耐逆的腈水解酶等化工酶在芽孢表面固定化并优化其连接肽提高固定化效果.docx

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耐逆的腈水解酶等化工酶在芽孢表面固定化并优化其连接肽提高固定化效果

摘要

腈水解酶作为一种重要的工业酶能够直接将有毒腈化物转化为相应的无毒酸和氨，应用广泛。

腈水解酶介导的生物催化制备某些羧酸化合物已经代替了传统的化学合成法，其反应条件温和，环境友好，选择性高等优点，引起研究者密切关注，因此筛选获得更多具有优良性质的腈水解酶具有很大的意义。

近年，枯草杆菌孢子展示技术作为一种新型的蛋白固定化方式引起广泛关注，由于枯草杆菌芽孢具有高稳定性和抗逆性，使得芽孢便成为了一个优秀的固定化载体在其表面展示外源蛋白。

目前有关利用芽孢展示技术进行耐逆化工酶酶的固定化报道较少，本文首次克隆表达鉴定了来自ThermotogamaritimaMSB8的腈水解酶并展示在芽孢表面，然后对连接孢子表面衣壳蛋白与腈水解酶的连接肽进行了初步优化。

本研究中，首次从ThermotogamaritimaMSB8基因组扩增到腈水解酶基因，并连接到原核表达载体PET-28a上，构建表达质粒PET-28a-nit，然后转化入大肠杆菌BL21，IPTG诱导表达后经SDS-PAGE鉴定，分子量在30kDa左右，与预测一致。

对ThermotogamaritimaMSB8腈水解酶的酶学性质进行了研究，发现以3-氰基吡啶作为反应底物时，该腈水解酶的最适反应温度和pH分别为45℃和7.5。

热耐受性试验显示在75℃环境下处理0.5h能够保留将近50%的酶活，酸碱耐受性试验显示该腈水解酶对碱性反应条件的比较敏感。

Mn2+，Zn2+和Cu2+能显著抑制酶活，Mg2+和Fe2+.能够稍微促进酶活，其它的一些金属离子和金属离子螯合剂EDTA对酶活没有显著影响。

还原剂二硫苏糖醇DTT能够一定程度促进酶活，其它一些还原剂、表面活性剂、蛋白酶抑制剂和有机溶剂都对该腈水解酶活性产生了不同程度的抑制作用。

该腈水解酶的动力学常数Vm和Km值分别为3.12μmol/min/mg和7.63mM，催化常数为kcat/Km为0.44/mM/s，底物谱研究表明该腈水解酶对脂肪族双腈具有明显的特异性。

本研究以枯草杆菌芽孢作为酶的固定化载体展示腈水解酶，我们构了建E.coli–B.subtilis穿梭表达质粒pHS-CotG-nit，通过westernblot分析和蛋白酶处理，结果证明融合蛋白成功展示在枯草芽孢杆菌孢子表面，即完成了固定化。

展示后的腈水解酶最适反应温度和pH分别为50℃和pH8.0，比游离的腈水解酶要高，展示后的腈水解酶在75℃和pH8.0处理1h后残留的活力分别为79%和97%，而相应游离腈水解酶只残留32%和52%的活力，重复利用试验结果表明使用5次循环后可以保留高达83%的活性。

本研究初步探究了不同连接肽对孢子展示腈水解酶的影响。

结果显示含有连接肽L0、L3、L4、L4、L5、L6、L9展示腈水解酶最适反应温度和pH分别为45℃和7.5，L2、L7、L10、L11为50℃和8.0，L8为55℃和8.5，在85℃处理3hL8残留活性最高为19.5%，无连接肽的L0残留活性为7.3%，前者将近是后者的3倍，热稳定最好的连接肽为L8：

