常用溶液及试剂及仪器使用.docx

常用溶液及试剂及仪器使用.docx

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常用溶液及试剂及仪器使用

一.常用贮液与溶液

1mol/L亚精胺（Spermidine）:

溶解2.55g亚精胺于足量的水中，使终体积为10ml。

分装成小份贮存于-20℃。

1mol/L精胺（Spermine）：

溶解3.48g精胺于足量的水中，使终体积为10ml。

分装成小份贮存于-20℃。

10mol/L乙酸胺（ammoniumacetate）：

将77.1g乙酸胺溶解于水中，加水定容至1L后，用0.22um孔径的滤膜过滤除菌。

10mg/ml牛血清蛋白（BSA）：

加100mg的牛血清蛋白（组分V或分子生物学试剂级，无DNA酶）于9.5ml水中（为减少变性，

须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白），盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清蛋白完全溶解为止。

不要涡旋混合。

加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。

1mol/L二硫苏糖醇（DTT）：

在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加32.4ml水，分成小份贮存于-20℃。

或转移100mg的二硫苏糖醇

至微量离心管，加0.65ml的水配制成1mol/L二硫苏糖醇溶液。

8mol/L乙酸钾（potassiumacetate）：

溶解78.5g乙酸钾于足量的水中，加水定容到100ml。

1mol/L氯化钾（KCl）：

溶解7.46g氯化钾于足量的水中，加水定容到100ml。

3mol/L乙酸钠（sodiumacetate）：

溶解40.8g的三水乙酸钠于约90ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至5.2，再加水定容到100ml。

0.5mol/LEDTA:

配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三钠盐。

或称取186.1g的Na2EDTA·2H2O和20g的NaOH，并溶于水中，定容至1L。

1mol/LHEPES：

将23.8gHEPES溶于约90ml的水中，用NaOH调pH（6.8-8.2），然后用水定容至100ml。

1mol/LHCl：

加8.6ml的浓盐酸至91.4ml的水中。

25mg/mlIPGT：

溶解250mg的IPGT（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）于10ml水中，分成小份贮存于-20℃。

1mol/LMgCl2:

溶解20.3gMgCl2·6H2O于足量的水中，定容到100ml。

100mmol/LPMSF：

溶解174mg的PMSF（苯甲基磺酰氟）于足量的异丙醇中，定容到10ml。

分成小份并用铝箔将装液管包裹

或贮存于-20℃。

20mg/ml蛋白酶K（proteinaseK）：

将200mg的蛋白酶L加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。

不要涡旋混合。

加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。

10mg/mlRnase（无DNase）（DNase－freeRNase）：

溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸钠水溶液中（pH5.0）。

溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。

用1mol/L的Tris－HCl调pH至7.5，于-20℃贮存。

（配制过程中要戴手套）

5mol/L氯化钠（NaCl）：

溶解29.2g氯化钠于足量的水中，定容至100ml。

10N氢氧化钠（NaOH）：

溶解400g氢氧化钠颗粒于约0.9L水的烧杯中（磁力搅拌器搅拌），氢氧化钠完全溶解后用水定容至1L。

10％SDS（十二烷基硫酸钠）：

称取100gSDS慢慢转移到约含0.9L的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。

用水定容至1L。

2mol/L山梨（糖）醇（Sorbitol）：

溶解36.4g山梨（糖）醇于足量水中使终体积为100ml。

100％三氯乙酸（TCA）:

