酶工程.docx

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酶工程

第一章绪论（资料来自来自一班）

一名词解释,填空

1酶的变性与失活

失活作用：

凡可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用称为酶的失活作用。

2酶的回收率与纯化比

3酶的结合效率及酶活力回收率

酶的结合效率又称酶的固定化率，是指酶与载体结合的百分率

酶的结合效率=（加入的总酶活力-未结合的酶活力）/加入的总酶活力*100%

酶活力回收率是指固定化酶的总活力与用于固定化的总酶活力的百分率

酶活力回收率=固定化酶总活力/用于固定化的总酶活力*100%

4底物抑制及其产生的三个原因

（1）、竟争性抑制某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。

当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了

（2）、非竟争性抑制酶可以同时与底物及抑制剂结合，但是，中间产物ESI不能进一步分解为产物，因此，酶的活性降低。

（3）、反竞争性抑制作用酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，引起酶活性下降。

二问答题

1什么是酶工程?

酶工程（EnzymeEngineering））又称为酶技术，是指酶的生产与应用的技术过程。

是将酶学理论与化工技术、微生物技术结合起来利用酶的催化作用进行物质转化的技术它是借助工程学手段利用酶或细胞、细胞器的特定功能提供产品的一门科学。

就酶工程本身的发展来说，包括下列主要内容：

酶的产生、酶的制备、酶和细胞固定化、酶分子改造、有机介质中的酶反应、酶传感器、酶反应器、抗体酶、人工酶和模拟酶

2什么是酶的最适PH及其影响酶的反应机理

在一定的pH下,酶具有最大的催化活性,通常称此pH为最适pH（optimumpH）。

a.过酸或过碱影响酶蛋白的构象，使酶变性失活。

b.影响酶分子中某些基团的解离状态（活性中心的基团或维持构象的一些基团）c.影响底物分子的解离状态故酶反应一般在一定的缓冲液体系中进行

3简述酶活力的测定方法（要求：

快速，两个阶段，四个步骤）

要求：

快速、简便、准确

两个阶段：

酶在一定条件下与底物反应一段时间然后再测定反应物中底物或产物的浓度变化量。

步骤：

（1）配制底物溶液。

（2）确定反应条件。

（3）反应开始，记时间（4）反应完毕注意终止反应。

（5）测定产物的生产量或底物的减少量。

4磺胺类药物的作用机理（竞争性）（资料上有）

5影响酶催化作用的因素

（1）底物浓度对酶促反应速度的影响

在低底物浓度时,反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。

当底物浓度达到一定值，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应

（2）酶浓度对酶反应速度的影响

在底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速率与酶的浓度成正比

（3）温度的影响

一方面是温度升高,酶促反应速度加快。

另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。

因此大多数酶都有一个最适温度。

在最适温度条件下,反应速度最大。

酶对温度的耐受力与其存在状态有关

（4）pH的影响

在一定的pH下,酶具有最大的催化活性,通常称此pH为最适pH（optimumpH）。

a.过酸或过碱影响酶蛋白的构象，使酶变性失活。

b.影响酶分子中某些基团的解离状态（活性中心的基团或维持构象的一些基团）

c.影响底物分子的解离状态故酶反应一般在一定的缓冲液体系中进行

（5）抑制剂的影响

抑制剂：

不引起酶蛋白变性，但能使酶分子上某些必需基团（活性中心上一些基团）发生变化，引起酶活性下降，甚至丧失，此类物质称为酶的抑制剂。

（6）激活剂对酶反应速度的影响凡能提高酶活性的物质，都称为激活剂

（1）无机离子：

金属离子（K+Na+Mg2+Zn2+Fe2+Ca2+）、阴离子（Cl-Br-）、氢离子

（2）中等大小的有机分子：

某些还原剂、乙二胺四乙酸（EDTA）

（3）某些酶类：

酶原激活过程中的酶类

原理：

a.酶活性中心的必需基团b.酶-底络合物形成的桥梁

c.作为某些酶的辅助因子d.保护-SH酶不被氧化

6举例说明研究抑制剂对酶作用的重大意义

（1）药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开发：

抗癌药

（2）对生物体的代谢途径进行人为调控，代谢控制发酵

（3）研究酶的活性中心的构象及其化学功能基团，不仅可以设计农药，而且也是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础

第二章微生物发酵产酶

一名词解释

1诱导与阻遏

2最适生长温度与最适生产温度

3生长因子细胞生长繁殖不可缺少的微量有机化合物，如aa,嘌呤，嘧啶，激素

二填空

1常用产酶的微生物有产@酶的微生物有（资料上有）

2常识性问题酶工程的发展历史过程

三问答题

1如何选择产酶的菌种？

五个方面（菌种致病，产胞外酶的菌种）

1、发酵周期短，产量高；2、容易培养和管理；3、产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染；4、有利于酶的分离和纯化；5、安全性可靠，非致病菌。