GGGGSEAAAKGGGGS。

在pH9.0处理3hL8残留活性最高为21.5%，无连接肽的L0为11.3%，前者将近是后者的2倍，碱稳定性最好的连接肽也是L8：

GGGGSEAAAKGGGGS。

在1mM的二硫苏糖醇DTT，1%v/vSDS，20%v/v乙醇中稳定最好的连接肽分别为MGSSN、GGGGSEAAAKGGGGS和（GGGGS）3。

本研究为耐逆的腈水解酶等化工酶在芽孢表面固定化并优化其连接肽提高固定化效果提供了一种新型的参考方法，以此满足工业上对恶劣环境下生物催化的需求。

关键词：

腈水解酶，热耐受性，酸碱耐受性，酶的固定化，芽孢表面展示，连接肽

目录

第一章绪论1

1.1腈水解酶1

1.1.1腈化物的生物催化1

1.1.2腈水解酶的简介及其来源与种类2

1.1.3腈水解酶的结构及其催化机理5

1.1.4腈水解酶的克隆及其表达7

1.1.5腈水解酶生物转化的应用8

1.1.6腈水解酶未来的研究发展方向12

1.2枯草芽孢杆菌孢子表面展示系统的研究进展15

1.2.1研究背景15

1.2.2枯草芽孢杆菌孢子固定化酶16

1.3不同连接肽的研究进展及其应用17

1.4研究意义19

1.5研究内容和技术路线19

1.5.1研究内容19

1.5.2技术路线20

第二章ThermotogamaritimaMSB8腈水解酶的克隆表达及其纯化22

2.1材料与试剂22

2.1.1菌株和质粒22

2.1.2工具酶和试剂盒22

2.1.3其它试剂22

2.1.4培养基和缓冲液23

2.1.5实验仪器24

2.2实验方法25

2.2.1腈水解酶基因的克隆25

2.2.2腈水解酶原核表达载体PET-28a-nit的构建26

2.2.3腈水解酶的表达和纯化28

2.3实验结果和分析30

2.3.1生物信息学分析30

2.3.2原核表达载体PET-28a-nit的构建33

34

2.3.3重组腈水解酶的表达纯化35

2.4本章小结36

第三章ThermotogamaritimaMSB8腈水解酶酶学性质研究38

3.1材料与试剂38

3.1.1主要试剂38

3.1.2缓冲液和显色液配置38

3.1.3实验仪器40

3.2实验方法40

3.2.1重组腈水解酶的测定方法40

3.2.2温度对重组腈水解酶的影响41

3.2.3pH对重组腈水解酶的影响42

3.2.4不同金属离子和化学试剂对重组腈水解酶活性的影响42

3.2.5不同有机溶剂对重组腈水解酶活性的影响42

3.2.6重组腈水解酶的动力学常数和底物特异性测定43

3.3实验结果和分析43

3.3.1重组腈水解酶的最适温度和温度耐受性43

3.3.2重组腈水解酶的最适pH和pH耐受性45

3.3.3金属离子和化学试剂对重组腈水解酶活性的影响47

3.3.4有机溶剂对重组腈水解酶活性的影响49

3.3.5重组腈水解酶的动力学常数和底物谱50

3.4本章小结53

第四章ThermotogamaritimaMSB8腈水解酶在枯草芽孢杆菌孢子表面展示55

4.1材料与试剂56

4.1.1菌种和质粒56

4.1.2工具酶和试剂56

4.1.3培养基和缓冲液57

4.1.4主要实验仪器58

4.2实验方法58

4.2.1B.subtilis168全基因组DNA提取58

4.2.2pHS-CotG的构建59

4.2.3重组表达质粒pHS-CotG-nit的构建61

4.2.5B.subtilis重组孢子的制备66

4.2.6孢子表面展示腈水解酶的验证66

4.2.7固定化后腈水解酶活性分析67

4.3实验结果与分析69

4.3.1重组表达质粒的构建69

4.3.2westernblot分析和蛋白酶处理70

4.3.3孢子表面展示后腈水解酶的最适反应温度和温度耐受性73

4.3.4孢子表面展示后腈水解酶的最适反应pH和pH耐受性75

4.3.5不同化合物对孢子表面展示后腈水解酶的影响78

4.3.6孢子表面展示后腈水解酶的循环利用78