在装有500gTCA的试剂瓶中加入100ml水，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。

（稀释液应在临用前配制）

2.5％X－gal（5-溴-4-氯-3-吲哚－β-半乳糖苷）：

溶解25mg的X－gal于1ml的二甲基甲酰胺（DMF）,用铝箔包裹装液管，贮存于-20℃。

100×Denhardt试剂（Denhardt'sregent）

成分及终浓度

配制100ml溶液各成分的用量

2%聚蔗糖（Ficoll，400型）

2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40）

2%BSA（组分V）

水

2g

2g

2g

加水至总体积为100ml

依照上表称取各组分，溶于水中定容。

过滤除菌及杂质，分装成小份于-20℃贮存。

10×标准DNA连接酶缓冲液（standardDNAligasebuffer）（粘端、平端连接）

成分及终浓度

配制10ml溶液各成分的用量

0.5mol/LTris-HCl

100mmol/LMgCl2

100mmol/LDTT

2mmol/LATP

5mmol/L盐酸亚精胺（可选）

0.5mg/mlBSA（组分V）（可选）

水

5ml1mol/L贮液

1ml1mol/L贮液

1ml1mol/L贮液

200ul100mmol/L贮液

50ul1mmol/L贮液

0.5ml10mg/mL贮液

2.25ml

将配制好的缓冲液分装成小份，贮存于-20℃。

100mmol/LdNTP溶液（dNTPsolutions）

可以购买到100mmol/L纯dNTPs贮液，-80℃可贮存至少6个月。

10mmol/LdNTP混合液

成分及终浓度

配制20ul溶液各成分的用量

10mmol/LdATP

10mmol/LdCTP

10mmol/LdGTP

10mmol/LdTTP

水

2ul100mmol/LdATP贮液

2ul100mmol/LdCTP贮液

2ul100mmol/LdGTP贮液

2ul100mmol/LdTTP贮液

12ul

20％PEG8000/2.5MNaCl

成分及终浓度

配制10ml溶液各成分的用量

质量浓度为20％聚乙二醇

2.5mol/L氯化钠

水

20g

50ml5mol/L氯化钠或14.6g固体氯化钠

补足100ml

加聚乙二醇于含有氯化钠的烧杯中，加水至终体积100ml，用磁力搅拌器搅拌溶解。

20×SSC

成分及终浓度

配制1L溶液各成分的用量

300mmol/L柠檬酸三钠（二水）

3mol/L氯化钠

水

88.2g

175.3g

补足1L

溶解柠檬酸三钠（二水）和氯化钠于约0.9L水中，加几滴10NNaOH溶液调pH为7.0，用水补足体积至1L。

DEPC（焦碳酸二乙酯）处理水

加100ulDEPC于100ml水中，使DEPC的体积分数为0.1％。

在37℃温浴至少12h，然后在15psi条件下高压灭菌20min，以使残余的DEPC失活。

DEPC会与胺起反应，不可用DEPC处理Tris缓冲液。

甲酰胺（deionizedformamide）

直接购买或加DowexXG8混合树脂于装有甲酰胺的玻璃烧杯中，用磁力搅拌器轻轻搅拌1h，可去除甲酰胺中的离子。

经Whatman1号滤纸过滤除去树脂后分成小份，充氮气于-80℃贮存（防止氧化）。

磷酸缓冲液（phosphatebuffer）

按照下表所给定的体积，混合1mol/L的磷酸二氢钠（单碱）和1mol/L磷酸氢二钠（双碱）贮液，获得所需pH的磷酸缓冲液。

配制1mol/L的磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O）贮液：

溶解138g于足量水中，使终体积为1L;1mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4）贮液:

