细胞培育标准操作程序SOP.docx
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细胞培育标准操作程序SOP.docx
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细胞培育标准操作程序SOP
细胞培育标准操作程序(SOP)
细胞培育标准操作程序(SOP)
1.目的:
为了保证培育细胞的正常生长,试验技术人员必需明确并正确执行细胞培育的基本操作步骤,特制定试验室细胞培育操作流程。
2.适用范围:
适用于来我院细胞室进行细胞培育工作的人员。
3.操作规程:
3.1培育液、PBS、胰蛋白酶的配制
3.1.11000ml培育液的配制
1、预备用品:
培育粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2~3天内的新颖三蒸水(或新颖反渗水)、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶(100ml×10个玻璃瓶)、青霉素、链霉素、2~3个过滤器、注射器。
紫外线照台30min。
2、将培育粉用900ml新颖三蒸水(或新颖反渗水)溶解,并冲洗袋内残留粉末。
3、充分搅拌,按说明添加成分(如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g,Invitrogen公司的DMEM需加NaHCO3粉3.7g等),再充分搅拌。
无需加谷氨酰胺,因该培育基里已含有。
4、用1M(1mol/L)HCl调PH至7.0左右(细胞适宜在PH7.2~7.4生长,配制好后PH值会上升0.2~0.3,故配时调PH至7.0左右)。
5、用新颖三蒸水(或新颖反渗水)定容到1000ml。
6、配青霉素80万/瓶+4ml蒸馏水溶解
配链霉素100万/瓶+4ml蒸馏水溶解
取0.5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培育液中,使其终浓度均为100U/ml,充分搅拌混匀。
7、在无菌操作台里用0.22um的除菌滤膜过滤配制好的培育液,并分装到到100ml玻璃瓶中,玻璃瓶口用薄膜封口,盖上橡皮塞,放-20℃保存备用。
留意:
(1)配制培育液及调整培育液PH值所使用的HCl和(或)NaOH均需新颖三蒸水(或新颖反渗水)配制。
一般于配制当天制备,以保证水的纯度和质量。
(2)预备的100ml×10个玻璃瓶必需事先高压灭菌!
烧杯、量筒、玻棒、盛新颖三蒸水(或新颖反渗水)的容器均不需高压灭菌,洁净即可。
3.1.2PBS(平衡盐溶液)的配制
NaCl8g
KCl0.2g+新颖三蒸水(或新颖反渗水)至1000ml
Na2HPO4*H2O1.56g
KH2PO40.2g
(1)无需调PH值,其成分溶解后PH为7.4,不需除菌滤膜过滤除菌,放于4℃保存,用前直接高压灭菌(高压时,装PBS的瓶子的瓶盖要插针头!
)
(2)Na2HPO4*H2O1.56g则Na2HPO4*12H2O需3.4888g
(3)如欲配制500ml,以上成分减半即可
3.1.30.25%胰蛋白酶的配制
胰蛋白酶粉2.5g
EDTA(乙二胺四乙酸二钠)0.3g
NaCl8.0g
KCl0.4g`+新颖三蒸水(或新颖反渗水)至1000ML
NaHCO30.5g
Glucose(葡萄糖)1.0g
酚红0.06g
(1)配出来的PH值为7.6,在PH值7.6~7.8范围内,故不需调PH值。
(2)用0.22um的除菌滤膜过滤分装,瓶口用薄膜封口,放-20℃保存备用。
4℃可连续使用1月左右。
(3)用于分装的玻璃瓶必需事先高压灭菌!
而烧杯、量筒、玻棒、盛新颖三蒸水(或新颖反渗水)的容器均不需高压灭菌,洁净即可。
(4)如欲配制500ml,以上成分减半即可
3.2细胞复苏
1、预备:
紫外线照台30min,预备好装有高压灭菌好的吸管、试管的饭盒、废液缸;培育基临用前放水浴箱里温育20分钟。
在操作台上摆放好物品,左边为饭盒、培育液等,两头为酒精灯、试管架等,左边放滴管架、镊子,右上角放废液缸。
2、灼烧培育瓶口及瓶盖,用滴管取培育基5ml加入试管中(一滴约为50ul)。
3、戴手套,从-196℃液氮罐中取出冻存管,马上放入37℃水浴箱中快速解冻,同时不断悄然摇动冻存管,保证冻存管内细胞1min内溶化。
以70%酒精擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。
(慢冻快融)
4、用吸细胞液的滴管从冻存管中完全吸出细胞悬液,加入到已装有培育基的试管中,塞子塞试管,800rpm离心2min(用培育基且离心的目的:
去除细胞冷冻爱护剂DMSO,因常温下其对细胞毒性大),弃上清,试管底部的白色物质为细胞,轻弹混匀。
往试管中加培育基、FBS(胎牛血清)各80滴和20滴(使FBS浓度为20%)。
用吸细胞液的滴管悄然吹打,使细胞混匀,以免在培育瓶里成团,影响细胞生长。
5、将试管中的细胞悬液用吸细胞液的滴管全部吸出,加到培育瓶中,标记日期、细胞名称,再把培育瓶放入CO2培育箱。
(留意:
加入到培育瓶后,培育瓶悄然平放,用手拿培育瓶侧壁,左右上下悄然摇摆几次,使细胞均匀贴壁在培育瓶底。
)
6、整理所用物品、用75%酒精喷洒操作台,擦台,保持台面洁净。
留意:
(1)入细胞室前观看CO2%压力,5-7.5mPa左右,减压器表压力不低于0.1mPa!