4.4本章小结80

第五章不同连接肽对孢子表面展示ThermotogamaritimaMSB8腈水解酶的影响81

5.1材料与试剂81

5.1.1菌种和质粒81

5.1.2工具酶和试剂81

5.1.3培养基和缓冲液82

5.1.4主要实验仪器82

5.2实验方法82

5.3实验结果与分析84

5.3.1重组质粒的构建84

5.3.2westernblot分析和蛋白酶处理85

5.3.3最适反应温度和温度耐受性86

5.3.4最适反应pH和pH耐受性88

5.3.5在不同化合物中的稳定性91

5.4本章小结93

第六章总结和展望94

6.1工作总结94

6.2展望95

参考文献97

致谢108

在学期间发表的学术论文109

硕士期间参与的课题110

第一章绪论

1.1腈水解酶

1.1.1腈化物的生物催化

在过去的几十年里，生物催化一直被认为是化工行业具有发展远景的领域。

利用生物催化可以制备不同的化合物从而被广泛应用于农业，医药，纺织，环境，能源，化工等领域。

据估计到2020年生物催化将占到化工行业超过20%的应用比例。

除此之外，在科学研究和工业应用当中仍然需要全新并且高效的生物催化剂[1-3]。

工业生物催化作为工业生物技术的核心，由于其优良的催化效率和环境友好的特性被认为是未来的绿色化学发展方向[3,4]。

随着分子生物学，基因组学，生物信息学和高级DNA技术的发展，工业生物催化剂的研究将面临巨大的机会和挑战。

酶作为绿色的生物催化剂，能够利用许多的复杂的分子作为底物，同时具有良好的手性和区域选择性[5]。

酶促生物催化反应已经广泛用于生产一系列化合物，主要包括食品添加剂，活性药物，农药中间体，医药中间体，清洁剂和其他一些精细化学品[6-9]。

酶促生物催化具有许多优点，主要包括温和的反应条件，环境友好，避免高温高压，高活性和选择性等等[5]。

腈化物作为生物催化的底物，通常以无机腈（HCN）和有机腈（RCN）的形式广泛分布于自然环境中。

一般它以氰基糖苷、氰基类脂、蓖麻碱等形式存在于植物体内从而分布于自然界[10]。

化工行业会大量使用不同的腈化物来生产各种各样的聚合物和其他一些化合物。

虽然大多数腈化物本身具有毒性，致癌性，但是它们仍然被用作有机合成胺，氨基化合物，脒，羧酸，酯，羰基配合物，杂环化合物等物质的中间体[10,11]。

腈化物的化学水解反应条件比较苛刻，需要强酸强碱，高温高压等，此外还伴随着大量盐的形成，这样不仅会使后续的分离纯化变得困难，还会造成环境污染[11]。

因此酶促催化不同的腈化物被认为是一种有效的方法来制备各种不同的化合物。

此外，酶促水解环境污染中有毒的腈化物还可以用于环境修复治理[12,13]，常见的的包括工业中乱排放的包含丙烯腈的污水以及包含羟敌草腈，溴苯腈，碘苯腈的农业污水。

涉及腈化物的生物催化主要包括两种酶：

腈水解酶（Nitrilase;EC3.5.5.1）直接将腈化物转化为羧酸和氨；腈水合酶（NHase;EC4.2.1.84）先将腈化物转化为酰胺，再由酰胺酶（Amidase;EC3.5.1.4）转化为羧酸和氨。

本文研究的为腈水解酶。

1.1.2腈水解酶的简介及其来源与种类

腈水解酶（EC3·5·5·1）隶属于腈水解酶超家族，是一种重要的工业用酶，广泛存在于原核和真核生物中。

腈水解酶能够直接将各种腈化物水解为相应的羧酸和氨[14]。

近年来，腈水解酶介导的生物催化已经引起了专家学者和企业家们的广泛关注。

第一个腈水解酶发现于上世纪60年代[15]，在那之后进行了一系列的关于腈水解酶在化学合成上的研究。

在过去几十年里，陆续发现了各种各样产腈水解酶的生物，主要包括细菌，丝状真菌，酵母，植物[10,16-18]，其中的一些已经达到了工业规模来商业化生产羧酸，成功的案例包括德国巴斯夫公司和日本三菱公司生产的（R）-（−）-扁桃酸，中国广州龙沙公司生产的烟酸，都达到了工业化的生产规模，以此也反映出了腈水解酶的巨大应用前景[19,20]。