溶解142g于足量水中使终体积为1L。

1mol/L磷酸二氢钠（ml）

1mol/L磷酸氢二钠（ml）

最终pH值

877

850

815

775

735

685

625

565

510

450

390

330

280

123

150

185

225

265

315

375

435

490

550

610

670

720

6.0

6.1

6.2

6.3

6.4

6.5

6.6

6.7

6.8

6.9

7.0

7.1

7.2

TE（用于悬浮和贮存DNA）

成分及终浓度

配制100ml溶液各成分的用量

10mmol/LTris－HCl

1mmol/LEDTA

水

1ml1mol/LTris-HCl（pH7.4-8.0，25℃）

200ul0.5mol/LEDTA（pH8.0）

98.8ml

Tris缓冲液（Tris-HClbuffer）

将121g的Tris碱溶解于约0.9L水中，再根据所要求的pH（25℃下）加一定量的浓盐酸（11.6N），用水调整终体积至1L。

浓盐酸的体积（ml）

pH

8.6

14

21

28.5

38

46

56

66

71.3

76

9.0

8.8

8.6

8.4

8.2

8.0

7.8

7.6

7.4

7.2

二.电泳缓冲液、染料和凝胶加样液

电泳缓冲液

50×Tris-乙酸（TAE）缓冲液

成分及终浓度

配制1L溶液各成分的用量

2mol/LTris碱

1mol/L乙酸

100mmol/LEDTA

水

242g

57.1ml的冰乙酸（17.4mol/L）

200ml的0.5mol/LEDTA（pH8.0）

补足1L

5×Tris-硼酸（TBE）缓冲液

成分及终浓度

配制1L溶液各成分的用量

445mmol/LTris碱

445mmol/L硼酸盐

10mmol/LEDTA

水

54g

27.5g硼酸

20ml的0.5mol/LEDTA（pH8.0）

补足1L

染料

1％溴酚蓝（bromophenolblue）

加1g水溶性钠型溴酚蓝于100ml水中，搅拌或涡旋混合直到完全溶解。

1％二甲苯青FF（xylenecyanoleFF）

溶解1g二甲苯青FF于足量水中，定容到100ml。

10mg/ml的溴化乙锭（ethidiumbromide）

小心称取1g溴化乙锭，转移到广口瓶中，加100ml水，用磁力搅拌器搅拌直到完全溶解。

用铝箔包裹装液管，于4℃贮存。

凝胶上样液（gelloadingsolutions）

6×碱性凝胶上样液（室温贮存）

成分及终浓度

配制10ml溶液各成分用量

0.3N氢氧化钠

6mmol/LEDTA

18％聚蔗糖（400型）

0.15％溴甲酚绿

0.25％二甲苯青FF

水

300ul10N氢氧化钠

120ul0.5mol/LEDTA（pH8.0）

1.8g

15mg

25mg

补足到10ml

6×聚蔗糖凝胶上样液（室温贮存）

成分及终浓度

配制10ml溶液各成分用量

0.15％溴酚蓝

0.15％二甲苯青FF

5mmol/LEDTA

15％聚蔗糖（400型）

水

1.5ml1％溴酚蓝

1.5ml1％二甲苯青FF

100ul0.5mol/LEDTA（pH8.0）

1.5g

补足到10ml

6×溴酚蓝/二甲苯青/聚蔗糖凝胶上样液（室温贮存）

成分及终浓度

配制10ml溶液各成分用量

0.25％溴酚蓝

0.25％二甲苯青FF

15％聚蔗糖（400型）

水

2.5ml1％溴酚蓝

2.5ml1％二甲苯青FF

1.5g

补足到10ml

6×甘油凝胶上样液（4℃贮存）

成分及终浓度

配制10ml溶液各成分用量

0.15％溴酚蓝

0.15％二甲苯青FF

5mmol/LEDTA

50％甘油

水

1.5ml1％溴酚蓝

1.5ml1％二甲苯青FF

100ul0.5mol/LEDTA（pH8.0）

3ml

3.9ml

6×蔗糖凝胶上样液（室温贮存）

成分及终浓度

配制10ml溶液各成分用量

0.15％溴酚蓝

0.15％二甲苯青FF

5mmol/LEDTA

40％聚蔗糖

水

1.5ml1％溴酚蓝

1.5ml1％二甲苯青FF

100ul0.5mol/LEDTA（pH8.0）

4g

补足到10ml

10×十二烷基硫酸钠/甘油凝胶上样液（室温贮存）

成分及终浓度

配制10ml溶液各成分用量

0.2％溴酚蓝

0.2％二甲苯青FF

200mmol/LEDTA

0.1％SDS

50％甘油

水

20mg

20mg

4ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）

100ul10％SDS

5ml

补足到10ml

三.常用培养基

LB培养基

将下列组分溶解在0.9L水中：

蛋白胨

10g

酵母提取物

5g

氯化钠

10g

滴加5NNaOH（～0.2ml）调整pH至7.0，再补足水至1L。

高温高压4°保存。

注：

琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。

如果配制LB/AMP。

上述高温高压后冷却至室温加入1mlAMP（100mg/ml）后均匀混合，4°保存。

SOB培养基

将下列组分溶解在0.9L水中：

蛋白胨

20g

酵母提取物

5g

氯化钠

0.5g

1mol/L氯化钾

2.5ml

用水补足体积到1L。

分成100ml的小份，高压灭菌。

培养基冷却到室温后，再在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁。

SOC培养基

成分、方法同SOB培养基的配制，只是在培养基冷却到室温后，除了在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁外，再加2ml灭菌的1mol/L葡萄糖（18g葡萄糖溶于足够水中，再用水补足到100ml，用0.22um的滤膜过滤除菌）。

