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现代分子生物学复习资料
第二章染色体与DNA
一、染色体的结构和组成
原核生物:
DNA形成一系列的环状附着在非组蛋白上形成类核。
真核生物染色体有蛋白质和DNA组成,蛋白质包括组蛋白(H1,H2A、H2B、H3、H4)和非组蛋白。
二、基因和基因组
基因与基因组的概念
1、原核生物基因组结构特点
●基因组很小,大多只有一条染色体
●结构简炼
●存在转录单元(trnascriptionaloperon)
●多顺反子(polycistron)
重叠基因由基因内基因、部分重叠基因、一个碱基重叠组成。
2、真核生物基因组结构特点
●真核基因组结构庞大3×109bp、染色质、核膜
●单顺反子
●基因不连续性断裂基因(interruptedgene)、内含子(intron)、外显子(exon)
●非编码区较多多于编码序列(9:
1)
●含有大量重复序列
■不重复序列/单一序列:
在基因组中有一个或几个拷贝。
真核生物的大多数基因在单倍体中都是单拷贝的。
如:
蛋清蛋白、血红蛋白等功能:
主要是编码蛋白质。
■中度重复序列:
在基因组中的拷贝数为101~104。
如:
rRNA、tRNA
一般是不编码蛋白质的序列,在调控基因表达中起重要作用
■高度重复序列:
拷贝数达到几百个到几百万个。
●卫星DNA:
A·T含量很高的简单高度重复序列。
三、DNA的结构与功能
1)DNA的变性和复性
■变性(Denaturation)DNA双链的氢键断裂,最后完全变成单链的过程称为变性。
■增色效应(Hyperchromaticeffect)在变性过程中,260nm紫外线吸收值先缓慢上升,当达到某一温度时骤然上升,称为增色效应。
■融解温度(Meltingtemperature,Tm)变性过程紫外线吸收值增加的中点称为融解温度。
生理条件下为85-95℃
影响因素:
G+C含量,pH值,离子强度,尿素,甲酰胺等
■复性(Renaturation)热变性的DNA缓慢冷却,单链恢复成双链。
■减色效应(Hypochromaticeffect)随着DNA的复性,260nm紫外线吸收值降低的现象。
2)C值反常现象(C-valueparadox)C值是一种生物的单倍体基因组DNA的总量。
C值往往与种系的进化的复杂程度不一致,某些低等生物却有较大的C值,这就是著名的“C值反常现象”。
3)核小体(nucleosome):
用于包装染色质的结构单位,是由DNA链缠绕一个组蛋白核[(H2A、H2B、H3、H4)*2的八聚体】构成的。
DNA的一级结构:
指4种脱氧核苷酸的连接及其排列顺序,DNA序列是这一概念的简称。
DNA的二级结构:
指两条多核苷酸链反向平行盘绕所产生的双螺旋结构。
是有Watson和Crick在1953年共同发现的。
分类:
右手螺旋(是其通常存在形式):
A-DNA,B-DNA。
左手螺旋:
Z-DNA。
双螺旋的基本特点:
双链反向平行配对而成;脱氧核糖和磷酸交替连接,构成DNA骨架,碱基排在内侧;内侧碱基通过氢键互补形成碱基对(A:
T,C:
G)。
超螺旋:
DNA双螺旋结构中,一般每转一圈有十个核苷酸对,双螺旋总处于能量最低状态。
正常DNA双螺旋额外的多转或少转几圈,就会出现双螺旋空间结构改变,在DNA分子中形成额外张力,若此时DNA分子的末端是固定的或是环状分子,双联不能自由转动,额外的张力就不能释放而导致DNA分子内部院子空间位置的重排,造成扭曲,即出现超螺旋结构。
从DNA到染色体过程的压缩过程:
核小体的形成是染色体中DNA压缩的第一个阶段,在核小体中DNA盘绕组蛋白八聚体核心,从而使分子收缩至原尺寸的1/7。
染色质细丝盘绕成螺旋管状的粗丝,每个螺旋管包含6个核小体,其压缩比为6。
螺旋管进一步压缩形成超螺旋,压缩比是40.
