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细胞试验
细胞培养用试剂的配制
1、胰蛋白酶(trypsin):
0.02gEDTA-2Na、0.25g胰蛋白酶,用PBS定容于100mL容量瓶中。
2、PBS:
NaCl8g、KCl0.2g、Na2HPO42.9g、KH2PO40.2g,用超纯水定容于1000mL容量瓶中。
3、MTT(5mg/mL):
噻唑蓝,一般现配现用,过滤后4℃避光保存,MTT变为灰绿色时不可以再用。
MTT不好溶解时,可以多吹打几次,或者磁力搅拌器30min,外包锡箔纸。
MTT500mg,用PBS定容于100mL容量瓶中。
4、双抗:
氨苄西林(U)0.5g、硫酸链霉素(80万单位)1.25g,用超纯水定容于100mL容量瓶中。
注:
*有时不需要准确定容;
**细胞用试剂需用0.22μm微孔滤膜过滤除菌;
***链霉素终浓度为100μg/mL,氨苄西林终浓度为50μg/mL。
(0.5÷100=0.005g/mL,溶于100mL培养基,0.005g÷100mL=0.05mg/mL,即50μg/mL)
****为了充分溶解,4℃过夜,然后再分装于1.5mLEP管中,-20℃保存。
细胞初代培养
1、准备:
培养用品消毒放入经紫外照射30min的净化台内。
组织块,培养液易受紫外损伤的物品在培养时再放入操作野中。
2、漂洗、剪切、消化组织:
PBS洗组织块3次,组织块剪成3-5mm2块状,剪碎的组织放入三角烧瓶中,加入比组织量多30-50倍的0.25%的胰蛋白酶消化液,置于磁力搅拌器上(常用消化温度37℃,pH7.6-8.0),组织蓬松呈絮状可终止。
也可以采用冷消化法,即加入胰酶4℃过夜或更长。
消化时间依据组织块大小和硬度而定。
3、分离:
消化过程中消化液变浑浊,可吸取少量在镜下观察,若组织分散成细胞团或者单个细胞,立即终止,低速离心(500-1000rpm/min)5min,去上清,Hanks液漂洗3次,离心去上清,共两次,用筛网滤去为充分消化的组织块,低速离心(500-1000rpm/min)5min,去上清,加入一定量的培养液。
4、
细胞传代培养
每进行一次分离再培养称之为传一代,传至5-10代以内的细胞通常称为次代培养细胞,传至10-20代以上,确定为传代细胞。
初代培养的首次传代是关键:
贴壁细胞生长密度不高时或未覆盖整个瓶底时不可急于传代。
首次传代时细胞接种数量要多一些,以利于细胞生存和繁殖,若消化分离的细胞悬液有组织块,也一并传入到培养瓶,尽量减少细胞损失。
细胞的分类:
1、贴壁细胞(NH3T3细胞、293细胞即人胚肾细胞、原代培养的小鼠胚胎成纤维细胞均为贴壁生长细胞)——此类细胞贴壁较牢,采用酶消化法进行传代
2、半贴壁半悬浮细胞——此类细胞贴壁不牢,传代时可直接进行吹打
3、悬浮细胞——离心、去上清、重新接种
1、弃去培养基,PBS冲洗3遍
2、加1mL胰酶(2.5mg/mL)消化;
3、弃胰酶,加新鲜培养基3~5mL、血清少许终止消化,吹打掉瓶壁上的细胞,充分吹打;
4、将细胞悬液转至1.5mL离心管(1mL每管)中,1000rpm离心5min,吸去上清;
5、弃去EP管(或离心管)内的培养基,每管加入1mL新鲜的完全培养基,反复吹打,将沉淀重悬,即使细胞充分分开;
6、将细胞悬液转移至含有1%双抗、10%血清的培养基内(共6mL),吹打均匀;
7、观察细胞是否具有团块,放入5%CO2培养箱中培养。
注:
*PBS使用前要预热,否则易使细胞未经消化就大片脱壁。
*加入的消化液的体积以液面刚刚盖住细胞为宜。
*在倒置显微镜下观察细胞,若细胞变圆、间隙增大,相互之间不再连接成片,并且边缘变亮,或者细胞有成片浮起的现象,表明此时细胞消化适度,要立即终止消化。