TB培养基

将下列组分溶解在0.9L水中：

蛋白胨

12g

酵母提取物

24g

甘油

4ml

各组分溶解后高压灭菌。

冷却到60℃，再加100ml灭菌的170mmol/LKH2PO4/0.72mol/LK2HPO4的溶液（2.31g的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100ml。

高压灭菌或用0.22um的滤膜过滤除菌）。

2×YT培养基

将下列组分溶解在0.9L水中：

蛋白胨

16g

酵母提取物

10g

氯化钠

4ml

如果需要用1NNaOH（～1ml）调整pH至7.0，再补足水至1L。

注：

琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。

YPD培养基

将下列组分溶解在0.9L水中：

蛋白胨

20g

酵母提取物

10g

葡萄糖

20g

用水补足体积为1L后，高压灭菌。

建议在高压灭菌之前，对色氨酸营养缺陷型每升培养基添加1.6g色氨酸，因为YPD培养基是色氨酸限制型培养基。

为了配制平板，需要在高压灭菌前加入20g琼脂粉。

TSB配制：

胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）：

胰蛋白胨1.5%（g/100ml）

大豆蛋白胨0.5%（g/100ml）

氯化钠0.5%（g/100ml）

用蒸馏水配制而成，调节pH为7.2±0.2，经121℃压力蒸汽灭菌后使用。

本培养基营养丰富，对某些较难生长的细菌均能生长，可用于各种细菌的增殖培养，亦可用作基础培养基。

四.常用抗生素

氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml）

溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的灭菌水中，最后定容至10ml。

用0.22um过滤膜过滤除菌。

分装成小份于-20℃贮存。

常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。

羧苄青霉素（carbenicillin）（50mg/ml）

溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。

分装成小份于-20℃贮存。

常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。

甲氧西林（methicillin）（100mg/ml）

溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。

分装成小份于-20℃贮存。

常以37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。

卡那霉素（kanamycin）（10mg/ml）

溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。

分装成小份于-20℃贮存。

常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。

氯霉素（chloramphenicol）（25mg/ml）

溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。

分装成小份于-20℃贮存。

常以12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。

链霉素（streptomycin）（50mg/ml）

溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。

分装成小份于-20℃贮存。

常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。

萘啶酮酸（nalidixicacid）（5mg/ml）

溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。

分装成小份于-20℃贮存。

常以15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。

四环素（tetracyyline）（10mg/ml）

溶解100mg四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。

分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光，于-20℃贮存。

常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。

A

PCR仪使用说明

1、开机：

打开开关，视窗上显示“SELFTEST”，显示10秒中后，显示RUN-ENTER菜单：

“-RUNENTERPROGRAM PROGRAM ”准备执行程序。

2、放入样本管，关紧盖子。

3、如果要运行已经编好的程序，则直接按《Proceed》，用箭头键选择已储存的程序，按《Proceed》，则屏幕显示：

“-ENABLE     DISABLE HEATEDLID”按《Proceed》选择ENABLE，则开始执行程序。

4、如果要输入新的程序，则在RUN-ENTER菜单上用箭头键选择ENTERPROGRAM，按《Proceed》，屏幕显示  “ -NEWLISTEDITDELET”，按《Proceed》，1）选择NEW，命名新的程序，最多8个字母，输入后按《Proceed》确认。

2）输入程序步骤：

名字输入后，显示“ STEP1 _TEMPGOTO  OPITON END”，按《Proceed》则可以输入温度（0～100℃），按《Proceed》确认后，则可以输入孵育时间，用《Select》键移动光标，输入数字，完成后按《Proceed》确认，跳到下一步，输入方式同上。

