绝经后退行性脊柱滑脱椎体软骨终板内雌激素受体表达与青年女性的不同.docx
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绝经后退行性脊柱滑脱椎体软骨终板内雌激素受体表达与青年女性的不同
绝经后退行性脊柱滑脱椎体软骨终板内雌激素受体表达与青年女性的不同
【摘要】目的:
探讨雌激素受体(ER)在绝经后退行性脊柱滑脱(DS)软骨终板内的表达及其意义。
方式:
用RTPCR方式检测绝经后DS与绝经前年轻女性正常腰椎(N)的软骨终板内ERmRNA的表达;Westernblot方式检测绝经后DS与N的软骨终板内ER蛋白质的表达;用免疫组织化学法(Envision法)检测绝经后DS与N的软骨终板内ER的散布和表达,测定绝经后DS患者血液中雌激素浓度;分析雌激素、ER和DS之间的关系。
结果:
ERmRNA的表达量在绝经后DS的软骨终板中较N明显下降(P<);绝经后DS的软骨终板中ER蛋白质的表达量较N明显下降(P<);免疫组织化学结果显示ER在绝经后DS的软骨终板中仅少量表达,在N的软骨终板中表达量较强;绝经后DS患者血液中雌激素浓度明显下降。
结论:
女性在绝经后体内雌激素下降,软骨终板中ER表达量较N显著下调,可能是引发绝经后女性DS多发的缘故之一。
【关键词】雌激素受体退行性脊柱滑脱软骨终板
脊柱不稳是指在脊柱结构丧失维持其自身生理平稳位置的能力,致使脊柱节段间位移超出其生理限度关于承载的异样反映。
最多见的为退行性腰椎不稳,长期的不稳慢慢进展为退行性脊柱滑脱(degenerativespondylolishesisDS)。
DS是一种独特形式的椎体滑脱,为神经孔完整的进展性椎体滑移[1]。
但是,DS的病因还不清楚。
在过去几十年中,大多数研究仅强调了关节突关节形态的异样[23],但Love等[4]指出小关节角度的增加是小关节炎重建的结果,而不是DS的起始病因。
DS多见于女性,在40岁以前一样不发病,绝经后发病率显著升高。
这说明雌激素在DS发病中可能有潜在作用。
Richmond等[5]发觉成人软骨细胞中有雌激素受体(ER)α、ERβ的mRNA表达和ER蛋白的存在,说明软骨是雌激素灵敏性组织。
女性绝经后体内雌激素水平下降,下调ER的表达,可能是绝经后妇女多发DS的缘故之一。
本研究对成年女性软骨终板上ER进行检测,比较绝经前后软骨终板上ER的表达情形,旨在说明雌激素及其受体在DS中的可能作用。
1材料与方式
标本来源
取2006年4月2006年8月期间东南大学附属中大医院骨科因DS行椎间植骨融合椎弓根钉内固定术的绝经后患者共18例,术顶用刮勺刮取软骨终板(不包括骨性终板和软骨下骨)作为实验组,同期本校解剖教研室取新鲜女性尸身软骨终板18例作为对照组。
所有标本保留于-80℃待提取RNA及蛋白质。
记录患者和尸身的体重、年龄和体重指数。
以人群绝经前妇女血液中平均雌激素浓度作为对照组,测患者术前早晨空肚血液中雌激素浓度作为实验组。
要紧试剂
兔抗人ERβ抗体(Abcam公司,英国),羊抗兔第二抗体(南京大治生物),显色试剂DAB(北京中杉生物)。
TRNzol总RNA提取试剂盒(Takara公司),通用两步法RTPCR试剂盒(北京博大泰克生物基因技术有限责任公司)。
实验方式
RTPCR
(1)细胞总RNA的提取:
用微量天平称取100mg组织,液氮冷冻,在研钵中不断加入液氮的情形下研磨成粉末状,转入2ml玻璃匀浆管在冰浴下制成组织匀浆,加入2mlTRNzol试剂。
按试剂说明书提取细胞内的总RNA,紫外分光光度仪(UV755B型,上海周密科学仪器)测定其浓度和纯度,重复3次,计算样本总RNA浓度,A260/A280值在之间。
(2)RNA完整性的鉴定:
溴化乙锭凝胶电泳,显示28S、18S及5S3条带,且28S/18S为2/1。
(3)引物的设计与合成:
在GenBank查到人类ERβ和βactin(内参)的编码序列及合成引物序列。
ERβ扩增产物的长度为888bp,上游引物为5′AAGAGCTGCCAGGCCTGC3′,下游引物为5′CATCTCCAGCAGCAGGTCA3′;βactin扩增产物长度为621bp,上游引物为5′ACACTGTGCCCATCTACGAGG3′,下游引物为5′AGGGGCCGGACTCGTCATACT3′。
