免疫学实验指导.docx
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免疫学实验指导.docx
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免疫学实验指导
免疫学实验指导
生命科学与工程学院生物工程、生物技术、动物医学专业用
冯玉萍
[分组]:
4人/组,实验用动物、器材以每组需要量设计
[班级]2006生物工程、生物技术[学生人数]:
65人/58人。
分16组/15组
[时间]2008年3月—2008年7月两周一次4学时。
实验一、免疫学实验动物的一般操作
实验二、实验动物免疫器官、免疫细胞观察
实验三、实验动物的采血方法、动物血清及红细胞的制备方法
实验四、淋巴细胞分离与E玫瑰花环形成试验
实验五、IgG的分离和纯化
实验六、玻片凝集试验(ABO血型鉴定)
实验七、环状沉淀试验
实验八、琼脂扩散试验(单向)
实验九、巨噬细胞吞噬功能试验
实验十、白细胞吞噬试验
实验一、免疫学实验动物的一般操作
[实验原理]
实验动物的基本操作是免疫学实验的基础,抗原对动物机体的免疫效果,通过实验动物进行验证,因此必须掌握实验动物的一般操作技术。
[目的要求]
1、实验材料的准备(棉球、注射器的准备与消毒)(演示)
2、了解免疫学实验常用动物的生物学特性、用途及其健康要求。
[自学]
3、学习实验动物的编号、抓取、固定和几种不同的注射途径方法。
4、练习对小白鼠给药的几种不同途径的注射方法。
5、练习小白鼠的取血方法。
6、学习血涂片的制作及染色;观察动物血液中有形成分的形态结构特点。
[实验动物]小白鼠,2只/组,共需18~20只。
[试剂]
⑴3%来苏儿或3%石炭酸100~150ml/组;
⑵无菌生理盐水100~150ml/组;磷酸盐缓冲液20~50ml/组(带滴管、染色用)。
⑶3~5%苦味酸20~50ml/组(带滴管,编号用);
⑷5%品红20ml~50ml/组(带滴管,编号用);
⑸瑞特氏(wright‘s)染色液50ml/组(带滴管,染色用);
*抗凝剂一支
[器材]
⑴1ml注射器及针头2支/组;
⑵碘酒棉球、酒精棉球、无菌干棉球各适量;
⑶手术剪刀2把/组;镊子2把/组;载玻片、盖玻片各6片/组;
⑷毛细吸管2支、50—100ml烧杯1个/组
⑸显微镜6台/组
[6]鼠笼1个/组
[操作步骤]
1、练习小白鼠抓取、编号、皮下注射、皮内注射、腹腔注射的方法。
(见《免疫学实验》P9-13。
2、练习小白鼠尾静脉取血法。
(P15)
实验报告要求:
1、时间、地点、操作人、同组人、指导老师。
2、实验原理、目的要求
3、实验操作记录(实验步骤、结果)
4、分析总结:
依据实验原理、目的要求,分析总结实验是否成功,是否达到实验目的?
为什么?
5、对实验动物编号有何实际意义,你对书中关于小白鼠的编号方法有何想法?
有无更简便、实用的方法?
6、若给动物注射传染性材料应注意些什么?