*吹打时按顺序进行(消化后吹打细胞,用移液器吸取液体时沿培养皿从左到右、从上到下依次轻轻吹打培养皿底壁),确保所有瓶壁均被吹打到,防止细胞丢失,同时尽可能不要出现泡沫,以免导致细胞机械损伤,制成细胞悬液。
*弃去培养基时,培养瓶中的培养基直接倒掉;培养板中的培养基用一次性注射器抽去。
*细胞的换液:
2-3d后吸掉1/3体积的培养基(培养基要提前预热到37℃),补加入1/3体积的新鲜完全培养基,观察细胞生长状况。
┗细胞传代培养时,细胞离心后的时间尽可能的短,防止细胞重新悬浮。
可以在离心后先吸去旧的培养基,添加上新的培养基。
┗24孔培养板,每孔加细胞悬液500μL。
┗6孔培养板使用前应先用培养基润洗,以减少培养板表面张力。
┗一次性过滤器每过滤一次液体,会损失液体大约300μL。
配制时要比预先算好的溶液体积再多配300μL
┗为了减少培养基的污染机会,可先将培养基分装到中等大小的玻璃瓶中。
每次使用时,先粗略计算可能消耗的培养基的体积,用移液器一次性吸出,剩余的封口存放。
细胞传代——接板
1、将消化好的细胞悬浮在新的培养基中,1000rpm离心5min。
弃上层培养液,加入新的培养基,吹打细胞均匀;
2、细胞计数。
计四角大格(每大格含有16小格)的细胞总数,记R,则每mL的细胞数为M=R/4×104个/mL。
要求每孔内的细胞数为8000个,即N=8×103/100μL=8×104个/mL。
则稀释倍数为M/N,最后按总体积计算所需血清和双抗体积(血清含量10%,双抗含量1%);
3、将配好的细胞悬液混匀,每孔加100μL。
每加一竖排孔需吹打混匀一次,以保持细胞均匀;
举例:
14、10、13、21,
M=R/4/(1×10-4)=1.45×105个/mL,N=8×103/100μL=8×104个/mL;
稀释倍数=M/N=(1.45×105)/(8×104)=1.8;
小瓶中已有体积6mL,稀释后的体积为6×1.8=10.8mL;
10%血清:
1.08mL;1%双抗:
0.108mL;所需补充培养基:
10.8–6–1.08–0.108=3.612mL;
所以,6mL小瓶中需补充血清1.08mL、双抗0.108mL、培养基3.612mL。
综上:
原液6mL,细胞浓度1.45×105,补充血清1.08mL、双抗0.108mL,培养基3.612mL。
注:
*96孔培养板,每孔添加细胞悬液100μL,共9.6mL。
细胞冻存
1、冻存液的配制:
DMSO︰血清︰DMEM=1︰3︰6;
2、每个冻存管放1mL,根据冻存量计算所需冻存液;
3、将冻存管放于4℃,弃液→洗涤(PBS,3遍)→胰酶消化→加培养基→离心(1000rpm,5min)→弃上层培养液→缓慢加入冻存液→吹打均匀→转移冻存管(冰上操作)。
细胞复苏
细胞从-80℃冰箱中取出,立即放入37℃水浴中,不可离开。
先用6孔板中的两个孔对细胞进行培养。
37℃培养长好后再接其他孔,一孔对一细胞培养瓶,1︰2或1︰3传代。
其中DMSO有毒,不许去掉:
方法一、加入后过夜,用枪或注射器吸除,加新培养基;方法二、先离心,然后去掉DMSO,加入新培养基。
1、先进入细胞房准备,1.5mL离心管等;
2、进入冰储室,37℃水浴,取出冻存的细胞,缓慢摇(使其在最短的时间内速溶);
3、放入传递窗,并准备好6孔板、小烧杯,消毒后放入超净台;
4、打开冻存管,用枪吸弃冻存液,加入新的培养基,吹打均匀后封口;
5、放入离心机,1000rpm×5min;
6、取出,吸弃旧培养基,将其吹打均匀后放入小烧杯中,从小烧杯中用枪取出放入六孔板中,37℃培养(单层、贴壁)。
细胞的复苏
1、原则:
快速融化,必须将冻存在液氮中的细胞快速融化至37℃,使细胞外冻存时冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成伤害。
2、实验前准备
a.水浴锅调至至37℃;
