三角帆蚌肠道壁的乳酸菌的分离鉴定.docx
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三角帆蚌肠道壁的乳酸菌的分离鉴定
本科生毕业论文(设计)
题目:
三角帆蚌肠道壁中乳酸
菌的初步分离与鉴定
姓名:
贾迪
目录
摘要4
关键词4
前言5
1实验材料6
1.1实验动物6
1.2实验菌种6
1.3培养基6
1.4实验仪器及药品6
2实验方法6
2.1蚌肠道壁中乳酸菌的分离…7
2.1.1河蚌肠道壁总悬液的制备及稀释7
2.1.2蚌肠道壁总悬液菌群培养8
2.1.3蚌肠壁菌群的划线纯化8
2.1.4已纯化菌的扩大培养8
2.2蚌肠道壁中乳酸菌的分离…9
2.2.1已纯化菌菌落观察及革兰氏染色鉴定9
2.2.2已纯化菌的脱脂乳试管凝固鉴定9
2.2.3已纯化菌BCG牛乳平板产酸鉴定9
2.2.4已纯化菌糖发酵产酸产气鉴定10
3实验结果及分析讨论10
3.1实验结果及讨论…10
3.1.1菌落观察及菌体染色结果及讨论10
3.1.2脱脂乳试管凝固实验结果及讨论11
3.1.3产酸实验结果及讨论11
3.1.4产酸产气实验结果及讨论11
3.2分析讨论…12
参考文献12
致谢13
三角帆蚌肠道壁中乳酸菌
的初步分离与鉴定
摘要
利用微生物学实验从河蚌肠道壁中分离纯化得到五株细菌(以下标号均为17-21号),并对这五株细菌进行初步鉴定实验。
对这五株细菌进行革兰氏染色发现这五株菌染色结果均为蓝紫色,即为革兰氏阳性菌(G+),且菌体单个散在。
将这五株菌接种于BCG牛乳平板培养基,结果显示这五株细菌菌落周围培养基的pH值发生改变,且变为酸性。
脱脂乳凝固实验中,这五株菌均能对脱脂乳进行凝固。
产酸产气实验结果显示这五株菌均能产生酸性物质,使培养基的pH值变小,五株菌分解葡萄糖和蔗糖均不产气。
经过初步鉴定实验结果显示可能为乳酸菌,是否确定为乳酸菌还需要后续的生化实验进一步鉴定。
关键词
三角帆蚌乳酸菌分离鉴定
ThePreliminaryseparationandidentificationoflactobacillusinBowelwallofItsjibclam
BiologicalSciencesClass07102Jiadi
InstructTeacherLiNa
ABSTRACT
UsemicrobiologytestfromHeBengbowelwallofpurificationgotfivestrainsofbacteria(Thefollowinglabelallbe16-21),andthefivestrainsofbacteriaidentifiedpreliminarilytests.Thesefivestrainsofbacteriafoundgram'sstainingofthesefivestrainsbacteriadyeingresultsforviolet,namelyforGram-positieorganisms(G+),andbacteriainasinglescattered.PutthisfivestrainsofbacteriavaccinationinBCGmilkflatmedium,theresultsshowedthatfivestrainsbacterialcoloniesaroundthepHhaschanged,andbecomeacidic。
IntheexperimentalofSkimmilksolidification,thesefivestrainsofbacteriatoskimmilkhasbothfrozeneffect.Theproducesacidandgasexperimentalresultsshowthatthefivestrainsofbacteriacanproduceaciditymaterial,makemediumpHvaluedecreases,andfivestrainsofbacteriadecomp-ositionglucoseandsucrosecannotproducinggas.Afterapreliminaryidentificationtestresultsindicatethatitmaybeforlactobacillus,whetherforlacticacidbacteriaalsorequirefollow-uptodeterminethebiochemicalexperimentsfurtheridentified.