3）选择GOTO，输入循环步骤时链接到第几步（循环数最多可达9999次）（为实际循环数-1）。

4）选择option，显示“STEPEXTENDINCREMENT SLOPE ”再选择increment，按《Proceed》确认，输入初始的温度，确认后输入时间，按《Proceed》确认，然后输入每个循环增加或减少的温度，增加用正值，减少用负值（-0.1℃～6℃），按《Proceed》确认。

选择extend，按《Proceed》确认，输入每个循环增加或减少的时间（-60～60秒），按《Proceed》确认。

选择slop（指温度上升或下降的速率），输入温度的改变值（-0.1～1.5℃）按《Proceed》确认，然后输入加热或致冷的速度，按《Proceed》确认。

4）选择End，输入结束步骤。

5、输入完成的程序后，到RUN-ENTER菜单，选择新程序，开始运行。

6、其它：

用《pause》可以暂停一个运行的程序，再按一次继续程序。

用《stop》或《Cancel》可停止运行的程序。

编辑程序：

1、可以用《Cancel》键删除输错的值，输入新的值后按《Proceed》确认。

2、对于未输完的程序，要先输入END，按《Proceed》将程序储存后才能删除。

3、删除已经储存的程序：

从RUN-ENTER菜单中选择RUN－PROGRAM，按《Proceed》，显示主菜单，选择DELET，用《Select》选择删除。

4、查看程序的步骤：

在主菜单上选择LIST，按《Proceed》，用《Select》将选择名称，再按《Proceed》，显示程序的第一步，用《Select》键向前、向后翻页查看，此时不能改变程序的值。

编辑已有的程序：

1、从RUN-ENTER菜单中选择RUN－PROGRAM，按《Proceed》，显示主菜单，选择EDIT，按《Proceed》确认，用《Select》键选择要编辑的程序，按《Proceed》显示程序的第一步。

2、用《Select》键将光标移到要改变的温度或循环的值上，键入新值，按《Proceed》确认，按《Cancel》删除键入的值，出现空格，键入新值后确认。

注：

一旦值被改变或删除，原来的值不能恢复，必须重新键入。

3、编辑时间值：

必须重新键入小时、分钟、秒，按《Proceed》。

如何设置一个PCR体系：

一般分为8步：

1、预变性：

可用94～95℃，2～10min，一般用5min。

2、变性：

一般用94℃，30s～2min，一般45s～1min。

3、退火：

温度自定，30s～2min。

4、延伸：

70～75℃，一般72℃，对于＜2kb，＜1min；＞2kb，每增加1kb加1min。

5、循环数：

一般25～35个循环。

6、最终延伸：

72℃，5～15min。

7、保存：

10℃，时间设为0。

8、END。

B

BiometraTpPCR仪使用说明

1.编辑一个程序

按[Cprograms]进入编辑模式,在主目录中创建一个程序按[Denter]。

↓

要进入一个字目录，用→键将光标向右移动，然后用↑↓键选择一个子目录。

选择的目录会以强光突出出来。

按[Denter]进入选择的字目录。

↓

按[Alist]浏览该目录下所有已建立文档和空文档的列表。

用↑↓键在列表中滚动，然后用[Denter].确认其中一个记忆库。

↓

按数字键输入热盖的温度，一般来说，盖子的温度应该比程序中的温度高。

↓

完成了所有的预先设置之后，按[Denter]打开设置页。

在这个设置中，您可以设置您的循环中需要的所有参数。

每一个设置[Denter]来确认．光标将自动移动到下一个区域．您也可以通过向前移动光标键来确认一个数值．

设置页：

Temp[℃]time←#optinns

1:

2”

3:

4:

A?

Binsert/deleteCpgmokDenter

现在输入协议中第一档的温度，然后为其输入时间，小数点来间隔．顺序为h.m.s，用[Denter]确认时间设置。

↓

循环是通过选择返回循环的目录和返回的次数来定义的．在用←标记的列中，您可以选择返回的目标档．＃表示循环的次数,设置循环值＝总循环值-１，即，总循环数为３０时应输入＂２９＂．

↓

用［Cpgmok］来储存一个完整的程序．程序数据永久的储存在记忆中；

2.运行程序

按[Bstart/stop]选择一个程序．

↓

输入您想要启动的程序的号码．或者，按[Alist]在该子目录只能感所有