实验二、免疫器官与免疫细胞观察
[实验原理]
免疫器官、免疫细胞是动物免疫系统的主体。
在胸腺、脾脏中有大量淋巴细胞存在,在外周血液中有大量淋巴细胞和白细胞等免疫细胞存在,发挥着免疫监视作用。
[目的要求]
1、练习血涂片的制作
2、学习小鼠颈椎脱臼致死的方法,观察小白鼠的解剖结构;
3、学习脾脏、胸腺的触片制备与染色方法;观察小鼠脾脏触片、血液涂片中的免疫细胞,并画图。
[方法与步骤]
1、练习血涂片的制作(3张/组)
1)准备一张洁净玻片,取血1滴于玻片右侧,另取一光边玻片的一端,放在血滴前方,并逐渐后移接触血滴,血液立即沿推片散开,然后将推片与载片保持30一45度角,平稳地向前推动,至玻片另一端,载玻片上便留下一层血膜。
良好的血膜象舌头,头、体、尾鲜明,厚薄适宜、分布均匀,边缘整齐,两侧留有空隙。
2)染色:
A、瑞特氏(WrightFs)染色法:
①.血涂片制成后可在空气中挥动,使迅速干燥,以免血细胞皱缩。
选择良好的血片,用特种玻璃铅笔画出两边界限(注意保留尾部,因体积大的细胞往往在此出现),以防染液外溢。
②在血膜上滴加几滴瑞氏染色液,左右晃动,使染液完全覆盖血膜,注意染液不宜过多而溢出界限,亦不能过少而干燥。
③1—2min后,滴加等量磷酸盐缓冲液或生理盐水,2—3min后,可见表面有金属光泽,即可用清水轻轻冲去染液,待血片自然干燥或用滤纸轻轻吸干。
在正常的情况下,血膜外观染成粉红色。
3)镜检:
先在低倍镜下检查血片,染色是否合格,血细胞分布是否均匀等,然后换高倍镜或油镜观察,并绘图,指出淋巴细胞与白细胞、红细胞。
如自己图片不成功,则对教学片进行观察和绘图。
结果:
血液涂片瑞特氏染色法染色的结果:
中性粒细胞:
是白细胞中数量最多的细胞,胞体大于红细胞,细胞核蓝紫色,呈分叶形,可分2—5叶。
叶间有细丝相连;细胞浆为粉红色,其中充满褐灰色的小颗粒。
嗜酸性粒细胞:
数量少,占白细胞总数的0.5—3%。
胞体较中性粒细胞大,胞核蓝色,颗粒粉红色。
嗜碱性粒细胞:
细胞核蓝紫色,颗粒蓝色。
红细胞数量最大,边缘厚(浓染),中央薄(淡)。
淋巴细胞细胞质天蓝色,细胞核几乎占据整个细胞。
B、姬姆萨染色法:
⑴用甲醇固定标本10分钟,或醋酸:
甲醇=1:
3的混合液固定30分钟。
⑵用滴管吸取姬姆萨染色工作液布满材料面,注意不要有气泡。
⑶染色10——15分钟后,用自来水冲洗,空气干燥,二甲苯透明5分钟。
⑷用光学树脂封片后观察。
结果:
血液涂片姬姆萨染色法染色的结果:
有核细胞的细胞核染成紫红色或蓝紫色,细胞浆染成粉红色。
无核细胞染成:
C、血液标本片观察结果:
2、练习小白鼠脊椎脱臼处死法。
或用乙醚麻醉致死。
3、仔细解剖小鼠,观察小鼠的内脏器官,找出脾脏、胸腺,分别做触片(3张/组)并用瑞特氏(WrightFs)染色法或姬姆萨染色法染色、观察。
4、观察标本片,绘图描述人、小鼠血液中的几种有形成分。
[结果]
1、脾脏触片瑞特氏染色法染色的结果:
2、脾脏触片姬姆萨染色法染色的结果:
3、标本片观察结果:
实验报告要求:
1、时间、地点、操作人、同组人、指导老师。
2、实验原理、目的要求
3、实验操作记录(实验步骤、结果)
4、分析总结:
依据实验原理、目的要求,分析总结实验是否成功,是否达到实验目的?
为什么?
