苷酸ASONDs进入肝癌细胞及其对肝癌细胞增殖的影响，发现该复合物是高效的基因载体，并能有效抑制癌细胞的增殖。

Jia等[50]把经量子点修饰的ASODNs与经PEI修饰的MWNTs管作用，构成集治疗以及跟踪标记的双功能复合物。

实验结果显示，该复合物具有较高细胞传送效率、细胞核定位及转染效率。

　　碳纳米管同样可作为RNA的载体。

Lu等[51]通过放射性同位素标记表征以SWNTs为载体将RNA聚合物poly（rU）带进细胞的过程。

由于RNA聚合物与碳管是通过非特异性作用结合的，因此可以实现细胞内RNA的释放。

从不同深度的共聚焦显微镜图片可以发现，图4HeLa细胞（a）空白对比和（b）经SWNTsiRNA孵育后的共聚焦显微镜图[52]　　Fig.4Confocalimageof（a）untreatedcontrolhenriettalacks（HeLa）cells（b）HeLacellsincubatedwithSWNTsmallinterferingribonucleicacid（siRNA）[52]该复合物穿越了细胞膜以及核膜表面。

通过特殊的化学键修饰，可以在细胞内的酶解下实现生物分子的可控性释放。

Kam等[52]利用二硫键在酶催化下裂解的性质，在SWNTs表面修饰了DNA及siRNA等生物分子，在细胞中实现DNA的传送、释放及核转染，并实现对siRNA的高效传递以达到对细胞内特殊蛋白的基因沉默作用（图4）。

随后在此基础之上键合能使细胞膜受体CD4及细胞核受体CXCR4、CCR5发生基因沉默的RNA。

该类受体是与HIV病毒相关的重要受体，以碳纳米管作为siRNA的载体的传递能力远远超过脂质体等几种现有的非过滤性病毒转染剂，其转染效率与碳管表面的化学基团以及亲水性有关[52]。

以碳管实现siRNA的传递同样能抑制肿瘤细胞的生长。

Zhang等[54]在碳管表面键合正电荷基团，与带有负电荷的端粒酶逆转录酶TERTsiRNA通过静电作用形成复合物，提高siRNA在细胞内的稳定性以及导入细胞的效率，起到沉默免疫调节细胞中的靶基因的功效，并能在动物体内携带siRNA从而抑制肿瘤细胞的生长和增殖。

　　3.1.4药物碳纳米管作为药物分子的载体的研究对于提高许多药物的药理学性质具有重要意义。

Murakami等[55]利用氧化的碳纳米角为抗炎性糖皮质激素地塞米松（DEX）的载体，成功地将DEX吸附在碳纳米角上并在细胞中释放。

Venkatesan等[56]研究了碳纳米管在内的多种多孔纳米材料对促红细胞生成素（EPO）吸附性能，动物实验发现，在适当的表面活性剂的存在下碳管对EPO具有最高的吸附性能以及生物药效。

Bianco等在MWNTs表面键合荧光素（FITC）和两性霉素（AmB），发现AmB能被有效的传递入细胞并保持其高度的抗真菌活性[57]，随后的研究工作以相似的方法键合抗肿瘤药物甲氨蝶呤（MTX）并成功导入细胞内[58]。

Yu等[59]以促性腺素释放素（GnRH）修饰MWNTs并验证了其对前列腺癌细胞的杀灭性能。

Feazell等[60]在SWNTs表面键合了四价铂的配合物，随后把配合物传递进细胞并借助细胞内的低pH值环境还原四价铂，释放出具有毒性的抗癌药物顺铂（Cisplatin），其传递效率是顺铂的6～8倍。

后续研究是在铂的配合物上分别修饰叶酸以及碳管，特异性地对癌细胞进行杀灭，其传递效率比铂的配合物高两个数量级[61]。

除了可以把抗癌药物修饰在碳管外表面，还可以通过纳米沉淀技术填充到碳纳米角的内部，其抗癌效果比顺铂高4～6倍[62]。

除了叶酸，生物素同样可作为靶向基团修饰碳纳米管。

Chen等[63]以生物素修饰的SWNTs将紫杉醇类毒素（Taxoid）特异性地携带进癌细胞，并利用可断裂的化学键成功地在细胞内释放。

由于功能化碳管仍具有较大的憎水性表面，可与具有芳香环的分子以π堆积超分子作用力形成复合物。

Liu等[64]把抗癌药物亚德里亚霉素（DOX）与SWNTs分别形成共价与非共价复合物，结果表明，碳管对DOX比传统的脂质体具有较高的药物填充效率，并且在酸性环境下能快速释放，其结合以及释放的行为与碳管的直径相关。

