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玉林中学论文重点讲义资料
题目:
矮岩羊GDF9基因突变对家养动物驯化的指导作用
作者:
秦鑫旺、程焱、黄焰、崔祯睿、鄢飞鸿
指导老师:
彭确昆
完成日期:
2013年8月
摘要:
目前,宠物市场上的家养动物,比如家猫,家狗等,它们的品种繁多,体型,毛色变化也是多种多样。
这些多变的外形不仅给现代人类的生活增添了丰富的色彩,还给人们研究哺乳动物形态变异提供了很好的模型。
从文献资料得知,狗是在一万年前,由狼经过人工驯养而得来,在经过长期的人工杂交和选择的过程中,根据人类的嗜好演化出来形态多样的品种,但是所有的这些狗都是属于同一个物种。
目前,狗的体型大小变异的主要因素还是与生长发育密切相关的基因突变导致的,比如IGF1、GHR等。
在四川西部的旅游途中,我们无意中认识了一种神秘的高山羊族动物—岩羊。
它有着矫健敏捷的身姿,可以任意攀爬在悬崖峭壁之上,而且更为奇特的是在岩羊物种内部有着一群体型矮化的特殊群体—矮岩羊。
这些矮岩羊有别于其他的普通岩羊,它们体型矮小,生活海拔较低。
这立刻让我们想到了家狗中也存在着同样的现象。
同样作为哺乳动物的狗与岩羊,它们体型变异的原因是否一样呢?
于是,我们决定从狗的体型变异角度来探寻矮岩羊体型变异的奥秘。
我们从与哺乳动物体型变异相关的若干个基因出发,筛选了一系列的SNP以及Indel位点。
意外之中,我们在GFD9基因的3'-UTR序列中发现了一个与体型关联性很高的突变位点。
该突变位点是一个17个碱基的删除,特异性地发生在矮岩羊GDF9基因的3'-UTR,而岩羊该位置则是完整型的。
由于该缺失发生在GDF9基因中,该基因是哺乳动物形态发育的关键基因,它可以调节下游的SMAD基因。
SMAD基因的表达情况则直接调控着动物的体型发育。
由此推测,我们认为该突变与矮岩羊体型的发育有着一定的联系。
该突变位点的发现,不仅可以清楚地阐明矮岩羊体型变异的遗传机制,对于宠物的人工驯化和定向培养有一定的借鉴作用。
人工驯养的宠物,比如猫和狗,和岩羊同为大型哺乳动物,调控体型发育的基因类似。
因此,GDF9基因的突变很有可能也存在与这些家养哺乳动物中。
我们通过检测这些家养动物的GDF家族基因可以初步预判其体型变异的趋势,这对于我们人工筛选小体型的宠物有着一定的指导意义。
关键词:
矮岩羊体型变异宠物驯养GDF9基因
1.前言
暑假期间,我们同学五人一行来到了成都宠物市场,打算买几只小狗回家喂养。
我们发现在宠物市场上有大量的形态各异的宠物狗。
有大的藏獒、金毛,小的吉娃娃、泰迪等,这些宠物狗的体型,体色差异很大。
为什么这些狗的体型千姿百态呢?
当时这一疑问深深存在我们的脑海里。
于是,带着这个疑问我们通过网络查阅了该问题。
原来宠物狗的背后隐藏着很多的科学问题。
狗是在一万年前,由狼经过人工驯养而得来,在经过长期的人工选择的过程中,根据人类的嗜好演化出来形态多样的品种,但是所有的这些狗都是属于同一个物种。
此问题立刻让我们想到了上半年在去川西旅游的途中,听导游说在川西的岩壁上生活着一种生命力顽强的山羊—岩羊。
并且在巴塘县一带生活着一些很独特的体型矮小的岩羊,这些矮岩羊有别于其他的普通岩羊,它们体型矮小,生活海拔较低。
这一现象让我们立刻想到了狗体型变异的例子。
同时作为哺乳动物的狗与岩羊,它们体型变异的原因是否一样呢?