5、绘图描述:
人、鼠血液涂片中的淋巴细胞、粒细胞、红细胞
实验三、实验动物的采血方法、动物血清及红细胞的制备方法
[实验原理]
抗原免疫动物后,其相应的抗体就会产生并存在于动物的体液中。
血清是体液的重要组成部分,存在大量抗体。
学会了制备血清的方法,就学会了制备抗血清的方法。
红细胞是免疫学反应中常用的颗粒性抗原,也是可溶性抗原的载体及补体结合反应中指示系统的组成成员。
在许多免疫学检测中都要用到红细胞,因此,血清与红细胞的制备技术,是免疫学实验的基本技术。
[目的要求]
1、学习鸡、兔的动脉、静脉及心脏等部位的无菌采血方法;
2、学习动物血清、红细胞的制备方法;
3、掌握离心机的使用方法。
4、解剖鸡、兔,观察免疫器官。
[实验动物]鸡、兔各1只/2组,共需鸡5只、兔5只。
[试剂]
⑴3%来苏儿或3%石炭酸50~100ml/组;
⑵无菌生理盐水150ml/组;分两瓶(100ml/瓶、50ml/瓶)
⑶500单位/ml的肝素溶液2~5ml/班。
[器材]
⑴10ml注射器及针头2支/组;
⑵碘酒棉球、酒精棉球、无菌干棉球各适量;50-100ml烧杯1个/组;
⑶手术刀、剪、镊子各1把/组;
⑷50~100ml、带玻璃珠的无菌三角烧瓶1个/组(可用20ml链霉素瓶代替);
⑸无菌试管及试管塞6套/组;离心管2支/组;
(6)离心机1台/6组,共3台;
⑺试管架1个/组、恒温培养箱一个/班、冰箱一个/班。
[操作步骤]
1、兔耳静脉采血(P19)
2、兔耳中央动脉采血(P19)
3、兔心脏采血:
(P18)
4、鸡翼根静脉取血(P19)
5、鸡心脏取血(P18)。
6、离心法制备血清:
取下注射器针头将抽得的血液以无菌操作注入无菌的离心管中,平衡离心管,离心10——20分钟/2000—3000rpm。
用毛细滴管吸出血清,将获取的血清分装于已灭菌的小瓶内,加盖并用封口胶将瓶口封住,贴上标签注明血清的名称及制备日期,置低温冰箱中保存备用。
7、沉淀法制备血清:
取下注射器针头将抽得的血液以无菌操作注入无菌试管(或平皿)内,加盖置37℃温室内2小时,凝固后用无菌滴管沿试管(或平皿)边缘将血块与皿壁脱离,然后放入4~8℃冰箱中过夜,使血清充分析出。
吸取血清分装于已灭菌的小瓶内备用。
8、动物血红细胞制备:
(1)无菌操作取静脉血,将血注入装有玻璃珠的无菌三角瓶中,振摇数分钟以脱纤维抗凝。
(2)取适量的脱纤维血,用2—5倍无菌生理盐水洗2次,每次2000rpm,离心10分钟,弃上清后用无菌生理盐水配成20%的红细胞悬液,置4℃冰箱保存备用。
作业:
实验报告
1、简述无菌采血应注意哪些事项?
2、离心机操作中应注意哪些问题?
3、血清制备中应注意哪些问题?
4、红细胞制备中应注意哪些问题?
备注:
实验前请仔细阅读〈免疫学实验〉!
实验四血球凝集反应和交叉配血试验
[实验原理]
红细胞等颗粒性抗原与血清中相应的抗体,在适量电解质存在的条件下,经一定时间后,凝集成肉眼可见的凝集物。
抗原抗体的这种反应,称为凝集反应。
在人的ABO血型中,A型血的红细胞上有A抗原,血清中有抗B抗原的抗体;在B型血的红细胞上有B抗原,血清中有抗A抗原的抗体;故A型血的红细胞与B型血的血清混合时,在有电解质存在的条件下就可能发生凝集;同样,B型血的红细胞与A型血的血清混合,在有电解质存在的条件下也可能发生凝集;AB型血的红细胞上,既有A抗原,也有B抗原,而其血清中既无抗A抗原的抗体,也无抗B抗原的抗体;而O型血的红细胞上既无A抗原,也无B抗原,而其血清中既有抗A抗原的抗体,也有抗B抗原的抗体,故AB型血的血清与A型、B型、O型血的红细胞混合,均不会发生凝集,也就是说,AB型血的人能接受A型、B型、O型血液的输血;而O型血的血清与A型、B型、AB型血的红细胞混合,均可能发生凝集;既O型血的人不能接受A型、B型、AB型血液的输血,但他却是万能输血者,其红细胞可以输给任何血型的人。
兔、鸡是否也有相应的血型?