近六年来关于腈水解酶研究的文章和专利也分别达到了253篇和57项[21]。

（1）细菌腈水解酶

虽然上个世纪60年代第一个腈水解酶发现于植物当中，但是在那之后关于腈水解酶的研究重点却放在细菌上。

第一个产腈水解酶的细菌菌株从土壤中分离得到，它能够水解蓖麻碱中的腈基，经过初级形态学分析，确认该菌株属于假单胞菌属。

之后又对该菌株中的腈水解酶进行了纯化和酶学性质鉴定[22,23]。

自那以后，陆续报道了一些具有腈水解酶活性的菌株，主要包括红球菌属，诺卡氏菌属，不动杆菌属，产碱杆菌属，假单胞菌属，芽孢杆菌属，棒状杆菌等等。

其中的多个腈水解酶得到了分离纯化和酶学性质鉴定，固定化和克隆表达，甚至有的腈水解酶得到了工业化应用。

比如来自玫瑰红球菌R.rhodochrousJ1的腈水解酶就被成功用于工业规模生产酰胺化合物和羧酸，从而极大促进了该领域科学家和企业家的研究信心。

因此，在过去的二十年间关于产腈水解酶的细菌报道每年都在快速增长。

（2）真菌腈水解酶

早期的研究报告具有腈水解酶活性的真菌主要包括镰刀菌属，曲霉属和青霉属，它们都能够将吲哚乙腈（IAN）转化为吲哚乙酸（IAA）[15]。

然而，在那之后很少有报道关于具有腈水解酶活性的真菌，或者更准确的说，只有一篇文章报道了一株来自F.solani的真菌具有降解除草剂溴苯腈和碘苯腈的能力[24]。

在那之后，以苯甲腈作为唯一的碳源和氮源，从溴苯腈处理过的土壤中分离得到一株具有腈水解酶活性的真菌F.solaniIMI196840并对其进行了分离纯化和酶学性质鉴定，接着验证了该腈水解酶在环境修复当中具有降解除草剂的能力[25]。

在那之后十几年F.solani是唯一被鉴定的真菌腈水解酶。

到1989年又报道一株产腈水解酶的真菌F.oxysporumf.sp.Melonis。

之后，一支来自捷克的研究小组一直致力于腈水解酶的研究，尤其是真菌腈水解酶。

该小组对来自真菌A.nigerK10和F.solaniO1的腈水解酶进行了分离纯化和固定化，并且应用在羧酸合成，结果表明这两个真菌腈水解酶在腈化物的转化中是非常有潜力的生物催化剂[26-28]。

（3）酵母腈水解酶

目前已报道的能够降解腈化物的酵母达到了60多种，其中主要包括Candida,Pichia,Saccharomyces,Hanseniaspora,Debaryomyces,Geotrichum,Williopsis,Torulopsis,Exophiala,Kluyveromyces,Aureobasidium,Cryptococcus,和Rhodotorula菌属，它们主要是从含腈化物废弃物处理装置，土壤和发酵食品中获得[29,30]。

尽管如此但是这些菌属中大多数并不包含腈水解酶体系，而只是包含腈水合酶-酰胺酶体系，只有少数的几个酵母菌表现出腈水解酶活性。

Fukuda等人使用以D,L-α-羟基异戊腈作为唯一氮源的富集培养基筛选获得了一株T.candidaGN405酵母菌株，该菌株能够将D,L-α-羟基腈化物转化为具有光学活性的D,L-α-羟基酸，却不能够转化D,L-α-氨基腈化物[31]。

酵母腈水解酶介导的生物转化反应往往是在酸性条件，而这样的反应条件却不是酵母菌株生长的最适pH，一般情况酵母的最适生长pH在4.0-7.0之间。

因此酵母腈水解酶更适合水解羟基或者氨基腈化物，这就自然表明了酵母腈水解酶能够在中性条件下进行催化反应，但是在酸性pH条件下更加的稳定。

RustlerS等人从pH值为4.0的选择培养基中分离得到一株能够水解腈化物的酵母菌株E.oligospermaR1，该酵母菌株在酸性条件下对羟基化物展现出了显著的稳定性和优良的催化效率[18,32]。

Rezende等人的研究揭示了来自Cryptococcussp.UFMG-Y28的腈水解酶在以苯甲腈为唯一氮源的情况下能够得到诱导表达。

除此之外，他们还发现该酵母菌株生长在以其它腈化物为氮源的培养基中能够表达腈水合酶和酰胺酶[33]。

（4）植物腈水解酶

在腈水解酶超家族里，来自植物的腈水解酶也是重要的一员。

关于植物腈水解酶的早期研究主要集中于它们能否将吲哚乙腈（IAN）转化为吲哚乙酸（IAA），而吲哚乙酸对植物的伸长生长具有促进作用。

然而，腈水解酶在植物生长激素生物合成过程中的具体作用目前仍然不清楚[17]。

第一个植物腈水解酶由Thimann于1964年发现于小麦之中，该腈水解酶能够将吲哚乙腈（IAN）转化为吲哚乙酸（IAA）[15]，在那之后陆续报道了一些植物体当中具有不同的腈化物，这从而也证明了腈水解酶广泛存在于植物体当中。