随后,我们通过四川大学电子图书馆查阅了大量的文献,得知狗体型的矮化与基因的变异存在直接关系。
在犬科动物中,IGF1基因的突变直接导致了狗体型的矮化。
Sutteretal(2007)通过在骨骼尺寸变化较大的葡萄牙水犬(Portuguesewaterdogs)中对比个体DNA差异,发现小体型狗和大体型狗个体之间在IGF1基因中存在有差异的基因组区域。
研究人员推测,在狗驯化历史早期出现的一个基因突变,产生了“小狗”版的IGF1,并随着驯化过程逐渐在小体型狗中固定下来。
此外,研究者们在小体型的狗与中东灰狼IGF1基因中发现了一个共同的短的插入元件(SINE)和一个SNP位点,这说明小体型的狗来起源于中东灰狼的祖先,在早期的人类驯养时期,这些突变就在小体型狗的基因组中固定了下来[1]。
虽然矮岩羊与岩羊的系统发育关系显示二者的亲缘关系非常近,但是二者之间显著的形态差异让研究者对于矮岩羊的体型矮化机制也一直存在疑问。
从已有的生态资料来看,来自四川的矮岩羊已经形成了独立的种群,并且它们的矮化特征相对比较稳定,即这种矮化特征能够在种群中得到稳定的遗传。
因此,我们推断这种体型变异现象背后可能隐藏着较为稳定的遗传变异。
基于对哺乳动物体型矮化的遗传机制研究发现,导致哺乳动物体型矮化变异的主要因素则是与生长发育密切相关的基因突变。
这些与生长发育相关的基因主要来自GH/IGF1生长轴(GrowthHormone/Insulin-LikeGrowthFactor1axis),以及TGF-β(Transforminggrowthfactor-β)超家族等一些重要的基因家族。
这些与生长发育密切相关的重要基因很大程度上决定了哺乳动物的形态变异,因此,这些基因也成了我们研究矮岩羊体型变异的出发点。
这些基因主要调节动物的骨骼、肌肉、生殖以及体色的发育。
研究发现,这些基因中的一些突变,往往引起了相关蛋白表达的异常,从而导致了动物表型变异。
GDFs(Growthdifferenciationfactors)亚家族(TGF-β超家族中的一个重要亚家族)中的诸多基因对于动物的体型发育也有着至关重要的作用。
在小鼠中,GDF8基因的敲除(肌生成抑制蛋白)可以显著地导致骨骼肌的增大,这说明GDF8对肌肉和骨骼的发育具有负调控[2]。
由此可见,这些与生长发育密切相关的重要基因很大程度上决定了哺乳动物的形态变异。
因此,这些基因也成了本论文研究矮岩羊体型变异的出发点。
本研究我们从GDF亚家族中筛选了若干个基因,并分别测定了4个岩羊和4个矮岩羊个体的GDF基因序列。
通过比对该序列,我们试图从这些基因序列差异中找到一些与矮岩羊体型变异相关的分子证据。
2材料和方法
2.1材料
本论文所采用的岩羊样本来自四川省甘孜州和巴塘县,包括4个岩羊和4个矮岩羊肌肉样本。
2.2方法
2.2.1岩羊基因组DNA的提取
(1)取约50mg岩羊肌肉,放入1.5ml的离心管中;
(2)加入500μL裂解缓冲液(10mmol/LTris-Cl;0.1mol/LEDTA;0.5%SDS;pH8.0),加入蛋白酶K至终浓度100μg/ml,混合均匀;
(3)55oC水浴过夜,同时慢速振荡,直到消化液变清亮为止;
(4)加入与消化液等体积的饱和酚,缓慢颠倒10min直至两相混合成乳浊液,室温13,200rpm离心10min,用小枪头缓慢将黏滞的上清液移至另一离心管;
(5)加上清等体积的苯酚/氯仿异戊醇(25:
24:
1),缓慢颠倒10min直至两相混合成乳浊液,室温13,200rpm离心10min,转移上清;
(7)加上清等体积的氯仿,上下颠倒数分钟,13,200rpm离心15min,转移上清;
(8)加上清体积2倍的冰乙醇,1/5体积醋酸铵,上下颠倒数分钟,然后-20oC放置30min;
(9)12000rpm5min,用75%的乙醇洗涤沉淀2次,风干,加适量的MiniQ溶解沉淀。
2.2.2PCR扩增和产物检测
我们根据GenBank中岩羊线粒体GDF9基因(FJ207537)设计了扩增岩羊的GDF9基因的全长序列(1140bp)引物。
引物序列如下:
GDF9_3'UTRF:
5’-CGACAGTGTGTGTTGTGTAAGG-3’