尚不清楚。
本实验可自行设计,在有生理盐水存在的条件下,利用不同组的兔与兔、鸡与鸡、鸡与兔的红细胞和血清的混合,观察凝集现象和溶血现象,并分析、总结实验结果。
[目的要求]
1、将实验三所制备的鸡、兔血清、红细胞分别进行交叉,自行设计,观察鸡与鸡、兔与兔、鸡与兔之间血清与红细胞交互混合,产生的凝集现象和溶血现象。
2、尝试着利用抗原抗体反应的特异性对实验结果进行解释。
[试剂]0.85%生理盐水,100ml/组;5ml注射器2支/组。
[器材]载玻片每人1张、小试管4支/组,毛细滴管2支/每组。
[操作步骤]
1、将制备好的鸡、兔红细胞用生理盐水稀释成0.5%的混悬液。
2、兔与兔(鸡与鸡)配血,观察血球凝集现象:
取1#兔(鸡)血清1滴于载玻片上,加入2#、3#兔(鸡)红细胞,用火柴棒混匀,
过10~15分钟,观察,血球凝集现象。
3、兔与鸡(鸡与兔)配血,观察血球凝集现象
取1#、2#兔(鸡)血清1滴于载玻片上,加入1#、2#鸡(兔)红细胞,用火柴棒混匀,过10~15分钟,观察,血球凝集现象。
4、兔与兔(鸡与鸡)配血,观察溶血现象:
取1#、2#兔(鸡)血清0.5~1ml,加入0.5%的1#、2#鸡(兔)红细胞,混匀,静止过15~20分钟,观察上清液是否溶血(变红),血球是否凝集?
(沉淀物边缘是否整齐)。
5、记录结果
如:
兔与兔(鸡与鸡)配血,观察血球凝集现象
项目
实验1
实验2
1#兔血清
1滴
-
1#兔红细胞
-
1滴
2#兔血清
-
1滴
2#兔红细胞
1滴
实验结果
凝集(或不凝集)
凝集(或不凝集)
如:
兔与兔(鸡与鸡)配血,观察溶血现象
项目
实验1
实验2
1#兔血清
0.5ml
-
1#兔红细胞
-
0.5ml
2#兔血清
-
0.5ml
2#兔红细胞
0.5ml
实验结果
凝集(或不凝集)
凝集(或不凝集)
溶血(或不溶血)
溶血(或不溶血)
6、总结、分析、讨论。
实验报告
附、玻片凝集反应试验
(ABO血型鉴定试验)
[目的要求]
1、掌握玻片凝集试验的操作方法,了解其特点和用途;
2、学习玻片凝集试验结果的观察方法
3、了解ABO血型鉴定的原理,掌握其鉴定方法
[试剂]
1、诊断用人血型抗A血清;
2、诊断用人血型抗B血清;
3、无菌生理盐水
4、消毒液
[器材]
1、凹玻片或载玻片6片/组,
2、无菌刺血针、小试管、尖嘴滴管、毛细吸管、牙签、酒精棉球、无菌干棉球、显微镜各1个/人,每组6人;
3、试管架、记号笔各1个/组。
[操作步骤]
(1)用酒精棉球消毒被检者的指尖或耳垂,用无菌刺血针刺破皮肤,取血1~2滴放入盛有0.5~1ml生理盐水的小试管中,摇匀即成为1%~2%的红细胞悬液。
取血后,用无菌干棉球压迫针眼止血。
(2)取双孔凹玻片一张或载玻片一张,在二孔(或二端)处标明A、B。
用尖嘴滴管分别吸取诊断用人血型抗A和抗B血清,各加一滴于相应的孔内(注意两滴管切勿混用)。
(3)用尖嘴滴管吸取待检红细胞悬液于A、B血清中各加1滴。
(注意勿使滴管尖端和血清接触)。
(4)分别用牙签将抗血清与红细胞悬液混匀(也可前后左右轻轻晃动载玻片使其混匀,用牙签混匀时应分别用两端搅拌,切不可用同一端在A、B两抗血清中搅拌)。