KEYWORDS
Itsjibclam,lactobacillus,Separatedandidentified
前言:
三角帆蚌俗称河蚌、珍珠蚌、三角蚌。
学名Hyriopsiscumingii。
它属淡水双壳类软体动物,属于蚌腮纲,蚌科,帆蚌属。
广泛分布于湖南、湖北、安徽、江苏、浙江、江西等省,尤以我国洞庭湖以及中型湖泊分布较多。
喜栖息在水色清澈的水域内,蚌类不能追逐食物,而是依靠蚌壳的开闭,外套膜内侧纤毛和鳃纤毛的摆动造成水流使硅藻、原生动物和有机碎屑进入口中成为其食物。
其壳大而扁平,壳面黑色或棕褐色,厚而坚硬,长近20厘米,后背缘向上伸出一帆状后翼,使蚌形呈三角状。
后背脊有数条由结节突起组成的斜行粗肋。
珍珠层厚,光泽强。
铰合部发达,左壳有2枚侧齿,右壳有2枚拟主齿和1枚侧齿。
雌雄异体。
三角帆蚌是我国特有的河蚌资源,又是育珠的好材料。
同时它也具有食用价值;肉质鲜美,肉及壳粉也可作家畜、家禽的饲料。
珍珠及珍珠层粉具有泻热定惊、防腐生肌、明目解毒、止咳化痰等功能,是20多种中成药的主要成分,可用于治疗多种疾病,并有嫩肤美白的特殊作用。
用珍珠加工成的饰物,精致美观,高贵典雅,其价格昂贵,可供外贸出口。
乳酸菌是指一群通过发酵糖类生产大量乳酸的细菌的总称,它属于细菌界Bacteria,厚壁菌门门Firmicutes,芽孢杆菌纲Bacilli,乳杆菌目Lactobacillales,乳杆菌科Lactobacillaceae乳杆菌属Lactobacillus。
它为革兰氏阳性、不形成芽孢不进行有氧呼吸的球菌或杆菌,在发酵碳水化合物时主要的代谢产物为乳酸。
乳酸菌形态多种多样,乳酸菌从形态上分类主要有球状和杆状两大类。
按照生化分类法,乳酸菌可分为乳秆菌属、链球菌属、明串珠菌属、双歧杆菌属和片球菌属5个属,每个属又有很多菌种,某些菌种还包括数个亚种。
乳杆菌属的乳酸菌一般呈细长的秆状,大多为链状排列链球菌属。
乳酸菌属一般呈短链或长链状排列,为无芽孢的革兰氏阳性菌,兼性厌氧。
明串珠菌属大多呈圆形或卵圆形的链状排列,常存在于水果和蔬菜中,能在高浓度的含糖食品中生长。
生产中常用的主要有:
乳酸链球菌、丁二酮乳酸链球菌、乳酪链球菌和嗜热乳链球菌等。
在发酵工业中应用的主要有:
同型发酵乳秆菌,如德氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、瑞士乳秆菌、嗜酸乳秆菌和干酪乳杆菌;异型发酵乳杆菌,如短乳秆菌和发酵乳杆菌。
乳酸菌分布广泛,分布于人、畜、禽、水产品(如河蚌等)等肠道中。
乳酸菌具有调节肠道菌群平衡、抑制肠道致病菌定植、提高机体免疫力、改善机体营养状况等作用。
食品原料经乳酸菌发酵后,能使蛋白质、脂肪和糖类分解为人体更易吸收的预消化状态,同时还能增加可溶性钙、磷、铁和某些B族维生素的含量,提高它的消化吸收性能和营养价值。
工业中的应用主要用于奶制品的加工,比如生产酸奶,奶油,干酪等等,都必须利用乳酸菌。
三角帆蚌肠道中分布大量的乳酸菌。
乳酸菌进入河蚌肠道,就会在肠道内繁殖,产生乳酸、乙酸和一些抗菌物质,使肠道的pH值和氧化还原电位降低,从而能抑制致病菌和有害于健康的菌的生长繁殖,可起到抗菌防病的作用。
同时,乳酸菌的大量生长繁殖也维持了肠道菌群的平衡,起到了整肠作用。
对三角帆蚌肠道中乳酸菌的进行分离、纯化及鉴定,进一步实验并选择出有益菌种。
对河蚌的养殖具有很重要的意义。
第1章实验材料
1.1实验动物三角帆蚌(来源)
1.2实验菌种枯草杆菌、大肠杆菌。
以上菌种由本实验室保存。
1.3培养基
乳酸菌培养基(MRS培养基):
牛肉膏0.3克,蛋白胨1.0克,氯化钠0.5克,琼脂1.5克,水100毫升。
在烧杯内加水100毫升,放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠,用记号笔在烧杯外作上记号后,放在火上加热。
待烧杯内各组分溶解后,加入琼脂,不断搅拌以免粘底。