超螺旋圆筒进一步压缩5倍便成为染色体单体。
DNA的半保留复制:
由亲代DNA生成子代DNA时,每个新形成的子代DNA中,一条链来自亲代DNA,而另一条链则是新合成的,这种复制方式称半保留复制。
半不连续复制:
DNA复制过程中,前导链的合成以5’-3’方向,随着亲本双链体的解开而连续进行复制;后随链在合成过程中,一段亲本DNA单链首先暴露出来,然后以与复制叉移动相反的方向,按照5-3’方向合成一系列的冈崎片段,然后再把它们连接成完整的后随链。
这种前导链的连续复制和后随链的不连续复制在生物界是有普遍性的,因而称为双螺旋的半不连续复制。
从复制原点到终点,组成一个复制单位,叫复制子。
复制时,解链酶等先将DNA的一段双链解开,形成复制点,这个复制点的形状象一个叉子,故称为复制叉。
1线性DNA双链的复制方式:
⑴、将线性复制子转变为环状或多聚分子。
⑵、在DNA末端相处发夹式结构。
⑶、在某种蛋白质的介入下,在真正的末端上启动复制。
环状双链DNA的复制分为θ型、滚环型和D-环型几种类型。
后随链的复制由引发体来引发,引发体像火车头一样在后随链分叉的方向上前进,并在模板上断断续续的引发生成后随链的引物RNA短链,再由DNA聚合酶
作用合成DNA,直至遇到下一个引物或冈崎片段为止。
由RNaseH降解RNA引物并由DNA聚合酶
将缺口补齐,再由DNA连接酶将两个冈崎片段连在一起形成大分子DNA。
冈崎片段:
DNA复制过程中,两条新生链都只能从5'端向3'端延伸,前导链连续合成,滞后链分段合成。
这些分段合成的新生DNA片段称冈崎片段。
DNA的修复包括错配修复(恢复错配)、碱基切除修复(切除突变的碱基)、核甘酸切除修复(修复被破坏的DNA)、DNA直接修复(修复嘧啶二体或甲基化DNA)、SOS系统(DNA的修复,导致变异)
DNA的转座或叫移位(transposition):
由可移位因子(transposableelement)介导的遗传物质重排现象。
转座子(transposonTn):
存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。
原核生物转座子的类型:
1、插入序列(2、复合转座子3、TnA家族
与DNA复制有关的物质
1)原料:
四种脱氧核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)
2)模板:
以DNA的两条链为模板链,合成子代DNA
3)引物:
DNA的合成需要一段RNA链作为引物
4)引物合成酶(引发酶):
此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物(Primer)。
实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。
5)DNA连接酶(1967年发现):
若双链DNA中一条链有切口,一端是3’-OH,另一端是5’-磷酸基,连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键,而使切口连接。
但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来
DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用
6)DNA拓扑异构酶(DNATopisomerase):
拓扑异构酶І:
使DNA一条链发生断裂和再连接,作用是松解负超螺旋。
主要集中在活性转录区,同转录有关。
例:
大肠杆菌中的ε蛋白
拓扑异构酶Ⅱ:
该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA,作用是将负超螺旋引入DNA分子。
同复制有关。
例:
大肠杆菌中的DNA旋转酶
7)DNA解螺旋酶/解链酶(DNAhelicase):
通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。
E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶,还有解螺旋酶I、II、III。
rep蛋白沿3’®5’移动,而解螺旋酶I、II、III沿5’®3’移动。
8)单链结合蛋白(SSBP-single-strandbindingprotein):
稳定已被解开的DNA单链,阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。
9)DNA聚合酶
聚合酶Ⅰ主要是对DNA损伤的修复;以及在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙;
聚合酶Ⅱ修复紫外光引起的DNA损伤;
聚合酶ⅢDNA复制的主要聚合酶,还具有3→5’外切酶的校对功能,提高DNA复制的保真性。
性质
聚合酶Ⅰ
聚合酶Ⅱ
聚合酶Ⅲ
3'→5'外切活性
+
+
+
5'→3'外切活性
+
-
-
5'→3'聚合活性
+中
+很低
+很高
新生链合成
-
-
+
(三)DNA的复制过程(大肠杆菌为例)
●双链的解开
●RNA引物的合成
●DNA链的延伸
●切除RNA引物,填补缺口,连接相邻的DNA片段
1、双链的解开------ftju制有特定的起始位点,叫做复制原点。
ori(或o)、富含A、T的区段。
从复制原点到终点,组成一个复制单位,叫复制子
复制时,解链酶等先将DNA的一段双链解开,形成复制点,这个复制点的形状象一个叉子,故称为复制叉
双链解开、复制起始