(5)充分混匀后,置室温于实验台上静置10~15分钟后观察有无凝集发生。
如混合液由均匀混浊的红色逐渐变为透明,并出现大小不等的红色凝集块,即为红细胞凝集;若混合液呈均匀分散混浊状,边缘整齐,则为不凝集。
如观察不够清楚,可置显微镜下用低倍镜观察。
血型判定可参照下图及表。
红细胞凝成大块或有数个红细胞凝集在一起为凝集。
用抗血清鉴定血型的结果与判定
血型
抗A血清
抗B血清
A
+
-
B
-
+
AB
+
+
O
-
-
+表示凝集,-表示不凝集。
[作业与思考题]
1.你的血型是何型?
你是如何判断的?
…
2.你能接受何种血型的血液?
能输血给何种血型的人?
为什么?
3.根据下表中提供的凝集反应的结果,请将血型检查结果填入表中:
标准A型血清
标准B型血清
待检者血型
+
+
-
-
-
+
+
-
4.完成下表:
血型
红细胞中的
抗原
血清中的抗体
被凝集的
红细胞类型
输血中能接受的血型
A
B
AB
O
5、如果要检测血清中血型抗体的效价,请你写出主要的操作过程。
备注:
实验前请仔细阅读〈免疫学实验〉P77-109
实验五、淋巴细胞的分离与E玫瑰花环形成试验
[目的要求]
1、学习血液中免疫细胞的分离方法。
2、学习E花环试验的操作方法。
3、观察显微镜下E花环的形态。
4、掌握花环计数的方法及其形成原理。
5、了解检测Ea、Et花环的意义。
[材料与试剂]
⑴人外周血:
静脉采血2~4ml,注入盛有2~3滴肝素(500单位/ml)的青霉素瓶中,摇匀。
应在4小时内进行实验。
⑵Alsever's保存液
⑶绵羊红细胞(2周内)。
⑷无菌及吸收过的小牛血清:
将小牛血清置56℃水浴经30分钟灭活后,按每毫升小牛血清加入已洗涤过的压积绵羊红细胞0.1ml混匀,置37℃水浴中1小时,然后置4℃冰箱过夜。
以2000rpm离心沉淀10分钟,取上清过滤除菌,分装小瓶,低温保存备用。
⑸无钙、镁Hank′s液;
⑹淋巴细胞分离液,比重为1.077~1.080。
(上海试剂二厂生产,密度P(g/ml)为1.077±0.002,避光低温(4℃)保存,有效期2~3年。
)
⑺0.8%戊二醛,用0.43%NaCl溶液临用前配制。
⑻瑞氏染色液或1%美蓝水溶液。
[器具]
水平式离心机、水浴箱、冰箱、离心管、吸管、试管、内放玻璃珠的三角烧瓶、显微镜等。
[操作步骤]
1.制备淋巴细胞悬液
(1)取1m1淋巴细胞分离液加1ml肝素抗凝血,使血液轻轻覆盖在分离液上面,并使血液与分离液之间保持清晰的界面。
(2)立即置水平式离心机中以2000rpm离心20分钟。
离心后分为四层,最上层为血浆,中间一层为分离液。
上层和中层之间有一乳白色层含有大量淋巴细胞,小量大单核细胞。
最下层为红细胞。
(见图)
(3)用尖嘴滴管小心地吸取淋巴细胞于一试管中,加入无Ca2+、Mg2+的Hank,s液洗涤3次,每次以2000rpm离心10分钟沉淀淋巴细胞,末次洗涤后弃上清,仅留约0.1ml液体,制成淋巴细胞悬液。
细胞计数,用Hank,s液配成5×106/m!