等琼脂完全溶解后补足失水,用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值到7.2~7.6倒入三角瓶中,加棉花塞,用高压蒸汽灭菌灭菌30分钟。
灭菌完成后在无菌室内分装到各个无菌培养皿中备用。
脱脂乳试管培养基:
直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10克与蔗糖5克,水95克(蔗糖与水的比例在1:
10的范围内)的比例配制,装量以试管的1/3为宜,115℃灭菌15min。
蛋白胨水培养基:
蛋白胨10g,NaCl5g,水1000ml,pH:
7.2~7.4。
糖发酵培养基:
蛋白胨水培养基500ml,1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1~2ml,pH:
7.6,20%蔗糖糖溶液,20%葡萄糖溶液。
(1)将上述指示剂加蛋白胨水培养基(调节pH7.6),分装于试管中,在每管内放一倒置的小玻璃管(durhentube),使充满培养液。
将已分装好的蛋白胨水培养基和20%的各种糖溶液分别灭菌,蛋白胨水培养基121℃灭菌20min,糖溶液112℃灭菌30min。
。
灭菌后,每管以无菌操作分别加入20%的糖溶液0.5ml。
BCG牛乳培养基配方:
A液:
脱脂奶粉10克,水50ml,加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液(变色范围pH5.2~pH6.8为黄色到紫色)1ml,80℃灭菌20min。
B液:
酵母膏1克,水50克,琼脂2克,pH6.8,121℃灭菌20min。
按照配方正确称取所需药品放于烧杯中,在搪瓷杯中加入所需水量,玻棒搅匀,加热溶解,用10%NaOH或10%HCl调pH,用pH试纸对照,加琼脂溶化,加热过程要不断搅拌,可适当补水。
琼脂完全溶解后倒入250mL的锥形瓶中,用纱布包扎好(注意不要污染纱布)再用牛皮纸包扎,贴上标签,注明何种培养基。
在高压灭菌锅中,在1kg/cm2压力下维持30min灭菌。
1.4实验仪器及药品
实验仪器:
培养皿,试管,超菌工作台,高压灭菌锅,生物显微镜,接种环,酒精灯等。
药品:
结晶紫,卢戈氏碘液,95%酒精,牛肉膏,琼脂,甘露醇,蒸馏水,蔗糖,葡萄糖,溴甲酚紫,酵母膏,脱脂牛乳等。
第2章实验方法
2.1蚌肠道壁中乳酸菌的分离
2.1.1蚌肠道壁总悬液的制备与稀释
取材:
将河蚌表面利用用75%酒精消毒,迅速解剖取出肠道,用解剖剪将蚌肠道剪开,清洗掉肠道内容物,用电子天枰称取肠壁1g,放入无菌培养皿中。
紫外杀菌:
将所要用到的实验用具及材料(研钵,剪刀,镊子无菌水,试管等)放入超净工作台进行紫外杀菌,时间为15分钟。
清洗剪碎:
在无菌操作台中,用无菌水将肠壁清洗三次,之后放入研钵中用剪刀剪碎,直到没有大块的组织。
研磨转移:
无菌条件下,将剪碎的肠壁放入研钵中,并充分研磨。
将研磨好的材料全部转入标有10-1的试管中。
并用9ml无菌水多次清洗研钵转入10-1试管中。
稀释备用:
从10-1的试管中用移液管吸取1ml转入10-2的试管中得到10-2的浓度,依次稀释到10-5的浓度。
稀释后依次按照顺序做好标记。
转入离心管:
将上诉每个试管中的9ml肠壁悬液,分别装入离心管中,并将每个浓度的离心管分别装入塑料袋中做好标记,以备后用。
2.1.2蚌肠道壁总悬液菌群分离培养
紫外杀菌:
将所要用到的实验用具、材料(酒精灯,玻璃刮铲,乳酸菌培养基等)放入超净工作台进行紫外杀菌,时间为15分钟。
接种:
接种之前双手用酒精消菌,待干了之后左手将培养皿从一侧打开,右手拿离心管向其中倾倒河蚌肠壁悬液两滴,再用事先用火焰烧灼后冷却的玻璃刮铲将两滴悬液涂匀,盖上培养皿。
培养:
将已经接种好的培养板置于培养箱中适温(37℃)倒置培养,培养时间24小时。
2.1.3蚌肠壁总菌群的划线纯化
紫外杀菌:
将所要用到的实验用具、材料(酒精灯,接种环,镊子,平板培养基等)放入超净工作台进行紫外杀菌,时间为15分钟。
挑取菌体:
点燃酒精灯,用酒精棉球擦拭双手,待干后选用平整、圆滑的接种环(用完、用前都需要灼烧)在酒精灯上灼烧片刻,待冷却后按无菌操作法挑取少量菌种。
分区划线:
将培养基分成四个区域,在酒精灯旁,在每个区域中用蘸有菌体的接种环划“z”字形的线条。
画完线后盖上培养皿。
恒温培养:
将划线平板倒置,于恒温培养箱中37℃培养,24小时后观察。
以上纯化实验重复三次,以便得到更纯的菌种。
2.1.4已纯化菌的扩大培养
紫外杀菌:
将所要用到的实验用具、材料(酒精灯,接种环,镊子,平板培养基等)放入超净工作台进行紫外杀菌,时间为15分钟。
挑取样品菌体:
点燃酒精灯,用酒精棉球擦拭双手,待干后选用平整、圆滑的接种环(用完、用前都需要灼烧)在酒精灯上灼烧片刻,待冷却后按无菌操作法从“z”字形菌群表面选取单个存在的菌落挑取菌体,接种于乳酸菌培养基,并依次标上序号(17-21)。
培养:
将已经接种好的培养板置于培养箱中适温(37℃)倒置培养,培养时间24小时。
2.2蚌肠道壁中乳酸菌的鉴定
2.2.1已纯化菌菌落观察及革兰氏染色鉴定
菌悬液的制取:
在无菌工作台中,点燃酒精灯,用酒精棉球擦拭双手,待干后选用平整、圆滑的接种环在酒精灯上灼烧片刻,待冷却后按无菌操作法从17-21号已纯化菌落及对照菌中挑取菌种,放入事先准备好的左、中、右滴有三滴蒸馏水的载玻片上,左边做枯草杆菌悬液,中间做目的菌菌悬液,右边做大肠杆菌的菌悬液并标上号。
涂片:
用消毒酒精棉球擦拭双手,用镊子取干净载玻片一块,并标上与菌悬液相对应的序号,在酒精灯旁,用接种环(每一次用前、用完需灼烧)在上诉三种菌悬液中挑去少许再在干净的载玻片上涂一层薄薄的菌涂面。
晾干:
将涂片在酒精灯火焰上方烘干(温度不宜太高)。
固定:
手执载玻片一端,让菌涂面朝上,通过火焰2-3次固定,以不烫手为宜。
结晶紫初染:
将载玻片置于废液缸的玻片搁架上,加适量结晶紫染色1分钟,染色液以盖满菌涂面为宜,时间到后,直接倾去染色液,用水小心冲洗。
碘液媒染:
滴加卢哥氏碘液,媒染1分钟,用水洗去碘液。
脱色:
将载玻片倾斜,连续滴加95%的乙醇,脱色18-20秒直至流出液无色,立即水洗。
复染:
滴加番红复染2-5分钟,然后用水洗去涂片上的番红染液。
晾干:
将染好的涂片放在空气中晾干,或者用吸水纸吸干。
镜检:
镜检时先用低倍镜,再用高倍镜,最后用油镜观察。
2.2.2已纯化菌的脱脂乳试管凝固鉴定
紫外杀菌:
将所要用到的实验用具、材料(酒精灯,接种环,镊子,脱脂乳试管培养基等)放入超净工作台进行紫外杀菌,时间为15分钟。
挑取样品菌体接种:
点燃酒精灯,用酒精棉球擦拭双手,待干后选用平整、圆滑的接种环(用完、用前都需要灼烧)在酒精灯上灼烧片刻,待冷却后按无菌操作依次从17-21号纯化菌落中挑取菌体分别接种于17-21号脱脂乳试管培养基中。
培养:
将已经接种好的培养基置于培养箱中适温(42℃),培养时间48小时。
2.2.3已纯化菌BCG牛乳平板产酸鉴定
紫外杀菌:
将所要用到的实验用具材料(酒精灯,接种针,镊子,BCG牛乳平板培养基等)放入超净工作台进行紫外杀菌,时间为15分钟。
挑取样品菌体接种:
点燃酒精灯,用酒精棉球擦拭双手,待干后选用平整、圆滑的接种针(用完、用前都需要灼烧)在酒精灯上灼烧片刻,待冷却后按无菌操作依次从17-21号纯化菌落中挑取菌体分别垂直穿刺接种于17-21号BCG牛乳平板培养基中。
培养:
将已经接种好的培养基置于培养箱中(42℃),培养时间48小时。
2.2.4已纯化菌糖发酵产酸产气鉴定
紫外杀菌:
将所要用到的实验用具、材料(酒精灯,接种环,镊子,加蔗糖17-21号培养基,加葡萄糖的17-21好培养基等)放入超净工作台进行紫外杀菌,时间为15分钟。
挑取样品菌体接种:
点燃酒精灯,用酒精棉球擦拭双手,待干后选用平整、圆滑的接种环(用完、用前都需要灼烧)在酒精灯上灼烧片刻,待冷却后按无菌操作依次从17-21号样品菌中挑取菌体接中于17-21加蔗糖和葡萄糖的糖发酵培养基中。
培养:
将已经接种好的培养基置于培养箱中(42℃),培养时间48小时。
第3章实验结果及分析讨论
