临床免疫学检验五年制医学检验专业适用.docx
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临床免疫学检验五年制医学检验专业适用
绪论
Δ基础免疫学理论
相关内容:
抗原、抗体、补体、细胞因子、HLA、免疫系统、免疫应答
Δ临床免疫学
抗感染免疫、超敏反应、自身免疫、肿瘤免疫、移植免疫
Δ免疫学实验技术
免疫学检验
抗原抗体反应
Δ抗原抗体反应:
高度特异性
体内:
体液免疫效应
体外:
血清学反应(沉淀反应、凝集反应、补体参与的溶血反应、补体结合试验、中和试验、免疫标记技术)
Δ原理
内因:
Ag、Ab能特异性结合
外因:
Ag、Ab结合的动力
1静电引力(库仑引力)
2范德华力(电子云力)小于静电引力
3氢键大于范德华力
4疏水作用力(作用最大)
Δ盐析:
在高浓度电解质(如NaCl)存在的条件下,NaCl可先与Ab分子结合(在Ab未与Ag相遇时),排斥H2O分子,从而使Ab蛋白质优先沉降
Δ特点:
1.特异性:
交叉反应(cross-reaction):
抗体对具有相同或相似抗原表位的不同抗原的反应。
先决条件:
存在共同Ag表位
意义:
①免疫学诊断:
外斐氏反应——用变形杆菌OX19、OX2、OXk做抗原查血清抗体,诊断斑疹伤寒(立克次氏体感染所致)
②免疫病理损害(Eg:
链球菌感染后易导致肾小球肾炎,原因是链球菌与人体肾小球基底膜有共同Ag表位所致)
2.最适比例
Ab过剩,前带(可溶性抗原抗体复合物)
Ag过剩,后带(可溶性抗原抗体复合物)
Ab、Ag合适比例沉淀物等价带(沉淀物)
Δ抗体(等价带范围不同)
R型抗体家兔免疫血清较宽大多数小动物
H型抗体马免疫血清较窄人和多数大动物
3.可逆性:
Ag+Ab
AgAb
原因:
非共价键结合,不是化学反应
Δ影响因素
自身因素:
①Ag:
理化性质、抗原表位数目及种类
②Ab:
来源(R型orH型)、特异性、亲和性、浓度
外界环境条件:
①电解质:
0.9%NaCl,if浓度过高,会盐析
②pH:
6~8,if小于3,酸凝集;过高,碱变性
③温度:
37℃
沉淀反应及免疫电泳
Δ颗粒型抗原凝集反应eg:
细菌、RBC
Δ可溶性抗原沉淀反应eg:
血清蛋白溶液、多糖抗原
Δ沉淀反应(precipitationreaction):
可溶性抗原与相应抗体结合,在电解质存在,两者比例恰当时,可出现肉眼可见的沉淀现象
Ag:
沉淀原Ab沉淀素
实验中为使抗原抗体比例(数量)恰当,应稀释Ag
Δ分类
1液相沉淀:
絮状沉淀、环状沉淀、免疫比浊测定
2凝胶扩散:
双扩、单扩
3凝胶免疫电泳:
免疫电泳、对流免疫、火箭免疫
Δ絮状沉淀试验
出现絮状/块状沉淀
玻片法:
检测病毒(定性)
试管法:
方阵滴定(半定量)
Δ环状沉淀反应
测抗原(法医血迹鉴定)
Δ免疫透射浊度测定法
检测IgG、IgA、IgM、C3
Δ凝胶扩散(agarimmunodiffusion):
可溶性抗原与相应抗体在电解质存在下,在琼脂基质中扩散,当两者相遇,比例恰当时结合,可出现肉眼可见的沉淀线
Δ双扩(doubleimmunodiffusion)
原理:
可溶性抗原和抗体在含有电解质的琼脂凝胶板的对应孔中,两者各自向四周凝胶中扩散,当二者相对应时即发生特异性反应,在浓度比例合适处形成可见的白色沉淀线
方法:
①制琼脂板(3ml1.5%NS琼脂)
②打孔(双孔型/三角孔型/梅花孔型)
③加样(平孔沿加满)
④扩散(37℃,24h观察结果)
用途:
①双孔型:
已知Ag测未知Ab,or已知Ab测未知Ag