b.用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台面;
c.在超净工作台中按次序摆放好除过菌的离心管、吸管、培养瓶等。
3、取出冻存
a.根据细胞冻存记录,按标签找到所需细胞的编号。
b.从液氮罐中取出细胞盒,取出所需的细胞,同时核对管外的编号。
4、迅速解冻
a.迅速将冻存管投入已预热的水浴锅中迅速解冻,并要不断摇动,使管内的液体迅速融化。
(1min内,无菌取出细胞)
b.约1~2min后冻存管内的液体完全溶解,取出,用酒精棉球擦拭冻存管的外壁,再放入超净台内。
5、平衡离心:
用架盘天平平衡后,3000r/min,离心3min。
(1000r/min离心5min)
6、制备细胞悬液
7、注意事项:
在细胞复苏操作时应注意,融化冻存细胞速度要快,且不时摇动冻存管,使之尽快通过最易受损的温度段(-5~0℃),这样复苏的冻存细胞存活率高,生长及形态良好。
然而由于冻存细胞还受其他因素的影响,有时还会有部分细胞死亡,此时,可将不贴壁。
浮在培养基上(已死亡)的细胞轻轻倒掉,再补以适量的新培养液,也会获取较为满意的结果。
注:
*轻轻晃动比吹打好。
药物处理
测定ID50,加药(测CC50、CD)
溶药→过滤→control→max、1/2max……2倍倍比稀释加药,72h后观察。
注:
*CC50是使得50%的细胞发生病变时的药物浓度。
(CC,cytotoxicconcentration)
**EC50是指能够有效抑制50%细胞感染病毒的药物浓度。
(和IC50是一样的意思)
***SI=CC50/EC50。
细胞病变率(%)=(细胞对照组OD值-实验组OD值)/细胞对照组OD值*100%
药物抑制率(%)=(实验组OD值-病毒对照组OD值)/(细胞对照组OD值-病毒对照组OD值)*100%
****IC50是指被抑制一半时抑制剂的浓度,这里的反应可以是酶催化反应,抗原抗体反应等。
在凋亡方面,可以理解为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50%,该浓度称为50%抑制浓度,即凋亡细胞与全部细胞数之比等于50%时所对应的浓度,IC50值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力,即诱导能力越强,该数值越低,当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。
*****ID50(infectivedose)感染剂量50,要求在50%的实验动物造成感染的微生物剂量,特殊情况下的有效剂量中位数。
又称感染剂量中位数。
DMSO终浓度小于1%(某些难溶性的药品用DMSO助溶)
举例:
称取一定质量的药品,假设0.25mg,先加一定体积的DMSO进行助溶,若不溶,则再添加一定的DMSO,直到溶解为止。
(在此过程中,添加DMSO时,应以一定的体积逐次添加。
例如,每次5μL)假设添加DMSO的终体积为5.5×2mL,则DMSO<1%为5.5×2÷1%=1100μL,即总体积为1100μL,所需培养基为1100-11=1089μL。
综上,0.25mg药品,添加DMSO11μL,添加培养基1089μL,总体积1100μL。
注:
*在显微镜下观察药物是否溶解,没有针尖状析出即为溶解。
┗药物处理细胞后加MTT前,有的细胞不需要用PBS冲洗有的需要。
需要冲洗的,将培养基吸出后添加一两滴PBS半分钟即可。
梯度稀释药物
举例:
对于96孔培养板,每孔添加100μL的培养基。
若做3个平行时,考虑到滤器损失应预先配置330μL的加药培养基。
将药物浓度2倍稀释成8个梯度。
方法如下:
准备8个离心管,第一管添加初始(最大)药物浓度的培养基330μL,第2至7管先添加330μL,然后在第二管中添加初始(最大)药物浓度的培养基330μL,混匀后吸出330μL打入第3管中,混匀后吸出330μL打入第4管中,以此类推。
max、1/2max、1/4max……
1g配成100mL,取1mL再稀释成100mL,即得0.1g/L的溶液。
高压灭菌注意事项
①液体灭菌时,盖软塞时在软塞下压上一根棉绳,然后用牛皮纸(可以再加一层硫酸纸)包裹住瓶塞;或在用牛皮纸包裹住瓶塞后在瓶塞上插上一根注射器针头;
②可用不锈钢餐盒对枪头或离心管等进行灭菌。
用玻璃瓶或者铁桶状容器灭菌时应用两层牛皮纸封口;
③物品高压灭菌后应进行烘干处理。
……
Western制胶所用试剂
1、1.0MTris-HCl:
Tris(MW121.14)30.29g、蒸馏水200mL,溶解后用浓盐酸调pH至所需点,最后用蒸馏水定容至250mL,高温灭菌后室温下保存。
2、10%SDS:
SDS10g,加蒸馏水定容至100mL,50℃水浴下溶解,室温保存。
若在长期保存或气温较低时出现沉淀,水浴溶化后仍可使用。
3、10%过硫酸铵(AP):
过硫酸铵0.1g、超纯水1mL,溶解后4℃保存。
保存时间为1w。
4、1.5MTris-HCl(pH8.8):
Tris(MW121.14)45.43g、超纯水200mL,溶解后用浓盐酸调pH至8.8,最后用超纯水定容至250mL,室温保存。
5、0.5MTris-HCl(pH6.8):
Tris(MW121.14)15.14g、超纯水200mL,溶解后用浓盐酸调pH至6.8,最后用超纯水定容至250mL,室温保存。
6、30%Acr/Bic:
丙烯酰胺(Acr)29g、甲叉双丙烯酰胺(Bic)1g、超纯水100mL,溶解后4℃保存。
使用时恢复至室温且无沉淀。
7、考马斯亮蓝G250溶液(不好脱色):
考马斯亮蓝G250100mg、95%乙醇50mL、磷酸100mL,加蒸馏水定容至1000mL。
配制时,先用乙醇溶解考马斯蓝染料,再加磷酸和水,混匀后用滤纸过滤,4℃保存。
其作用只是为了更清晰的观察蛋白的跑胶分离效果,若还要进行后续操作测定蛋白含量,则不染色!
8、10×丽春红溶液(号脱色):
丽春红S2g、三氯乙酸30g、磺基水杨酸30g,加蒸馏水至100mL。
9、电泳缓冲液:
Tris(MW121.14)3.03g、甘氨酸(MW75.07)18.77g、SDS1g,加蒸馏水定容至1000mL,溶解后4℃保存。
此缓冲液可重复使用3~5次。
10、转移缓冲液:
甘氨酸(MW75.07)2.9g、Tris(MW121.14)5.8g、SDS0.37g、甲醇200mL,加蒸馏水定容至1000mL,溶解后4℃保存。
此缓冲液可重复使用3~5次。
11、TBS缓冲液:
1MTris-HCl(pH7.5)10mL、NaCl8.8g,加蒸馏水定容至1000mL,室温下保存。
12、TBST缓冲液:
20%Tween-201.65mL、TBS700mL混匀后即可使用。
最好现配现用。
13、封闭液(5%):
脱脂奶粉(博士德)5g、TBST100mL。
最好现用现配。
14、一抗:
兔抗β-catenin多克隆抗体,用TBST1︰100稀释使用。
15、二抗:
山羊抗兔IgG,用TBST1︰500稀释使用。
16、DAB显色剂(博士德):
1mL蒸馏水加A液、B液、C液各一滴。
使用时配制。
注:
*若购买到的Tween-20为100%,则仅需0.33mL,依次计算(百分浓度和其用量呈正比)。
试验方法——SDS-PAGE凝胶电泳
1、配分离胶,加入TEMED后立即灌胶,灌到所需高度时加一层水(保证胶的边缘整齐)。
灌胶时要稳而快,可以沿着玻璃板往下流防止气泡产生。
2、待水和胶之间出现一条折线时说明分离胶已凝。
将水用注射器吸出,并用滤纸小心吸干。
3、配浓缩胶,加入TEMED后立即灌胶,灌满浓缩胶时将梳子插入,不能产生气泡。