同时通过键合具有靶向作用的RGD肽段，该复合物对RGD受体正表达的细胞具有较高的传递以及破坏能力。

AliBoucetta等[65]以MWNTs进行了相似的研究，同样证明了碳管能提高DOX对癌细胞杀伤效率。

　　3.2热破坏与放射治疗　　碳纳米管同样有望应用到硼中子俘获治疗（BNCT）技术中。

BNCT是一种放射治疗技术，利用超热中子射线与预先注入体内并富集在肿瘤部位的特殊化合物中的硼元素发生强烈的核反应，释放出杀伤力极强而射程很短的射线，从而特异性地杀灭癌细胞。

Zhu等[66]将取代的碳硼烷共价修饰在SWNTs表面，经静脉注射入荷瘤小鼠后能特异性的聚集在肿瘤部位并优先被肿瘤细胞吸收。

BNCT的应用需要在碳管上修饰带硼的基团或化合物在碳管上直接掺杂硼形成硼取代的碳纳米管可能获得更好的稳定性。

　　如前所述，SWNTs在近红外光区不仅能发出较强的荧光同时还有较强的吸收，除了有望应用在肿瘤诊断以外，还具有肿瘤治疗的潜在可能。

Kam等[67]报道SWNTs在近红外光下可以快速释放多余的能量，形成细胞“炸弹”，由于大部分癌细胞表面叶酸受体的表达远远高于正常细胞，通过在碳管表面修饰叶酸，并对正常细胞进行近红外线扫射，可在对正常细胞不造成伤害的情况下特异性的引起癌细胞的死亡（图5），达到靶向治疗的效果。

除了近红外光，碳纳米管还可以吸收无线电波并放出热量从而对肿瘤细胞进行破坏。

Gannon等[46]研究了碳管对无线电波的吸收而引起的热效应在不同癌细胞中的作用，并向动物的肝脏肿瘤注射经修饰的SWNTs，用无线电波对碳管进行加热，成功地杀灭了肿瘤细胞，而对附近的健康细胞只造成了很少量的伤害。

体外活细胞以及动物活体实验的结果表明，碳管对癌细胞以及正常细胞的生长没有明显的影响，有望应用于癌症射频消融术（RFA）治疗中，而下一步的研究则需要集中在靶向治疗方面。

　　图5经近红外激光照射后的（a）HeLa细胞和（b）正常细胞的光学图片，经SWNT孵育后的（c）HeLa细胞和（d）正常细胞的共聚焦荧光图（放大倍数:

×20）[67]　　4展望　　综上所述，由于碳纳米管具有独特的一维结构，其外表面除了可以非共价力吸附各种分子，还可以键合多种化学基团以实现增溶及靶向，其内部空间则可以包埋离子以及小分子，并且能以最小的毒性穿越细胞膜，因此在生物医学，包括药物传递、分子影像、基因治疗等方面具有较好的应用前景。

当前，大部分研究集中在将碳纳米管作为一种有效的肿瘤细胞载体来传送造影剂、药物以及具生物活性的分子，同时碳管能吸收特殊的激光以及射线进而转化成热量来破坏肿瘤细胞。

后续研究的重点则应该集中在使碳纳米管特异性的针对肿瘤细胞的诊断与治疗，这就需要提高碳管的靶向作用，同时需要深入了解碳管进入细胞以及动物体内后的动态分布以及药理性质。

碳纳米管的应用给肿瘤的诊断与治疗带来了新的机遇。

然而，包括碳管在内的纳米材料的安全性仍然值得高度的重视，如何合理安全的利用则面临着新的挑战。

纳米材料对人体和环境的毒性以及其机理仍然在研究之中，这就要求在临床以及实际应用之前，需要充分考虑其生物相容性、细胞毒性、相关作用机理及防御措施，为更有效的应用奠定基础。

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