②三角孔型:
抗原性质分析
③梅花孔型:
测Ag有效稀释度
优点:
简单、易行、用途广
缺点:
敏感性低、出结果慢、只定性,不能定量
Δ单扩(singleimmunodiffusion)
原理:
将一定量抗体混浇于琼脂内,置于凝胶孔中的定量抗原向四周扩散,抗原与相应抗体在比例合适处形成白色沉淀环,其大小与抗原浓度成正比
方法:
①已知抗体+琼脂制板,打孔
②在琼脂板小孔中加梯度抗原
③抗原向四周扩散形成沉淀环
④抗原浓度与沉淀环直径呈线性关系,绘制标准曲线
⑤从标准曲线上查出并计算出待测标本含量
用途:
定量测定IgG、IgA、IgM、C3等含量
Δ影响电泳的因素
①溶液的pH,常用8~9,蛋白质带负电
②溶液的离子强度,越高,泳动慢,一般0.02~0.2M
③电场强度,越高,越快,一般4~6V/cm(琼脂长),约40V左右
④电渗作用:
电场中液体对于一固体的固定相对移动的现象,电渗方向与电泳方向相反
Δ对流免疫电泳(counter-immunoelectrophoresis)
原理:
定向加速的免疫双扩(双扩+电场,使抗原、抗体相对泳动)
方法:
Ag、Ab分别在琼制板上不同孔内,Ag在负极,Ab在正极,电泳
电压:
4~6V/cm(琼脂长度)
时间:
45分钟~1小时
pH:
8.6
用途:
检测HBsAg、AFP
优点:
耗时短、反应敏感性强
Δ免疫电泳(immunoelectrophoresis)
原理:
Ag区带电泳+双扩结合
方法:
①Ag电泳分出区带
②Ag、Ab免疫双扩
用途:
分析复杂Ag的组分(人全血清组分的分析)、多发性骨髓瘤等疾病的测定
优点:
用样品量小,特异性高、分辨力强
凝集反应
Δ凝集反应(Agglutination)
细菌、细胞等颗粒性抗原悬液加入相应抗体,在电解质存在下,两者特异性结合,出现肉眼可见得凝聚块
Ag:
凝集原Ab:
凝集素
凝集反应应稀释抗体
Δ沉淀试验和凝集试验的比较
抗原性质可溶性Ag颗粒性Ag
稀释对象抗原抗体
结果现象沉淀现象凝集现象
敏感性低高
Δ分类:
直接凝集反应玻片法
试管法
间接凝集反应(正向)间接(血、胶乳)凝集试验
反向间接(血、胶乳)凝集试验
间接凝集抑制试验
协同凝集试验
Δ直接凝集反应(directagglutination)
细菌、螺旋体、细胞等颗粒性抗原(抗原时细胞表面结构)在适当电解质参与下,直接与相应抗体结合,出现肉眼可见的凝集现象
Δ玻片法与试管法的区别
玻片法试管法
原理已知抗体测未知抗原已知抗原测未知抗体的效价
定性半定量
用途ABO血型鉴定肥达氏反应
菌种鉴定外斐氏反应
Δ间接凝集反应(indirectagglutinationorpassiveagglutination)
将可溶性抗原或抗体吸附在某种载体微球上,使之成为颗粒性抗原或抗体,然后再与相应的抗体或抗原结合,出现载体微球的凝集现象
载体的要求:
不干预免疫反应、颗粒大小均匀
常用载体种类:
红细胞(绵羊、家兔、人O型)
聚苯乙烯胶乳颗粒(人工合成高分子材料)等
活性炭粒、、硅酸铝颗粒
Δ致敏微粒/致敏颗粒:
吸附有抗原或抗体的载体颗粒
Δ间接凝集试验命名(根据载体不同)
血凝试验(以RBC为载体)
乳胶凝集试验(以胶乳颗粒为载体)
Δ(正向)间接(血、胶乳)凝集试验
原理:
将已知的可溶性抗原吸附于颗粒性载体上,检测未知抗体
Δ反向间接(血、胶乳)凝集试验
原理:
将已知抗体吸附于颗粒性载体上,检测未知抗原
实例:
检测HBsAg、AFP等
Δ间接凝集抑制试验
原理:
待测样本(可溶性Ag?