灌胶前要用双蒸水对灌胶装置进行查漏,制胶时各组分母液要准确吸取到制胶管中。
10%分离胶(下层胶)
12%分离胶
15%分离胶
4%浓缩胶(积层胶、上层胶)
超纯水
4.02mL
3.3mL
2.3mL
3mL
30%Bic
3.33mL
4.0mL
5.0mL
0.67mL
1.5MTris-HCl(pH8.8)
2.5mL
2.5mL
2.5mL
0.5MTris-HCl(pH6.8)
1.26mL
10%SDS
100μL
100μL
100μL
50μL
10%AP
50μL
100μL
100μL
25μL
TEMED
5μL
5μL
5μL
5μL
注:
*AP即过硫酸铵,最好每周更换一次,配胶时要最后加入TEMED,并立即吹打混匀,迅速加入玻璃板中,TEMED要避光保存。
*分离胶制备完成后,液封(用蒸馏水即可),30-50min后,倒掉水,倒立空晾,此时再配制浓缩胶,进行灌胶。
*制胶时母液中各组分的含量随着胶的厚度而发生改变,比如1.5mm厚的胶各组分含量为0.75mm的两倍。
4、样品蛋白的准备:
每个样品总蛋白上样50μg,根据蛋白的浓度计算所需的体积。
体积不足的用1%的SDS(十二烷基硫酸钠——洗洁精主要成分)补齐。
加1×上样缓冲液,99℃变性10min。
注:
*煮完的蛋白样品要进行离心,以防止蛋白浓度改变。
5、将处理好的蛋白样品上样后进行电泳,槽中应加满电泳缓冲液,且没过加样孔,待溴酚蓝电泳到胶底部时终止电泳。
(150V恒压电泳1.5h,(80mA))电泳完毕。
将凝胶放入转膜缓冲液中平衡5min,然后进行转膜。
不同类型玻璃板胶厚度与最大上样量
胶厚度(mm)
每孔最大上样体积(μL)
0.75
25
1.0
33.3
1.5
50
1
2
3
4
5
总蛋白量
50
60
70
80
90
上样量
6.4μL
7.7μL
9μL
10.2μL
11.5μL
2%SDS
9.6μL
8.3μL
7μL
5.8μL
4.5μL
上样buffer(loadingbuffer)
4μL
4μL
4μL
4μL
4μL
注:
*银染7min效果较好。
*上样前先将样品进行编号,并检测各蛋白样品的浓度,保证其一致,同时确保上样时每个孔槽中总蛋白量一致。
*电泳即跑胶,不用再冰上进行,不同百分浓度的分离胶(8%、10%、12%、15%),分离的蛋白分子量不同,浓度越小,所能分离的蛋白分子量越大,比如8%的胶,蛋白条带上10、15、25kDa的分离效果比12%所得效果要差。
*取胶时先倒电泳缓冲液再拔掉梳子,拔梳子时为了防止凝胶与梳子上边粘连,先用针头分离,再小心拔出梳子。
*取胶时,先在分离胶和浓缩胶之间划一条线,弃去浓缩胶,整个转膜过程都要保证滤纸和NC膜湿润且NC膜下不可以有气泡。
*不同分子量的蛋白样品,电泳条件不同,比如120-140kD电泳上层胶60V30min,下层胶100V3.5h。
电泳时上、下层胶(即浓缩胶和分离胶)的电压以及时间都不一样。
试验方法——转膜
1、电泳结束前30min将转膜所需的海绵垫、硝酸纤维素滤膜(NC膜)和滤纸浸泡于冷却的转膜缓冲液中。
2、将转膜用的夹子打开,在负极(黑色板)放一张海绵垫、3张转移缓冲液浸泡过的滤纸。
然后将已切好的聚丙烯酰胺凝胶放在滤纸上,再把硝酸纤维素膜放在凝胶上,然后在膜上覆盖3层滤纸,放上海绵垫。
确保每层精确对齐,而且层与层之间无气泡。
两面的滤纸不能相互接触。
最后盖好夹子,放在转膜槽中。
注:
*将正极对准正极,负极对准负极。
*转膜三明治的制作:
负极-海绵垫(可重复使用)-三层滤纸-胶-NC膜-三层滤纸-海绵垫
取胶时,先在分离胶和浓缩胶之间划一条线,弃去浓缩胶,整个转膜过程都要保证滤纸和NC膜湿润且NC膜下不可以有气泡。
3、盖上仪器,接通电源,60V恒压转移90min。
(110mA)