(2)刚复苏的细胞需要的养分成分更多些,让FBS浓度达到20%。
(3)离心时间为1~2min,速度为800转,不要离心太久,避开对细胞损害较大。
(4)滴管使用留意事项:
a.吸细胞液公用一个滴管,各株细胞的滴管肯定要严格分开,不能混用,防止细胞间污染。
b.培育基和FBS(胎牛血清)可以用一个滴管,但分开用更好!
c.FBS(胎牛血清)不能和胰酶用一根滴管,由于血清对胰酶活性有抑制造用。
d.胰酶和PBS(平衡盐溶液)可以用一根滴管,不过最好分开
(5)不是全部的细胞复苏后都能活。
死亡缘由:
冻存时间太长(如2年以上),技术不过关(如吹打太激烈)、细胞传代数太多等。
(6)关于PBS(平衡盐溶液):
a.PBS溶液配好后要高压灭菌后才能用;PBS高压时其瓶塞肯定要插针头。
b.PBS和培育基都可以冲洗培育瓶里细胞中的杂质,但需用温过的PBS冲洗细胞中的杂质。
PBS虽然冲洗杂质效果较好,但它有使细胞易脱壁的倾向,故不行经常冲洗细胞。
c.不温的PBS用来做难消化细胞消化前冲洗一遍的预备,使细胞加入胰酶后易消化。
d.消化后临时不养细胞的培育瓶,可以往其中加入2~3mlPBS(防止培育瓶干燥),培育瓶放CO2培育箱里短时间保存。
下次用该培育瓶再养同种细胞时,把PBS吸出弃去,再用培育基冲洗一遍即可再用。
(7)DMSO(二甲基亚砜)在常温下对细胞毒性较大,而在4℃时,其毒性大大减弱,故冻存的细胞复苏后应准时洗涤冷冻爱护剂DMSO(离心后弃去上清),防止DMSO在常温下对细胞产生较大毒性!
3.3细胞换液
1、倒置显微镜下观看细胞生长形态:
a.移动细胞培育瓶时,观看到呈漂移形态的细胞为死细胞;
b.生长形态良好的细胞:
透亮 度大、折光性强、轮廓不清;能看清部分细胞微小结构,细胞处于对数生长期时可以见到很多分裂期细胞。
c.生长形态不良的细胞:
细胞折光性变弱,轮廓添加,胞质中常消灭空泡、脂滴、颗粒样物质,细胞间空隙加大,细胞变得不规章,得到原有特点。
d.只要生长形态良好的细胞才适合进一步传代和试验。
2、紫外线照台30min,预备好吸管、试管饭盒,温育培育基,FBS(胎牛血清)可不温。
试验开头时打开照明灯和抽风机,用75%酒精喷双手。
酒精灯点燃放两头。
滴管放滴管架上,从左到右挨次为:
吸细胞液的滴管、吸培育基的滴管、吸FBS(胎牛血清)的滴管。
从水浴箱中取出培育基,擦干水放入操作台的左边。
3、从CO2培育箱中取出细胞培育瓶,在酒精灯外焰上旋转灼烧其瓶口、盖子处(留意不要把胶盖烧焦),滴管(前端90%部位)灼烧。
细胞培育瓶倾斜,用吸细胞液的滴管吸出旧液弃到废液碗中,尽量吸洁净。
留意:
滴管的胶头应在瓶外压紧再伸进培育瓶内,避开产生气泡,且不要伸入瓶内太多,防止形成污染;滴管尖端悬空弃液,不要触到废液碗(要亲眼看到弃液,防止滴管尖端触到废液碗)!
4、用吸培育基的滴管吸取培育基90滴加入到培育瓶(25c㎡)中,再用吸FBS(胎牛血清)的滴管吸取FBS10滴加入到培育瓶中。
(使FBS浓度为10%)
5、旋紧细胞培育瓶盖后,再旋回半圈,以利于空气流通。
平放回CO2培育箱中。
6、整理所用物品、用75%酒精喷洒操作台,擦台,保持台面洁净。
留意:
(1)在打开培育基、FBS(胎牛血清)、培育瓶前后均需旋转灼烧其瓶口和瓶盖,严格留意无菌操作。
灭菌饭盒只能在无菌操作台里打开。
(2)镊子每次使用前均需灼烧。
装FBS的瓶子瓶盖小,用镊子夹住盖子灼烧后,再用其夹住瓶盖盖上;取其瓶盖时也是用镊子夹住瓶盖取下盖子。
(3)滴管在第一次使用前也需灼烧。
留意:
除吸取细胞液的滴管外,其他滴管滴加液体时都要悬空滴加。
已吸过液体的滴管在再次使用前决不能再灼烧!