2酶的发酵生产中提高酶生产的措施有？

酶合成的调节机制：

在正常情况下，酶产量受酶合成调节机制的控制，要提高酶产量必须打破这种调节控制。

酶合成主要取决于转录水平的调节，原核生物中普遍公认的调节机制是操纵子理论。

打破酶合成调节限制的方法：

1、添加诱导物同一种酶往往能被多种诱导物同一种诱导物酶也能诱导多种酶诱导物一般可分为3类：

酶的作用底物、酶的反应产物、酶的作用底物的类似物（最有效）2、控制阻遏物浓度3、添加表面活性剂4、添加产酶促进剂

3四种酶生物合成模式的特点，作用，原因，在工业生产中如何利用？

（1）同步合成型酶的合成与生长同步进行。

米曲霉可由单宁诱导生成鞣酸酶（单宁酶）酶的生物合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。

这类酶所对应的mRNA很不稳定

（2）延续合成型1）、酶的合成伴随着细胞的生长而开始，但在细胞生长进入稳定期后，酶还可以延续合成较长的一段时间。

2）酶的生物合成可以诱导，一般不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。

3）这类酶所对应的mRNA相当稳定，在生长稳定期以后相当长的一段时间内继续用于酶的合成

（3）中期合成型1）酶合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞进入平衡期后，酶的合成也随着停止。

2）枯草杆菌碱性磷酸酶，无机磷反馈阻遏3）酶的生物合成受到反馈阻遏，而且其所对应的mRNA不稳定。

（4）滞后合成型1）只有当细胞生长进入平衡期后，酶开始合成并大量积累，如许多水解酶2）酶的生物合成受分解代谢物阻遏作用，这类酶所对应的mRNA稳定性高。

4在生产实践中，试述酶生产合成模式及各模式的特点，最重要的模式是哪几种？

（资料上有）

5固定化细胞发酵有何优点？

1、提高产酶率2、可在高稀释率条件下连续发酵

3、发酵稳定性好4、缩短发酵周期，提高设备利用率

5、产品容易分离纯化6、适于胞外酶等胞外产品的生产

6简要介绍原生质体的制备过程，固定化原生质体有何特点？

（资料上有）

7打破酶合成调节限制的方法有哪几种？

即增加酶产物的措施

1、添加诱导物同一种酶往往能被多种诱导物同一种诱导物酶也能诱导多种酶诱导物一般可分为3类：

酶的作用底物、酶的反应产物、酶的作用底物的类似物（最有效）2、控制阻遏物浓度

3、添加表面活性剂4、添加产酶促进剂

第三章动植物细胞培养产酶

一填空

植物细胞培养的一般控制流程：

外植体细胞的获取细胞培养分离纯化成品（酶）

二问答

1简述植物细胞产酶的工艺流程（资料上有）

2以黑色素瘤细胞生产组织酶原为例说明细胞培养产酶的工艺流程控制及步骤（资料上有）

第四章酶的提取与分离

一名词解释

1等电点沉淀（资料上有）2盐析沉淀（资料上有）

二问答

1在酶提取分离纯化中细胞破碎方法有哪些？

组织细胞的破碎方法很多，有机械方法、物理方法、化学方法和生物化学方法等

1机械法　1）组织捣碎机（捣碎法）2）研磨法利用研钵、石磨、球磨、细菌磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎。

3）匀浆法利用匀浆器所产生的剪切力持组织细胞破碎。

2.物理破碎法通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，统称为物理破碎法。

物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。

1）温度差破碎法2）压力差破碎法3）超声波破碎法

3.化学破碎法是应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的结构改变或破坏的方法。

常用的化学试剂可分为有机溶剂和表面活性剂两大类。

4.酶促破碎法在一定条件下，通过外加的酶或细胞本身存在的酶的作用使细胞破碎。

第五章酶分子修饰

一名词解释

1酶分子修饰（资料上有）2分子内交联修饰（资料上有）

3酶的有限水解修饰若采用适当的方法使酶分子的肽链在特定的位点断裂，其分子质量减少，就可以在基本保持酶活力的同时使酶的抗原性降低或消失，这种修饰有限水解修饰

4酶的定点突变技术（资料上有）

5侧链基团修饰采用一定的方法（一般为化学法）使酶分子的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法称为侧链基团修饰

二填空

1通过酶分子修饰可以使酶分子结构发生哪些改变可能提高酶的活力，增强酶的稳定性，降低或消除酶的抗原性等。

2金属离子置换修饰的步骤

（1）酶的分离纯化

（2）除去原有的金属离子（3）加入一种金属离子置换

三问答

1对酶进行化学修饰时应考虑哪些因素？

2以单甲氧基聚乙二醇（MPEG）的活化及对酶的修饰阐述大分子修饰的方法与步骤（资料上有）

3什么是酶的定点突变技术，方法与步骤？

（资料上有）

4什么是抗体酶，试述以单克隆抗体法制备抗体酶的机理（资料上有）

第六章酶，细胞，原生质体固定化

一名词解释

1固定化酶（资料上有）

二填空

1游离酶应用中有哪三个不足？

（资料上有）2固定化酶的优点（资料上有）

3通常采用酶的固定化方法大体可分为吸附法、结合法、交联法、包埋法和热处理法等

4采用海藻酸钙凝胶包埋的步骤将一定量的海藻酸钠溶于水配成溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的细胞或孢子悬浮液混合均匀，然后滴入到一定浓度的氯化钙溶液中，形成球状固定化细胞胶粒。