4、转膜完毕后,将膜取出,放入TBST中洗3min×3次。
注:
*转膜时,胶在负极,膜在正极;夹子的黑色一面对应电泳槽黑色的一面,槽中应加满转膜缓冲液;
*转膜缓冲液一定要先预冷,最好提前一天置于4℃冰箱中;
*滤纸不可大于胶,防止短路;
*跑胶结束后要立即进行转膜,否则蛋白会在电泳缓冲液作用下发生扩散,条带也会发生变化;
跑胶结束后,将分离胶取出后泡于纯水中摇床5min,后置于转膜缓冲液中再浸泡10min;
*转膜要在冰上进行,以保证电泳槽内外温差不会太大;
不同分子量的蛋白样品,转膜条件不同。
试验方法——封闭与杂交
1、封闭:
将NC膜用丽春红染色5min,观察蛋白条带,判定转膜效率。
用TBST漂洗至丽春红的颜色褪去,之后加5%封闭液1h,并在摇床上水平缓慢摇动。
2、一抗孵育:
将兔抗β-catenin多克隆抗体用TBST1︰200稀释,按0.1mL/cm2共2mL,放入杂交袋中。
将膜从封闭液中取出,滤纸贴角稍吸干,放入杂交袋(可以用自封袋代替),正面朝下,将气泡挤出,4℃静置过夜。
(或37℃摇床1h)
3、洗涤:
一抗孵育结束后,用TBST(即封闭液)洗10min×2次,用TBS洗一次,10min。
为防止背景过高,使用的洗液
4、二抗孵育:
将二抗按1︰500的比例,用TBST稀释HRP(辣根过氧化物酶)标记的山羊抗兔IgG,37℃孵育1h。
5、洗涤:
将二抗孵育结束后,用TBST洗10min×2次,用TBS洗一次,10min。
注:
*封闭用的培养皿可以有盖也可无盖,封闭时NC膜与胶接触的那一面要始终朝上。
*注意标记Marker条带位置以及膜的上下角,记清楚每个条带所代表的蛋白质分子量大小。
标记Marker的一面为膜的正面。
*5%封闭液中液体尽量多,减少非特异性结合。
试验方法——显色
使用DAB显色法进行鉴定。
将DAB试剂盒中的A、B、C液各一滴加入到1mL蒸馏水中,将膜用滤纸贴角吸干,反贴覆于显色液上,数分钟后出现条带,蒸馏水漂洗后用滤纸贴角,进行扫描分析。
使用ECL法显色进行鉴定。
1mLA液+1mLB液加入同一个EP管中
从TBST溶液中取出NC膜(注意:
不可让膜过于干燥)
将NC膜蛋白面向下置于保鲜膜上(可在泡沫上用大头针对保鲜膜进行固定)
将ECL液彻底覆盖于NC膜上
避光反应3min,盖好保鲜膜,用纸巾将残余ECL液从保鲜膜内轻轻挤出并吸干,将蛋白面向上放入暗盒
关闭电源,可用红灯,取出底片,放在膜上进行曝光
显影5min,去离子水漂洗,定影3-5min,直至可见清晰条带,去离子水漂洗终止反应
考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液
试剂组成:
溶液A(50×)10mL
溶液B500mL
使用方法:
配制100mLB+2mLA,配后一周内用完,时间过长对效果有一定的影响。
1、将电泳后的PAGE胶(以8cm×10cm为例)取下放入容器中,加入50mL双蒸水或超纯水,加热至沸腾后停止(可继续在脱色摇床上摇动5min),弃去水溶液。
2、加入25mL快速染色工作液,加热至沸腾后保持沸腾状态30~60s,停止加热后继续在脱色摇床上摇动5~10min,弃去染色液(此时蛋白条带应已可见)。
3、加入约50mL水,加热至沸腾后保持沸腾状态30~60s,停止加热后继续在脱色摇床上摇动5~10min,换水即可完成脱色,观察结果。
注:
*第一步中要保证水的质量(分子克隆第二版);
**脱色时可用自来水清洗;
***重复脱色步骤或将胶在水中过夜,可得无背景的染色胶;
****每次加热后继续在脱色摇床上
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- 细胞 试验
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