大约20个DnaA蛋白在ATP的作用下与oriC处的4个9bp保守序列相结合
在HU蛋白和ATP的共同作用下,Dna复制起始复合物使3个13bp直接重复序列变性,形成开链
解链酶六体分别与单链DNA相结合(需DnaC帮助),进一步解开DNA双链
2、RNA引物的合成
DnaB蛋白活化引物合成酶,引发RNA引物的合成。
引物长度约为几个至10个核苷酸,
3、DNA链的延伸
DNA的半不连续复制(semi-discontinuousreplication):
DNA复制时其中一条子链的合成是连续的,而另一条子链的合成是不连续的,故称半不连续复制。
在DNA复制时,合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链;合成方向与复制叉移动的方向相反,形成许多不连续的片段,最后再连成一条完整的DNA链为滞后链。
在DNA复制过程中,前导链能连续合成,而滞后链只能是断续的合成5®¢3¢的多个短片段,这些不连续的小片段称为冈崎片段。
4、切除RNA引物,填补缺口,连接相邻的DNA片段(复制终止)
当复制叉遇到约22个碱基的重复性终止子序列(Ter)时,Ter-Tus蛋白复合物能使DnaB不再将DNA解链,阻挡复制叉继续前移。
P47
在DNA聚合酶Ⅰ催化下切除RNA引物;留下的空隙由DNA聚合酶Ⅰ催化合成一段DNA填补上;在DNA连接酶作用下,连接相邻的DNA链
(四)复制的几种主要方式P42
1、双链环状、θ型复制、双向等速
2、滚环型:
(1)模板链和新合成的链分开;
(2)不需RNA引物,在正链3‘-OH上延伸
(3)只有一个复制叉;
3、D环复制---单向复制的特殊方式如:
动物线粒体DNA
(五)真核生物中DNA的复制特点
1、真核生物每条染色体上有多个复制起点,多复制子(约150bp左右);
2、复制叉移动的速度较慢(约50bp/秒),仅为原核生物的1/10。
3、真核生物染色体在全部复制完之前,各个起始点不再重新开始DNA复制;真核生物快速生长时,往往采用更多的复制起点。
4、真核生物有多种DNA聚合酶。
5、真核生物DNA复制过程中的引物及冈崎片段的长度均小于原核生物。
(真核冈崎片段长约100-200bp,原核冈崎片段长约1000-2000bp。
)
(六)原核和真核生物DNA的复制特点比较
①复制起点(ori):
原核一个,真核多个;
②复制子:
原核一个,真核多个;
③复制子长度:
原核长;真核短;
④复制叉:
原核多个;真核多个;
⑤复制移动速度:
原核较快;真核较慢;
⑥真核生物染色体在全部完成复制前,各起始点的DNA复制不能再开始。
而在快速生长的原核生物中,复制起点上可以连续开始新的DNA复制。
⑦原核生物染色体的复制与细胞分裂同步,可以多次复制;真核生物染色体的复制发生在S期,是细胞分类的特定时期,而且仅此一次。
双螺旋模型(doublehelixmodel)的特点:
(1)DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链组成,形成右手双螺旋。
(3)两条链反向平行,即两条链的方向相反;
(4)糖一磷酸键是在双螺旋的外侧,碱基对与轴线垂直。
(5)糖与附着在糖上的碱基近于垂直。
(6)碱基配对时,必须一个是嘌呤,另一个是嘧啶。
(7)DNA双螺旋有大沟(majororwidegroove)和小沟(minorornarrowgroove)的存在。
影响双螺旋结构稳定性的因素:
1.氢键(Hydrogenbond)弱键,可加热解链稳定性与GC含量成正比
2.磷酸酯键(phosphoesterbond)强键,需酶促解链
3.碱基堆积力(非特异性结合力)磷酸骨架,氨基,酮基周围水分子间的有序排列;疏水作用力;范德华力
4.碱基内能分子自身热运动(加热);使氢键因碱基排列有序状态的破坏而减弱
5.磷酸基团间的静电斥力
第三章生物信息传递(上)-从DNA到RNA
一、转录的概述
中心法则:
转录:
是指拷贝出一条与DNA链序列完全相同(除了T→U之外)的RNA单链的过程,是基因表达的核心步骤。
包括:
模板识别,转录起始,转录延伸,转录终止。
转录单元(transcriptionunit):
一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列。
参与转录的物质
原料:
NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)
模板:
DNA
酶:
RNA聚合酶
其他蛋白质因子
RNA合成方向:
5'→3'
转录的不对称性:
在RNA的合成中,DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板,称为转录的不对称性。
有意义链和反义链:
与mRNA序列相同的那条DNA链称为编码链codingstrand或称有意义链sensestrand,;将另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链称为模板链templatestrand或称反义链antisensestrand。
DNA分子上转录出RNA的区段,称为结构基因。
二、参与转录起始的关键酶与元件
(一)RNA聚合酶
●原核生物RNA聚合酶(大肠杆菌为例)---全酶=核心酶+σ因子真核细胞的三种RNA聚合酶特征比较
亚基
基因
相对分子量
亚基数
组分
功能
α
rpoA
36500
2
核心酶
核心酶组装,
启动子识别
β
rpoB
151000
1
核心酶
β和β'共同形成
RNA合成的活性中心
β'
rpoC
155000
1
核心酶
ω
?