的细胞悬液。
淋巴细胞分离过程
2.1%绵羊红细胞悬液的制备
取一定量阿氏液保存的绵羊血于离心管中,用无Ca2+、、Mg2+的Harlk′s液洗3次,末次洗涤后取压积的血球用上述Hank,s液配成1%悬液,细胞浓度约为2×108细胞/ml。
3.活性T花环(Ea花环)的形成
(1)取淋巴细胞悬液0.1ml,加入小牛血清0.1ml和0.2ml1%的绵羊红细胞悬液混匀。
(2)于水平式离心机内以500~800rpm离心5分钟,小心吸去上清液,留下约0.1ml液体,立即沿管壁加入一滴0.8%戊二醛溶液固定2~3分钟,轻轻转动试管小心混匀。
(3)加入1~2滴1%美蓝水溶液混匀,取一滴于载玻片上、置油镜下汁数200个淋巴细胞中形成花环的淋巴细胞百分数。
一般以淋巴细胞吸附三个以上绵羊红细胞者为一个花环。
4.总T花环(Et花环)的形成
(1)取淋巴细胞悬液0.1ml加入小牛血清0.1ml及0.2m11%的绵羊红细胞悬液,混匀,置37℃水浴5分钟,其间摇动2次。
(2)500~800rpm离心5分钟,置4℃冰箱2~4小时,吸去少许上清液,约留0.1ml液体,沿管壁加入0.8%戊二醛溶液一滴,固定2~3分钟,轻旋试管以混匀,其余同Ea花环步骤。
[注意事项]
1.必须采用新鲜抗凝血来分离淋巴细胞,从取血到试验最多不超过4小时。
否则,形成E花环的百分数会显著下降。
2.绵羊红细胞的质和量对花环形成有较大的影响。
不新鲜的绵羊红细胞可使花环形成显著减少。
绵羊红细胞与淋巴细胞的比例以100:
1为宜,比例过低,花环形成明显降低,反之则升高。
3.pH值对花环的形成有影响。
最适pH为7.2~7.40。
过高、过低的pH值可使花环值下降。
4.在制片时需混匀花环悬液,悬浮时一定要轻旋试管,不可用滴管用力吹打或摇动试管,以免形成的花环脱落。
5.镜检时有干片和湿片二种方法。
湿片不能长期保存。
干片是推片法,标本片可长期保存,但推片时花环易脱落,花环形成细胞分布不均匀,推片尾部常高于头部一倍以上。
6.花环形成时,加入蛋白成分可提高花环的稳定性,常用胎牛血清(或小牛血清),但需先经56℃30J分钟灭活,并用绵羊红细胞吸收,以除去嗜异性抗体,否则此抗体可和绵羊红细胞起反应并吸附于B细胞膜Fc受体上,产生B细胞花环,从而影响试验的准确性。
[作业与思考题]
1.用简明扼要的方式表明Ea和Et花环形成的操作流程。
2.你的实验结果怎样?
请分析试验成败的原因。
3.Ea和Et花环形成时的主要区别是什么?
4.作E花环试验时,为何加入小牛血清?
不用小牛血清用人血清行吗?
加入的小牛血清为什么要经56℃30分钟灭活,并用绵羊红细胞吸收?