)+已知Ab+已知致敏Ag颗粒(已成为颗粒性Ag)观察是否有凝集现象(不凝集为阳性,凝集为阴性)
实例:
检测小便中绒毛膜促性腺激素(HCG)
Δ协同凝集试验(coagglutination)
原理:
实质为反向间接凝集反应
实例:
葡萄球菌A蛋白(SPA)能非特异性地与IgG的Fc段结合,当与特异性抗原相遇时,IgG的Fab段与抗原结合,出现金葡菌的凝集现象(属特殊间接凝集试验)
用途:
用已知抗体检测未知抗原,用于多种抗原的检测
免疫标记技术
Δ免疫标记技术的原理
用可以微量检测的标记物(示踪物质)标记抗原或抗体,作为试剂,与相应抗体或抗原结合反应后,测定抗原抗体复合物中的标记物,从而推断所测抗体或抗原有无及量的多少
免疫标记技术=免疫技术+标记技术
免疫技术:
抗原抗体反应(特异性)
示踪物标记:
酶、荧光素、同位素(灵敏性)
特点:
高特异性、高灵敏性
Δ分类
免疫标记技术放射免疫技术酶免疫组化技术双抗体夹心法
免疫酶技术竞争抑制法
免疫荧光技术酶联免疫吸附技术双抗原夹心法
其他标记技术间接法
双位点一点法
Δ常用标记物
荧光素、酶、同位素、胶体金、可发光化学物质
Δ免疫荧光技术(IF)免疫荧光显微技术(定性)
免疫荧光测定技术(定量)
原理:
用荧光素标记抗原或抗体,与待测标本中相应抗体或抗原结合,通过检测荧光,确定标本中有无待测的抗体或抗原
Δ常用荧光素
异硫氰酸荧光黄(FITC)黄绿色
四乙基罗丹明(RB200)橘红色
四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)橙红色
Δ荧光显微镜主要组成
A.白炽光源(超高压汞灯)紫外光or兰紫光
B.两组滤光板激发滤板激发光谱
抑制滤板抑制紫外光or兰紫光,只许荧光通过
C.显微镜普通光学显微镜
光路程序:
白炽光源发射紫外光or兰紫光——激发滤板——紫外光——被检物(荧光染色标本)——紫外光+荧光——抑制滤板——荧光(我们肉眼见)
Δ一般免疫荧光显微技术均标记抗体
Δ片子制作:
切片、涂片、印片
Δ荧光抗体染色法
①直接法:
待测标本固定(Ag?
)+*Ab——*AgAb
用途:
检测抗原
优点:
快,直接,干扰因素少
缺点:
每检测一种抗原要标记一种荧光抗体,较麻烦
②间接法(用得最多)
Step1:
荧光素标记抗抗体(如荧光素标记的羊抗人IgG)
Step2:
已知Ag固定+待测标本(Ab?
)——洗,+荧光标记的抗抗体——洗,荧光显微镜镜检
优点:
①制备一种荧光标记二抗(抗抗体)可用于多种Ab检测
②灵敏度高
③补体法
Step1:
荧光素标记抗补体
Step2:
已知Ag固定+待测标本(Ab?
)+补体——洗,+荧光标记的抗补体——洗,荧光显微镜镜检
优点:
灵敏度高,制备一种荧光抗补体用于多种检测
缺点:
干扰因素多,补体不稳定,易失活,该法少用
④双标记法
用两种荧光素(FITC、罗丹明)分别标记针对同一Ag上不同抗原表位的抗体,对同一标本染色,当Ag有两种相应抗原表位存在时,可同时见到黄绿和橙红两种荧光
Δ免疫荧光显微技术优缺点
优点:
①特异性、敏感性高
②快速
③可定位
④既可测Ag又可测Ab
缺点:
①需要荧光显微镜
②存在非特异荧光干扰(原因是自发抗体不纯,交叉反应、技术问题)
③定性测定、判断结果不客观
④制备片子难保存(荧光猝灭)
Δ时间分辨荧光免疫测定(液相检测)
原理:
用铕(Eu)等具有较长荧光寿命的稀土金属作荧光标记物来标记Ab或Ag,从而检测标本中相应Ag或Ab的新技术
特点:
①利用时间分辨荧光仪延缓检测时间,排除非特异性干扰荧光
②灵敏度可达0.2~1ng/ml
免疫酶技术
Δ优点:
较IF、RIA更优越,敏感、安全、稳定、易观察结果
Δ原理:
利用酶标记Ag或Ab后不改变Ag、Ab反应特异性,同时又不影响酶的活性,结合在AgAb上的酶催化底物,生成有色产物,根据产物颜色深浅推测出待测物中相应物质(Ag、Ab)有无及含量多少
Ag+AbE——AgAbE+底物
呈色反应
Δ特点
特异性:
Ag、Ab反应
敏感性:
酶的高效催化作用
Δ分类
酶免疫组织化学染色技术(免疫组化)
酶免疫测定法(酶联免疫吸附试验
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- 临床 免疫学 检验 五年制 医学 专业 适用
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