5溶解植物细胞壁的酶有纤维素酶和果胶酶用于处理植物细胞壁根据细胞壁主要成分的不同选用合适的酶溶菌酶用于细菌原生质体制备；-葡聚糖酶可作用于酵母细胞壁；霉菌细胞壁成分较复杂，需用几丁质酶和其他相关酶的共同作用；纤维素酶和果胶酶用于处理植物细胞壁

三问答

1试述葡萄糖氧化酶电极的工作原理（测量血糖含量）（资料上有）

2什么是酶固定化？

主要方法有哪些？

通常采用的固定化方法可大体概括为：

吸附法、结合法、交联法、包埋法和热处理法等。

1吸附法通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。

根据吸附剂的特点又分为两种：

物理吸附和离子交换吸附。

2、包埋法：

（1）凝胶包埋法：

将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成的固定化酶。

天然凝胶：

琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等；合成凝胶：

聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等。

（2）半透膜包埋法（微囊化法）：

a.界面沉淀法：

利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成膜将酶包埋。

b.界面聚合法：

利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合的原理包埋酶c.二级乳化法d.脂质体包埋法

3、结合法　选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。

离子键结合法、共价键结合法

４.交联法利用双功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，制备固定化酶的方法。

5.热处理法：

将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内而制得。

3固定化的细胞发酵有哪些优点？

（资料上有）

第七章酶非水相催化

一名词解释

1非水酶学

2PH记忆有机溶剂中的酶能够“记忆”它冷冻干燥前所在缓冲液中的pH。

这种现象为“pH记忆”（pH-imprinting）

3微水介质体系

4对映体选择是指酶识别外消旋化合物中某种构象对映体的能力。

5区域选择性即酶能够选择性地催化底物中某个区域的基团发生反应。

6键选择性在同一个底物分子中有2种以上化学键都可以与酶反应时，酶对其中一种化学键优先反应。

二问答

1水对有机介质中酶催化有何影响？

（资料上有）

2有机溶剂对有机介质中酶催化的影响？

常用的有机溶剂有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈，已酯，二氯甲烷等

1.有机溶剂对酶结构与功能的影响1）由于酶分子与溶剂的直接接触，蛋白质分子的表面结构将有所变化。

2）溶剂对酶活性中心的影响溶剂对酶的活性中心的影响主要是减少了整个活性中心的数量。

2.有机溶剂对酶活性的影响1）极性强的有机溶剂会夺取酶分子的结合水,减少水化层,引起酶活性下降.通常以lgP表示有机溶剂极性的强弱,即一种溶剂在正辛烷/水两相之间的分配系数的常用对数值。

2）溶剂的极性越大，溶剂与酶分子争夺水分子的能力越强，保留在酶分子表面的水分越少，酶活性也就越小。

lgP≤2不宜做溶剂

因此应选择好所使用的溶剂，控制好介质中的含水量，或者经过酶分子修饰提高酶分子的亲水性，避免酶在有机介质中因脱水作用而影响其催化活性

3.有机溶剂对产物和底物分配的影响1）酶在有机溶中进行催化，底物必须渗入必需水层，产物必须移出水层，才能使反应进行下去。

2）溶剂能改变酶分子必需水层中底物或产物的浓度。

有机溶剂极性很小、疏水性很强，疏水性底物虽在有机溶剂中溶解度大、浓度高，但难于进入必需水层，催化速度慢；有机溶剂极性很大、疏水性很小，疏水性底物在有机溶剂中溶解度低、浓度小，在必需水层浓度小，催化速度也慢。

必须选择极性适中的有机溶剂。

2≤lgP≤5

3什么是PH记忆，在实践中如何利用PH记忆？

有机溶剂中的酶能够“记忆”它冷冻干燥前所在缓冲液中的pH。

这种现象为“pH记忆”（pH-imprinting）。

2）利用酶的pH记忆特性可以控制有机相中酶催化的最适pH

3）采用有机相缓冲液pH记忆不起作用

在微水有机溶剂中疏水性的酸或碱与它们相应的盐所组成的混合物，可以作为有机相缓冲液，控制有机相中酶的解离状态，使酶完全忘记干燥前它所处的水溶液的pH，即干燥前缓冲液的pH值对微水有机溶剂中的酶活力几乎没有什么影响。

第九章酶反应器

1酶反应器类型有哪几类（资料上有）

2在工业生产中如何选择酶反应器（游离酶反应器的选择）

搅拌罐式反应器（STR）

鼓泡式反应器（BCR）适用于有气体参加的酶催化反应

游离酶膜酶反应器酶可回收利用，主要用于价格较高的酶

喷射式反应器用于一些耐高温的酶