备注:
实验前请仔细阅读〈免疫学实验〉P179-183
实验六、IgG的分离和纯化
[目的要求]
1、学习动物血清中IgG的分离纯化方法;
2、比较成年牛血清、新生牛血清IgG的含量;
3、了解分离、纯化抗体的原理;
4、熟练掌握离心机的使用方法。
[试剂]
⑴成年牛血清20ml、新生牛血清20ml;
⑵pH7.4、0.01mol/L磷酸盐缓冲液250ml。
⑶pH8.0、0.005mol/L磷酸缓冲液250ml;
⑷饱和硫酸铵溶液500ml;
⑸1%氯化钡250ml。
[器材]
⑴无菌1ml、2ml、5ml、10ml吸管各2支/组;
⑵酒精棉球适量;
⑶离心管2支/组
⑷离心机1台/5组;2-3台/班
⑺试管架1个/组、记号笔1支/组、4℃冰箱1个/班。
[操作步骤]
1.分别取成年牛血清、新生牛血清各2ml(X)于离心管中,加等量的pH7.4、0.01mol/L,磷酸盐缓冲盐水或生理盐水,将血清稀释一倍,慢慢摇动避免形成泡沫。
2.在冰浴中逐滴加入4ml(2X)饱和硫酸铵溶液,边加边搅拌,以防止形成团块,减少沉淀。
此时即有大量的Y-球蛋白沉淀(主要是IgG)。
3.置冰箱静置30分钟或更长时间后,冷冻离心(3000~4000rpm,15分钟),弃上清。
沉淀用2ml(X)0.01mol/L磷酸盐缓冲盐水溶解。
4.逐滴加入1ml(1/2X)饱和硫酸铵边加边搅拌,使饱和度为33%,置4℃冰箱30~60分钟,离心收集沉淀。
同法重复3、4步骤3次,可得到较纯的IgG。
[作业与思考题]
实验报告
1.分离纯化免疫球蛋白为什么尽可能在低温条件下进行?
所用溶液为何要先冷却?
2.常用的分离、纯化免疫球蛋白的方法主要有哪几种?
各自得到的纯度如何?
3.五类免疫球蛋白分离纯化的方法皆相同吗?
4.如果用血浆来分离纯化IgG,需不需要去除纤维蛋白原?
5.分离纯化IgG时,为什么硫酸皱的饱和度先调至50%,然后调至33%?
加入硫酸铵溶液时,为什么要一滴滴地加?
6.如果要提取IgA,从初乳中提取是否比从血清中提取合算?
为什么?
7.比较成年牛血清与新生牛血清中IgG含量并分析之。
备注:
实验前请仔细阅读〈免疫学实验〉P44-48。
实验七、单向琼脂扩散试验
[目的要求]
1、通过本试验,学习一种抗原定量的测定方法。
2、了解沉淀环的直径与抗原或抗体浓度的关系。
[材料与试剂]
1、3%生理盐水琼脂;
2、正常人血清、已知IgG含量的人血清;
3、羊抗人IgG抗血清;
4、生理盐水;
5、待测羊血清。
[器具]
1、载玻片6张/组;
2、打孔器、微量加样器、湿盒(盒内铺二层湿纱布)、
[操作步骤]
1、溶化3%生理盐水琼脂,并置56℃水浴中保温。
2、稀释抗血清:
将羊抗人IgG抗血清按1/2效价用生理盐水稀释(如效价为1:
60,则稀释成1:
30),分装于小试管,每管1.5ml,置56℃水浴保温(温度不能高于56℃,且时间不能过长)。
3、.取上述56℃水浴保温的琼脂和抗血清等量混合,小心倾注于置水平台上的载玻片上(勿倒出玻片外!
)。
(板上的抗血清终浓度是多少?
)
4.稀释参考血清:
取参考血清一支,加入蒸馆水0.5时,完全溶解后用生理盐水倍比稀释成1:
10~1:
160五种浓度,并算出IgG的相应含量(严g/ml)。
如参考血清IgG含量为11.66mg/ml。
参考血清稀释度为1:
10、1:
20、1:
40,则IgG相应含量为1166μg/ml、583μg/ml、
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