3.1实验结果及讨论
3.1.1菌落特征观察结果及讨论
表15株菌的形态特征
Table1Fivestrainsofbacteriacharacteristics
编号
染色
菌落特征
菌体形态
菌体排列
17
18
19
20
21
G+
G+
G+
G+
G+
乳白,不透明,湿润,表面光滑
乳白,不透明,湿润,表面光滑
乳白,不透明,湿润,表面光滑
乳白,不透明,湿润,表面光滑
乳白,不透明,湿润,表面光滑
球菌,纯
球菌,纯
球菌,纯
球菌,纯
球菌,纯
单个散在
单个散在
单个散在
单个散在
单个散在
对此五株细菌进行反复划线分离纯化,革兰氏染色镜检,这五株菌革兰氏染色结果均为蓝紫色,即为革兰氏阳性菌(G+)。
且镜下观察均为单个散在的球菌,无其他的杂菌,即分离纯化试验成功,得到了很纯的菌落。
3.1.2脱脂乳试管凝固实验结果及讨论
表25株菌的脱脂乳试管凝固结果
table2Fivestrainsofbacteriadegreasedmilksolidificationresults
编号
颜色
凝固状态
17
18
19
20
21
乳黄色
乳黄色
乳黄色
乳黄色
乳黄色
不凝固
完全凝固
完全凝固
完全凝固
半凝固,有少量液体
16-21号菌接种于脱脂乳液体培养基中,置于培养箱中,42℃培养48小时,结果详见表2:
凝固结果显示18-21号样品均有对脱脂乳进行凝固的效果,其中21号样品中半凝固的原因可能是因为接种时候挑取的菌体太少,经过48h培养得到的凝固的效果相对不明显。
17号不凝固的原因可能是由于接种的时候操作不规范,或者是由于培养基的密封性不好的缘故。
3.1.3产酸实验结果及讨论
表35株菌的产酸实验结果
Table3Fivestrainsofbacteriaproduceacidexperimentalresults
编号
菌落特征
培养基颜色变化
17
18
19
20
21
乳黄色
乳黄色
乳黄色
乳黄色
乳黄色
紫色变黄色
紫色变黄色
紫色变黄色
紫色变黄色
紫色变黄色
将这五株菌点接种于以溴甲酚紫(变色范围pH5.2~pH6.8为黄色到紫色)作为指示剂的BCG牛乳平板培养基中,置于培养箱中,42℃培养48小时。
结果详见表3:
结果显示培养基中均出现圆形,稍扁平的乳黄色菌落,并且菌体周围的培养基也变黄,初步认为这五株菌均能产生酸性物质,使培养基的pH值变小。
因而有可能为乳酸菌。
3.1.4产酸产气实验结果及讨论
表45株菌的产气实验结果
Table4Fivestrainsofbacteriaproducegasexperimentalresults
编号
+蔗糖颜色
+蔗糖产气
+葡萄糖颜色
+葡萄糖产气
17
18
19
20
21
紫色(阴)
黄色
黄色
黄色
黄色
不产气
不产气
不产气
不产气
不产气
棕黄色
黄色
黄色
黄色
黄色
不产气
不产气
不产气
不产气
不产气
对这5个样品进行产酸产气实验鉴定,实验结果如表4所示:
这五株菌表现出能使以溴甲酚紫作为指示剂的培养基由紫色变为黄色。
这说明这五株菌均能产生酸性物质,使培养基的这pH值变小。
从而使指示剂表现为酸式显色。
五株菌分解葡萄糖和蔗糖均不产气,而17号样品出现不同结果,可能是因接种时候挑取的菌体太少,导致培养48小时后的样品菌产酸效果不明显。
3.2分析讨论
从三角帆蚌肠道壁分离纯化得到5株细菌,因而证明这些菌群寄生于河蚌肠壁中,对这5株细菌从形态及生理生化方面进行鉴定,结果表明三角帆蚌肠壁中具有产酸不产气的球菌,产酸不产气菌群对河蚌的消化是有益的,同时这些产酸不产气的细菌能够对脱脂乳进行凝固。
经过初步鉴定可能为乳酸球菌,究竟是否确认为乳酸菌,这些菌对河蚌生长是否有利,还需后续试验进一步鉴定。
如果这些菌确实对河蚌生长有益处,则对这些菌体进一步进行纯化及大规模工厂化扩大培养,并适量的投放于河蚌养殖场所。
对河蚌的生长具有益处。
从而能够提高河蚌产量及珍珠蚌的珍珠产量。
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