11000(需查)
1
核心酶
?
σ
rpoD
70000
1
σ因子
存在多种σ因子,
用于识别不同的启动子
酶
位置
转录产物
相对活性
对α-鹅膏蕈碱的敏感性
RNA聚合酶Ⅰ
核仁
rRNA
50-70%
不敏感
RNA聚合酶Ⅱ
核质
hnRNA、mRNA
20-40%
敏感
RNA聚合酶Ⅲ
核质
tRNA
约10%
存在物种特异性
RNA聚合酶与DNA聚合酶的区别
RNA聚合酶
DNA聚合酶
大小(M)
大,4.8×105dol
小,1.09×105dol
引物
无
有
产物
较短,游离
较长,与模板以氢键相连
作用方式
一条链的某一段
两条链同时进行
外切酶活性
无
5’→3’,3’→5’
校对合成能力
无
有
修复能力
无
有
(二)启动子(promoter)
启动子:
指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。
TATA区:
酶的紧密结合位点(富含AT碱基,利于双链打开)
TTGACA区:
提供了RNA聚合酶全酶识别的信号
转录起点---与新生RNA链第一个核甘酸相对应DNA链上的碱基。
真核生物启动子的结构
核心启动子(corepromoter)
●定义:
指保证RNA聚合酶Ⅱ转录正常起始所必需的、最少的DNA序列,包括转录起始位点及转录起始位点上游TATA区
●作用:
选择正确的转录起始位点,保证精确起始
2、上游启动子元件
●包括CAAT盒(CCAAT)和GC盒(GGGCGG)等
●作用:
控制转录起始频率。
(三)转录起始复合物---二元闭合复合物、二元开链复合物、三元复合物。
(原核)
三、转录的基本过程
1、起始位点的识别:
RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。
RNA聚合酶全酶
(2)与模板结合
2、转录起始
①RNA聚合酶全酶
(2)与模板结合
•DNA双链解开
•在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应,形成转录起始复合物
5-pppG-OH+NTP5-pppGpN-OH3+ppi
转录起始复合物:
RNApol
(2)-DNA-pppGpN-OH3
3、RNA链的延伸
●亚基脱落,RNA–pol聚合酶核心酶变构,与模板结合松弛,沿着DNA模板前移;
●在核心酶作用下,NTP不断聚合,RNA链不断延长。
注意:
9个核苷酸以前还在启动子区,容易脱落,一旦形成9个以上的核苷酸并离开启动子区,转录正式进入眼神阶段。
4、转录终止
终止子(terminator):
位于基因的末端,在转录终止点之前有一段回文序列(反向重复序列)约6-20bp。
真核生物终止:
由一段特定序列5′-AATAAA-3′和回文序列(反向重复序列)组成。
RNA聚合酶全酶与启动子区闭合双链DNA结合形成二元闭合复合物(全酶、模板DNA)
再解链为二元开链复合物,转录起始,形成三元复合物(全酶、模板DNA、新生RNA),因子释放,RNA合成开始
启动子:
指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。
原核生物启动子结构
-10signal(TATAbox,Pribnowbox)酶的紧密结合位点(富含AT碱基,利于双链打开)
-35signal(TTGACA)提供了RNA聚合酶全酶识别的信号
transcriptionstartsite
–10区和-35区的最佳距离
-10区与-35区的最佳间距大约是16~19bp.