Rausch等人从中国大白菜种子当中部分分离得到了一种腈水解酶，并对其在吲哚乙酸合成中的作用进行了探究[34]。

来自Brassicarapa的腈水解酶对许多的脂肪族和芳香族腈水解酶展现出了较好的活性，但是对于吲哚乙腈并没有[35]。

据报道来自Sinapisalba和S.arvensis腈水解酶的最适底物分别是芳基甲基类腈化物4-羟基苯乙腈和4-甲氧基苯乙腈[36]。

来自十字花科中一员的拟南芥Arabidopsisthaliana则表达了四种腈水解酶，分别命名为AtNIT1，AtNIT2，AtNIT3，AtNIT4。

其中AtNIT1，AtNIT2，AtNIT3都能够将吲哚乙腈（IAN）转化为吲哚乙酸（IAA），并且三者之间序列也非常相似[37,38]。

只有AtNIT4与其它三个不同，与AtNIT1，AtNIT2，AtNIT3相比，AtNIT4只有65%的氨基酸重合度。

AtNIT4基因位于5号染色体上，而AtNIT1，AtNIT2，AtNIT3基因却聚集在3号染色体上，并且互相之间有超过80%的重合度[39]。

除此之外，研究发现4类腈水解酶基因存在于所有植物当中，甚至包括苔藓当中[17,38]。

4类腈水解酶类主要作用于β-氰基-L-丙氨酸，而该化合物是植物氰基解毒途径中一种重要的中间产物[37,40]。

近年来对于植物腈水解酶的研究主要揭示了它们对氰化物的解毒功能。

氰化物是一种高毒的物质，一方面它是所有植物当中都存在的生物合成植物生长激素乙烯所产生的副产物[41]，另一方面在某些植物当中氰化物的可能来源是生氰糖苷，这是一种植物自我防护的化合物，可以被β-葡萄糖苷酶或者α-羟基腈水解酶降解为乙醛，酮或者氰化氢[17]。

因此氰化物的解毒对于植物的生长而言非常重要。

Piotrowski等人从L.japonicus中成功克隆得到了一种腈水解酶基因，Lotusjaponicus包含两种产生氰基的α-羟基腈糖苷，经过表达该腈水解酶表现出了显著的β-氰基丙氨酸水解活性[17]。

根据Sánchez-PérezR等人的研究，杏仁和高粱当中生氰葡萄糖苷的分解代谢可能与腈水解酶的异二聚体有关[42]。

除此之外，其它的一些植物腈水解酶经过进化，可能会参与硫代葡萄糖苷或者生氰葡萄糖苷的分解代谢[36,38,39,41]。

一方面根据来源不同腈水解酶可分为细菌腈水解酶，真菌腈水解酶，酵母腈水解酶以及植物腈水解酶。

在此当中细菌腈水解酶包含最多。

另一方面根据底物特异性可分为脂肪族，芳香族和酰基乙腈腈水解酶，分别能水解脂肪族腈化物，芳香族腈化物和酰基乙腈类腈化物[43]。

1.1.3腈水解酶的结构及其催化机理

对腈水解酶的蛋白质结构和催化机理缺乏深入的了解可能是未来分子操作的一个主要障碍，比如对腈水解酶的结构进行合理设计。

因此，随着分子操作的不断增加，对于腈水解酶的蛋白质晶体结构和催化机理的测定变的越来越重要。

如图1.1所示，根据Brenner和他的同事研究表明，腈水解酶的蛋白质结构是一种全新的α-β-β-α三明治折叠结构，在此折叠中包含着一个Glu-Lys-Cys这样的三联体结构，而这样的三联体结构在腈水解酶的活性位点中起着关键的作用[44]。