(4)RTPCR及凝胶成像分析:
依照两步法RTPCR试剂盒说明书别离进行反转录和PCR扩增,PCR的反映条件为变性94℃1min,退火55℃1min,延伸70℃1min,共35个循环,最后1个循环72℃延伸7min。
取5μl的PCR产物在%的琼脂糖凝胶上电泳分离,应用imageMASTER凝胶成像仪照相,而后用Labimage灰度分析软件分析ER和βactin条带的强度,强度以灰度乘以面积表示。
计算ER/βactin的值(D值),正常软骨终板的D值/DS软骨终板的D值≥(ND/DD≥)即为阳性。
Westernblot
(1)用微量天平称取50100mg组织,加入1ml裂解液低温快速匀浆,采纳紫外分光光度法测定蛋白浓度。
取蛋白100μg经10%的SDSPAGE凝胶电泳后转移至硝酸纤维素膜上,5%的脱脂奶粉PBST溶液室温下封锁1h,PBST洗膜后加入5%的脱脂奶粉PBST溶液配制的兔抗人ERβ抗体(1∶500)4℃留宿,洗膜后与用HRP标记的二抗进行杂交,洗膜后加入DAB进行显色。
(2)结果于imageMASTER凝胶成像仪下扫描,扫描结果用Labimage灰度分析软件进行强度分析,强度以灰度与面积的乘积表示。
免疫组织化学法
(1)终板组织经硝酸脱钙、蜡块包埋,蜡块切片(4μm)常规脱蜡水化,柠檬酸组织抗原修复液对切片进行高压抗原修复,加50μl兔抗人ERβ抗体(1∶100),室温下孵育1h,加50μl二抗,室温下孵育1015min,加100μl新鲜配制的DAB显色4min,自来水冲洗终止显色,苏木素复染,切片用酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封片,对切片拍照。
(2)染色阳性表达为棕黄色,无着色为阴性。
以不加一抗为对照。
雌激素浓度的测定采取静脉血2ml,EDTA抗凝,离心取血清,采纳酶联免疫吸附的方式测定。
统计学处置
实验数据以x-±s表示,采纳SPSS统计软件进行分析,组间比较采纳t查验和方差分析,P<为有统计学意义。
2结果
所取标本的人群特点
实验组DS患者的平均年龄为岁(4368岁),对照组的平均年龄为岁(1827岁);实验组和对照组人群的体重为(±)kg和(±)kg,P=,两组之间无显著不同;实验组和对照组人群的BMI(体重指数)为(±)kg·m-2和(±)kg·m-2,P=,两组之间无显著不同。
ERβmRNA在腰椎软骨终板中的表达
通过RTPCR检测发觉ERβmRNA的表达量在DS软骨终板中明显低于正常腰椎(图1A),经灰度分析发觉条带强度在DS软骨终板中为±,在正常腰椎软骨终板中为±,且ND/DD的均值为(图1B),两组之间的不同有显著性(P<)。
ERβ蛋白质在腰椎软骨终板中的表达
通过Westernblot检测发觉ERβ蛋白质的表达量在DS软骨终板中显著低于正常腰椎,经灰度分析发觉条带强度在DS软骨终板中为±,在正常腰椎软骨终板中为±,两组之间的不同有显著性(P<),而且此结果与RTPCR结果大体一致。
见图2。
免疫组织化学染色结果
免疫组织化学检测可见ERβ为胞内受体;正常女性腰椎软骨终板中胶原纤维排列紧密,DS软骨终板中胶原纤维排列紊乱,细胞数减少;女性DS软骨终板中ERβ和正常腰椎软骨终板相较明显减少。
见图3。
血液中雌激素浓度检测结果
人群绝经前女性血液中雌激素的浓度[6]卵泡期为37330pmol·L-1,排卵期为3671835pmol·L-1,黄体期为184881pmol·L-1;实验组女性患者血液平均雌激素浓度为56pmol·L-1,同绝经前相较明显降低。
3讨论
腰椎的稳固是其运动节段的内源性稳固因素与外力负荷彼此作历时的平稳状态,即一种“稳态”,而不稳那么是这种“稳态”被破坏后显现的失稳状态,当这种失稳状态引发出各类临床病症时即显现了不稳症。
腰椎的运动节段包括1个椎体间关节和2个关节突关节,正常情形下这3个关节维持着机械性平稳,但如果是其中1个显现异样,那么最终将破坏这种平稳而使运动节段失去稳固性。