滴管千万不能混用!
(4)培育瓶口不要对着本人,不加试剂时要平放。
(5)培育液以没过细胞为宜。
(6)细胞液颜色变黄,死细胞多时换液。
不要求每天换液,简约添加污染机会。
3.4细胞计数
1、原理:
(1)计算细胞数目用血球计数盘计数。
(2)血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber中细刻9个1mm2大正方形,其中4个角落之正方形再细刻16个小格,深度均为0.1mm。
当chamber上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。
使用时,计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104,即为每ml中之细胞数目。
细胞数/ml=4大格细胞总数/4×104
留意:
镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算,若细胞团占10%以上,说明分散不好,需重新制备细胞悬液。
2、计数方法:
(1)75%酒精棉签清洁盖玻片及计数板,再用干纱布或棉签再擦一遍,放好盖玻片。
(2)用滴管从已经吹打混匀的细胞悬液中取一滴滴在计数板周边,再用加样枪吹打混匀该滴液体,从中吸取13ul至盖玻片边缘(留意不要溢出,不要有气泡)。
(3)观看计数:
压线的记左不记右,记上不登记;成团的细胞只记为1个;先用低倍镜(红色,4×)找出大位置,再用中倍镜(黄色,10×)进行计数。
细胞数/ml=4大格细胞总数/4×104
(4)计数完毕用75%酒精棉签擦盖玻片及计数板,再用干纱布(或干棉签)擦一遍。
3.5细胞传代
1、紫外线照台30min,预备好细胞培育所需物品。
2、取灭菌试管1支,配完全培育基(含10%FBS)3ml(培育基:
FBS=54滴:
6滴)。
3、用吸细胞液的滴管吸弃旧液。
4、胰酶消化:
加入约1ml(20滴)胰酶到培育瓶里消化。
胰酶铺平培育瓶底为佳。
倒置显微镜下观看培育瓶内细胞,一旦发觉大量细胞胞质回缩,细胞间隙增大,但未脱离培育瓶底,马上用吸细胞液的滴
(在37℃胰酶消化效果最佳)。
管吸出胰酶弃去,把细胞培育瓶放入CO2培育箱让残存的胰酶连续消化,
5、每1min把培育瓶拿到倒置显微镜下观看,当观看到细胞变圆,透亮,细胞间隙明显增大时,用吸细胞液的滴管从试管中吸取事先配好的完全培育基3ml加入到培育瓶中终止消化。
6、用吸细胞液的滴管轻柔吹打,保证培育瓶底的每个角落都吹打到,斜坡处不能忽视(可以把滴管卡在瓶口处吹打斜坡处。
吹打时尽量避开产生气泡,因其对细胞有损害;需轻柔吹打,用力吹打对细胞也有损害。
新学者可固定每个角落包括斜坡处吹打5次,靠近瓶口端处的角落也要吹到),把培育瓶中全部细胞悬液用吸细胞液的滴管移入试管中,再用滴管吹打混匀细胞悬液。
7、取一滴细胞悬液进行计数(此步骤是为了积累培育细胞的阅历,观看多少密度的细胞具体几天可以长满,待有阅历后此步骤可以省略。
如需进一步进行铺板则肯定要计数!
)
8、传代:
不同细胞依据细胞数量、生长快慢、难易等,一般依据1:
5比例进行传代。
先用滴管吹打混匀3ml(60滴)细胞悬液,取12滴细胞悬液到培育瓶中,补足完全培育基(培育基:
FBS=9:
1)使液体总体积达到4ml,平放到CO2培育箱中连续培育。
9、整理所用物品、用75%酒精喷洒操作台,擦台,保持台面洁净。
留意:
(1)对于难消化的细胞(如Bxpc-3胰腺癌细胞)在用胰酶消化前,先用1~2ml(即20~40滴,或1~2滴管)4℃PBS冲洗一遍,较易消化的细胞不需要此步骤。
(2)肯定要防止细胞过消化!
因过消化,使细胞成团,不均匀,且对细胞损害很大,影响细胞贴壁和导致生长形态差等。
*过消化特征:
a.在没有加入完全培育基终止消化前就有成团细胞从培育瓶壁上零落,胰酶里消灭很多悬浮物,为掉下
来的细胞。
b.培育瓶底板上本身为白茫茫(细胞贴壁生长),而过消化后细胞脱壁掉下来,则可见培育瓶底板有一
片片空隙。
(3)过消化的处理:
不吸出胰酶,马上加入3ml完全培育基终止消化后一并收集入试管中,经过800rpm离心3min,弃去上清(失活的胰酶、培育基、FBS)。
细胞沉淀(白色沉淀物)在试管底,用手指轻弹打散细胞,重新加入适量完全培育基,混匀后放入培育瓶中连续培育。
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