Pribnow区下降突变(TATAAT→AATAAT)
Pribnow区上升突变(TATGTT→TATATT)
真核生物启动子结构
1、核心启动子(corepromoter)指保证RNA聚合酶Ⅱ转录正常起始所必需的、最少的DNA序列,包括转录起始位点及转录起始位点上游TATA区
-25bp~-30bpTATAboxDNA解链开始转录位置
2、上游启动子元件(upstreampromoterelement,UPE)
(1)CAATbox-75左右,RNA聚合酶结合有关
(2)更上游GCbox转录因子结合其上
3、增强子
顺式作用元件(cis-actingelement):
影响自身基因表达活性的非编码DNA序列。
能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质,现已发现数百种,统称为反式作用因子(trans-actingfactors)。
反式作用因子中,直接或间接结合RNA聚合酶的,则称为转录因子(transcriptionalfactors,TF)。
分为两类:
●强终止子-内部终止子:
不依赖Rho(ρ)因子的终止。
●弱终止子-需要ρ因子(rhofactor),又称为ρ依赖性终止子(Rho-dependentterminator)
不依赖ρ因子的终止
当RNA链延伸到转录终止位点时,RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键,RNA-DNA杂合物分离,转录泡瓦解,DNA恢复成双链状态,而RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来,这就是转录的终止。
终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区,RNA形成发夹结构;
在终止位点前面有一段由4-8个A组成的序列,RNA的3’端为寡聚U
发夹式结构和寡聚U的共同作用使RNA从三元复合物中解离出来。
依赖ρ因子的终止
ρ因子:
六聚体蛋白、水解各种核甘三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来,从而终止转录。
四、真核生物的转录过程
1.转录起始
真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化,转录起始时,RNA-pol不直接结合模板,其起始过程比原核生物复杂。
(1)转录起始前的上游区段
•顺式作用元件(cis-actingelement):
影响自身基因表达活性的非编码DNA序列。
例:
启动子、增强子、弱化子等
•增强子:
在启动区存在的能增强或促进转录的起始的DNA序列。
但不是启动子的一部分。
特点:
1.远距离效应;2.无方向性;3.顺式调节;4.无物种和基因的特异性;5.具有组织特异性;6.有相位性;7.有的增强子可以对外部信号产生反应。
(2)转录因子:
能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质,现已发现数百种,统称为反式作用因子(trans-actingfactors)。
反式作用因子中,直接或间接结合RNA聚合酶的,则称为转录因子(transcriptionalfactors,TF)。
参与RNA-polⅡ转录的TFⅡ--TFⅡD、TFⅡA、TFⅡB、TFⅡF、TFⅡE、TFⅡH
(3)转录起始前复合物(pre-initiationcomplex,PIC)
真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合,而需依靠众多的转录因子。
(4)模板理论(piecingtheory)
一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。
转录因子之间互相结合,生成有活性、有专一性的复合物,再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。
2.转录延伸
真核生物转录延长过程与原核生物大致相似,但因有核膜相隔,没有转录与翻译同步的现象。
RNA-pol前移处处都遇上核小体。
转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。
3.转录终止——和转录后修饰密切相关。
五、转录后加工
5’端加帽、3’端加尾、RNA的剪接、RNA的编辑
(1)在5’端加帽
5’端的一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸(m7Gppp)。
mRNA5’端的这种结构称为帽子(cap)。
帽子结构功能:
①能被核糖体小亚基识别,促使mRNA和核糖体的结合;
②m7Gppp结构能有效地封闭mRNA5’末端,以保护mRNA免受5’核酸外切酶的降解,增强mRNA的稳定。
(2)3’端加尾--多聚腺苷酸尾巴---AAUAAA:
★准确切割。
★加poly(A)
多聚腺苷酸尾巴功能:
提高了mRNA在细胞质中的稳定性。
(3)RNA的剪接
生物体内内含子的主要类型:
U-AG、AU-AC、Ⅰ类内含子、Ⅱ类内含子Ⅲ类内含子
参与RNA剪接的物质:
snRNA(核内小分子RNA)、snRNP(与snRNA结合的核蛋白)、核内RNA(U1、U2、U4、U5、U6)
(4)RNA的编辑
编辑(editing)是指转录后的RNA在编码区发生碱基的突变、加入或丢失等现象。
内含子(intron):
真核细胞基因DNA中的不编码序列,这部分序列并不编码蛋白质,又称间隔序列。
外显子(exonorextron):
真核细胞基因DNA中的编码序列,这部分序列可转录为RNA,并翻译成蛋白质,也称表达序列。
六、原核与真核生物mRNA的特征比较
(1)原核生物mRNA的特征:
原核mRNA的半衰期短,细菌内mRNA的转录、翻译与降解几乎是同时进行
许多原核mRNA以多顺反子的形式存在
原核mRNA的5’端无帽子结构或只有短的Poly(A)尾巴
在起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处,有一段可与核糖体16SrRNA配对结合的、富含嘌呤的
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