Sewell小组的研究确定了来自R.rhodocrousJ1的腈水解酶具有三种同源低聚体结构形式：

一个二聚体，一个480kDa的复合体和一个延伸的螺旋结构[45]。

根据建立好的模型，来自R.rhodocrousJ1的腈水解酶具有一个延伸的C末端和两个重要的插入物，这两个插入物散布在螺旋低聚物之间并导致了螺旋的延长。

同时，电子显微镜也测定到了这些螺旋同源低聚体的3D结构。

该3D结构与来自属于腈水解酶超家族一员的P.stutzeri氰基双水合酶的结构相一致[46,47]。

根据扫描电镜的结果加上图形分类表明，来自G.pallidusRAPc8的腈水解酶展现出了不同的结构形式，包括类月牙形，C形，圆形和8字形[48]。

远紫外圆二色谱也被运用来检测来自F.solaniO1和F.solaniIMI196840腈水解酶的蛋白质二级结构[49]。

结果显示在它们的二级结构当中，这两个腈水解酶具有几乎类似的部分，包括30%α-螺旋，21%β-折叠，16%转角和33%其它结构。

许多研究小组研究过腈水解酶介导的生物催化反应的催化机理。

如图1.2所示，早在上个世纪60年代，Mahadevan等人发现第一个腈水解酶以来[15]，就曾推断腈化物上的碳原子具有部分的正电荷，而这些正电荷可能会受到腈水解酶两个巯基当中一个的亲核攻，产生的亚胺接着被水解为酮并释放出副产物NH3。

与此同时，酰基-酶复合物加入一分子的H2O后被最终水解为羧酸并重新释放出酶分子。

同一年，Hook和Robinson两人提出了一条类似的机理也能解释蓖麻碱腈水解酶介导的蓖麻碱的水解反应[23]。

从那以后该机理被该领域的研究学者所广泛的接受[10,50]。

然而，最近研究表明，在腈水解酶催化腈化物的过程中可能会形成酰胺化合物。

Piotrowski等人首次报道了来自Arabidopsisthaliana的腈水解酶具有腈水合酶的活性，该酶能够将β-氰基-L-丙氨酸转化为天冬氨酸和天冬酰胺（>60%）[37]。

因此，作者推测该反应可能要归因于一种新型的腈水合酶活性，而这不同于传统的腈水解酶反应机理。

这种腈水合酶活性可能是由于结合酶的底物在加入第一个H2O后提前释放出来，接着在迟到的第二个H2O基础上形成亚胺。

后来，又从立体空间结构和电子密度两方面研究了在腈水解酶介导下该酰胺化合物的形成，结果表明底物中存在的α-C构型对形成的羧酸和酰胺的比例有着很大的影响。

除此之外，低温和pH值增加会促使反应朝着生成酰胺反向进行。

同时α-位置的吸电子取代基也会促进酰胺的形成。

一些腈水解酶具有大小在30-45kDa之间的亚单位，这样必须要形成异源复合物从而获得催化活性。

禾本科Poaceae腈水解酶（NIT4）的活性完全来源于异源复合物，而这与其它的植物腈水解酶却不同[41]。

该复合物由两个不同形式的NIT4组成，分别为NIT4A和NIT4B。

Stevenson等人发现在RhodococcusATCC39484介导的生物催化反应当中，底物芳香环的结合会导致腈水解酶的聚集[51]。

这样的底物诱导模式通过47kDa单体的的聚集形成560kDa的复合体从而激活酶分子。

HPLC凝胶过滤能够检测到聚集和分离的平衡状态，在R.rhodochrousJ1腈水解酶当中也观察到了同样的情况，大量的盐溶液和有机溶剂能够促进这种聚集作用，腈水解酶在酶的聚集过程中是很不稳定的，所以只能在二聚体或者十倍体状态下能检测到腈水解酶活性[52]。

1.1.4腈水解酶的克隆及其表达

目前发现的天然腈水解酶普遍存在活力较低，稳定性较差等问题，由于这些因素的限制，腈水解酶的工业化应用存在一定的困难。

随着分子生物学的发展，利用基因工程的手段来改善传统天然酶为腈水解酶的工业化应用提供了新的思路。

通过对不同菌株腈水解酶基因的分析，将其克隆到表达菌株内，构建高效稳定的基因工程菌，为腈水解酶的工业化应用提供了可能。

早在1987年，Stalker等人从K.ozaenae中成功克隆到了编码溴苯腈（一种除草剂）的腈水解酶基因bxn，接着该bxn基因被连接到pUC18载体上并在