过去以为关节突关节的退变、损伤、角度的增加是引发腰椎失稳的要紧缘故,但Love等[4]指出小关节角度的增加是小关节炎重建的结果,而不是DS的起始病;而且早在1989年国内学者就已指出,腰椎间盘的退变可引发椎间盘高度下降,关节突关节囊松弛而重叠加大,黄韧带回缩变厚,从而致使腰椎内在力学因素的改变,显现腰椎负重力线的从头散布,使相邻节段的椎体不稳[7]。
Imada等[8]通过病例对照研究发觉卵巢切除后病人DS的发病率是非切除病人的3倍,他们以为这是由于卵巢切除造成体内雌激素水平急剧下降而使椎旁韧带系统的弹性丧失造成的,而忽略了椎间盘在这其中的作用。
Yves等[9]通过研究雌激素替代和非替代医治的绝经后妇女椎间盘高度发觉,替代医治组能够显著维持椎间盘的高度。
这些研究说明雌激素有维持椎间盘高度、避免椎间盘退变的作用。
椎间盘是由软骨终板、纤维环和髓核组成,由于椎间盘是全身最大的无血管组织,其营养来源要紧依托于软骨终板的渗透作用,因此椎间盘功能的维持依托于软骨终板的功能。
软骨终板是由软骨细胞及其分泌的基质Ⅱ型胶原、蛋白多糖和水组成。
Richmond等[5]通过RTPCR和免疫组化的方式证明了成人软骨细胞中ERα、ERβ的mRNA表达和ER蛋白的存在,说明软骨是雌激素灵敏组织。
在本研究中通过RTPCR和Westernblot发此刻软骨终板中存在ERβ,说明腰椎软骨终板也是雌激素灵敏性组织,而且还发觉,绝经后DS患者软骨终板中ERβ较正常腰椎显著下降。
最近几年来的研究说明,雌激素通过一系列的机制作用于软骨细胞,阻碍软骨组织的基质成份,从而阻碍其功能。
万荣等[1011]通过在培育的软骨细胞中加入不同浓度的17β雌二醇发觉,雌二醇阻碍软骨细胞胶原表型和蛋白多糖的分泌,不同浓度对软骨细胞分泌功能的阻碍不同,生理浓度的雌二醇能够增进软骨细胞分泌蛋白多糖和Ⅱ型胶原的分泌。
还有学者通过卵巢切除术成立雌激素缺乏(绝经)动物模型和17β雌二醇替代医治的研究发觉,卵巢切除术后关节软骨的损伤较对照组明显加重,关节软骨和软骨下骨的厚度和硬度增加,雌激素替代医治能够减缓软骨的损伤[1213]。
雌二醇能够缓和母羊卵巢切除术后关节软骨中蛋白多糖含量和骨密度的下降[14]。
不仅如此,Lee等[15]发觉通过在培育的软骨细胞中加入17β雌二醇,能够降低软骨细胞MMP1的合成,维持MMPs和TIMPs之间的平稳,发挥对软骨细胞的爱惜作用。
采纳一样的方式,Horst等[16]发觉雌激素能够爱惜软骨细胞免受氧化应激的损害作用。
同时雌激素能够通过调剂胰岛素样生长因子水平增加蛋白多糖和胶原的合成,减少细胞因子介导的软骨基质的降解[5]。
上述研究说明雌激素能够增进终板软骨细胞合成、分泌蛋白多糖和Ⅱ型胶原,从而维持终板软骨的基质成份,对终板软骨发挥爱惜性作用。
通过检测血液中雌激素浓度发觉,女性在绝经后体内雌激素水平显著下降,由于ER本身处于不断合成和分解当中,受其配体雌激素的调剂,雌激素水平的下降引发软骨细胞上ER数量和亲和力下调。
而刘斌等[17]通过对椎体终板软骨细胞的提取和培育发觉,软骨终板中的软骨细胞和关节软骨细胞的表型和功能相似。
由于体内雌激素水平下降、软骨细胞上ER的下调,软骨终板基质分泌下降、降解增加致使软骨终板的退变,阻碍葡萄糖、氧等营养物质软骨终板的渗透和椎间盘代谢废物的排除,致使髓核内低氧、低葡萄糖、低pH值、高酸的微环境,髓核细胞功能改变,基质分泌功能下降,致使椎间盘的退变。
软骨终板和椎间盘的退变使其不能正常发挥其传递负荷、吸收震荡的功能,腰椎的负重力线发生改变,关节突关节负重增加,关节突关节损伤、退变、角度增加,从而发生腰椎不稳,长期的不稳慢慢进展为DS。
因此,女性在绝经后体内雌激素水平的下降及软骨细胞上ER的下调可能是DS发生的缘故之一。
体重和BMI是引发退行性腰椎不稳的常见阻碍因素,而在本研究中所选取的实验组和对照组在体重和BMI之间无显著不同,排除实验组由于与对照组体重和BMI的不同而引发的DS。
本研究发觉,在腰椎软骨终板中存在ER,而且绝经后退行性腰椎不稳患者体内雌激素浓度较绝经前人群明显下降,软骨终板中ERmRNA和蛋白的表达量较青年女性腰椎软骨终板内显著下调,说明雌激素及其受体可能是退行性腰椎不稳的发生进展缘故之一。
这为咱们进一步研究雌激素及其受体在退行性腰椎不稳中的作用提供了必然的理论基础。
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