GDF9_3'UTRR:
5’-GTCTCTCTAACTCTGAAAAAGGG-3’
PCR反应体系:
16.3μLMilli-Q水,2.5μL10×PCRBuffer,2.0μLMgCl2(25mM),2.0μLdNTP混合液(2.5mMeach),上下游引物(25µM)各1μL,0.5μL模板DNA(约200ng),0.2μLTaqDNA聚合酶(5U/μL,TaKaRa),总体积25μL。
PCR反应程序:
95oC预变性4min;94oC变性40s,55oC退火40s,72oC延伸1.5min,进行34个循环;72oC终延伸10min。
PCR产物回收:
参照UniversalDNAPurificationKit(Tiangen)试剂盒回收DNA片段。
2.2.3PCR产物测序和序列比对
将PCR产物送于深圳华大基因公司进行测序,序列打开利用Chromas软件。
将整理好的序列用MEGA5.0软件打开,进行序列比对。
3结果
3.1基因组DNA的提取
图3-1基因组DNA检测结果
1-4号为岩羊基因组DNA,5-8号为矮岩羊基因组DNA。
该基因组DNA提取较好,条带清洗干净,条带亮度较高。
可以很好地作为GDF基因扩增的模板。
3.2PCR产物电泳鉴定性别结果
图3-2GDF9基因3’UTR基因部分片段扩增结果
1-4号为岩羊GDF9基因3’UTR,5-8号为矮岩羊GDF9基因3’UTR。
由图片看出,该引物能很好地扩增出GDF9基因3’UTR的片段,扩增的产物大小分别为465bp。
从该图片来看,岩羊和矮岩羊该基因的大小基本一致。
3.3序列的比对
测序结果利用Chromas软件打开。
将整理好的序列用MEGA5.0软件打开,进行序列比对。
比对结果看出,岩羊和矮岩羊GDF9基因3’UTR的序列中存在一段明显的差异。
在矮岩羊3’UTR下游的276bp的位置发生了一个17个碱基序列的删除(如图3-3)。
而在岩羊的该相应的位置则是完整的。
为了进一步证明该突变是特异性的发生在矮岩羊GDF9基因中,我们又将矮岩羊的GDF9基因3’UTR的序列和其他物种的GDF9基因的3’UTR序列进行了比对。
比对结果如图3-4。
图3-3岩羊和矮岩羊GDF93'-UTR缺失突变比对
18、19、25、28为岩羊个体;7、8、9、10为矮岩羊个体
图3-4矮岩羊与其近缘物种的GDF93'UTR序列比对
1:
猪;2:
水牛;3:
黄牛;4:
绵羊;5:
岩羊;6:
矮岩羊
通过和近缘物种(山羊,水牛和猪)的GDF9的序列比对,发现该缺失只是特异性的发生在矮岩羊中,在其他近缘物种的相应位置并没有发现类似的缺失(图2.3)。
因此,下一步我们将对该突变进行功能性验证。
4讨论
4.1哺乳动物的体型变异的原因
在哺乳动物世界里,同一物种的体型变异现象并不少见。
其中最为著名的例子就是我们人类的好伙伴—家狗。
目前,家狗的品种有1000多种,但是他们的体型变异现象极为丰富。
从高大强壮的大丹狗,到矮小柔弱的奇娃娃狗,在所有陆上动物中,狗的体型差异最大。
然而,小体型狗的出现是人类在长期的定向选择中培育出来的,与体型矮小的基因型通过人工定向选择被固定下来,并遗传给下一代。
因此,这是一种非自然发生的体型矮化现象。
从亚洲象和家狗的例子可以看出,导致亚洲象和家狗体型矮小的原因分别是生境隔离和人工选择[3]。
从我们查阅的文献来看,导致哺乳动物体型矮化变异的主要因素则是与生长发育密切相关的基因突变。
这些与生长发育相关的基因主要来自GH/IGF1生长轴(GrowthHormone/Insulin-LikeGrowthFactor1axis),以及TGF-β(Transforminggrowthfactor-β)超家族等一些重要的基因家族,它们主要调节动物的骨骼、肌肉、生殖以及体态的发育[4]。
在高等动物中,GH/IGF生长轴基因是重要的体细胞生长调控中心,它包含的一系列基因往往对于体型变异有着直接调节作用。
例如,GH-1基因的多态性与体型大小的变异有着一定的关联,功能研究显示它通
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