《生物制药工艺学》学习笔记.docx

《生物制药工艺学》学习笔记.docx

《《生物制药工艺学》学习笔记.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《生物制药工艺学》学习笔记.docx（38页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

《生物制药工艺学》学习笔记

第一章生物药物概论

1、生物药物分类：

（1）基因重组多肽、蛋白类治疗剂

（2）基因药物（3）天然生物药物（4）合成和部分合成药物。

DNA重组药物和基因药物区别：

DNA重组药物即应用重组DNA技术（包括基因工程技术和蛋白质工程技术）制造重组多肽、蛋白质类药物和疫苗、单克隆抗体和细胞因子等；

基因药物即以基因物质（DNA或RNA）为基础，研究而成基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和核酶等。

2、生物药物作用特点：

药理学特性：

（1）药理活性高

（2）治疗针对性强，治疗生理、生化机制合理，疗效可靠。

（3）毒副作用较少，营养价值高。

（4）生理副作用常用发生。

理化特性：

（1）生物材料中有效物质含量低，杂质种类多且含量相对较高。

（2）生物活性物质组成结构复杂、稳定性差。

（3）生物材料易染菌，腐败。

（4）生物药物制剂特殊要求。

3．DNA重组药物有：

（1）细胞因子干扰素类：

α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素

（2）细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子：

白介素-2（IL-2）和突变型白介素-2（Ser125-IL-2）肿瘤坏死因子类主要有TNF-α和TNF-α受体。

（3）造血系统生长因子类：

粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、巨噬细胞粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）、促红细胞生成素（EPO）、促血小板生成素（TPO）干细胞生长因子（SCF）（4）生长因子类：

胰岛素样生长因子（IGF）、表皮生长因子（EGF）、血小板衍生生长因子（PDFD）、转化生长因子（TGF-α和TGF-β）、神经生长因子及各种神经营养因子。

（5）重组多肽和蛋白质类激素：

重组人胰岛素（rhInsulin）、重组人生长激素（rhGH）、促卵胞激素（FSH）、促黄体生成素（LH）和绒毛膜促性腺激素（HCG）、重组人白蛋白和重组人血红蛋白（6）心血管病治疗剂和酶制剂：

Ⅷ因子、水蛭素、tpA、rtpA、尿激酶、链激酶、葡激酶、天冬酰胺酶、超氧化歧化酶、葡萄糖脑苷酶及DNsae等（7）重组疫苗和单抗制品：

重组乙肝表面抗原疫苗、乙肝基因疫苗、AIDS疫苗、流感疫苗、痢疾疫苗和肿瘤疫苗。

4术语

药物：

用于预防、诊断、治疗保健一类物质。

药品：

是指用于预防、治疗、诊断人体疾病，有目地调节人体生理功能并规定有适应证或者功能主治、用法和用量物质，包括中药材、中药饮片、中成药、化学原料药及其制剂、抗生素、生化药品、放射性药品、血清、疫苗、血液制品和诊断药品等。

药品根据其来源可分两大类：

天然药物即植物药、动物药和矿物药；合成药包括化学合成药和微生物合成药。

天然药物一般来源于自然界，很少有人工加工过程，药物成分相对较复杂。

生化药物：

（biopharmaceutics）是利用生物体、生物组织、细胞或其成分，综合应用生物学和医学、生物化学和分子生物学、微生物学和免疫学、物理化学和工程学和药学原理和方法加工制造而成一大类用于预防、诊断、治疗和康复保健制品。

DNA重组药物：

即应用重组DNA技术（包括基因工程技术和蛋白质工程技术）制造重组多肽、蛋白质类药物和疫苗、单克隆抗体和细胞因子等。

基因药物：

以基因物质（RNA和DNA及其衍生物）作为治疗物质基础，包括基因治疗用重组目DNA片段、重组疫苗、反义药物和核酸等。

生化药物：

是运用生物化学理论、方法、技术和研究成果，从生物体（包括动物、植物、微生物和海洋生物）分离、纯化得到一些重要生理活性物质，经药效学和毒理学研究证明对于疾病防治是安全有效一大类药物，如氨基酸、多肽、蛋白质、酶、辅酶、维生素、激素、糖类、脂类、核酸、核苷酸及其衍生物。

反义药物：

是以人工合成10~几十个反义寡核苷酸序列和模板DNA或mRNA互补形成稳定双链结构，抑制靶基因转录和mRNA翻译，从而起到抗肿瘤和抗病毒作用，目前有20多种反义药物进入临床试验，其中ISIS是FDA批准第一个反义药物，用于治疗AIDS病患者巨噬细胞病毒性视网膜炎。

核酸疫苗：

将编码某种抗原蛋白外源基因（DNA或RNA）直接导入动物细胞内，并通过宿主细胞转录系统合成抗原蛋白质，诱导宿主产生对该抗原蛋白质免疫应答以达到防病治病目。

第二章生物制药工艺学技术基础

1、生物活性物质浓缩和干燥方法：

生物活性物质浓缩：

（1）盐析浓缩

（2）有机溶剂沉淀浓缩（3）用葡聚糖凝胶（Sephadex）浓缩（4）用聚乙二醇（PEG）浓缩（5）超滤浓缩（6）真空减压浓缩和薄膜浓缩

生物活性物质干燥：

（1）减压干燥

（2）喷雾干燥（3）冷冻干燥

2简述生物活性物质分离纯化主要原理：

根据混合物中不同组分分配率差别，把它们分配于可用机械方法分离两个或几个物相中，或者将混合物置于某一相中，外加一定作用力，使多组分分配于不同区域，从而达到分离目。

主要纯化原理有：

（1）根据分子形状和大小不同进行分离

（2）根据分子电离性质（带电性）差异进行分离（3）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离。

（4）根据物质吸附性质不同进行分离（5）根据配体特意性进行分离

3、保存菌种、菌种退化、检查菌种退化

常用菌种保存方法：

斜面低温保藏法、液体石蜡封藏法、冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法、甘油冷冻保藏法、其他如沙土管保藏法。

菌种退化意味着随时间推移菌种一个或多个特性逐步减退或消失，最终导致营养细胞死亡。

一般把菌株生活力、产孢子能力衰退和特殊产物产量下降统称为退化。

检查菌种退化：

（1）单位容积中发酵液活性物质含量

（2）琼脂平皿上单菌落形态，（3）不同培养时期菌体细胞形态和主要遗传特征，如形成孢子能力；（4）发酵过程pH变动情况（5）发酵液气味、色泽

4重组DNA技术基本原理，如何获取目基因

基因工程是通过体外重组将甲生物体基因转入乙受体生物体内进行表达生物技术。

获取目基因方法有：

（1）鸟枪克隆法

（2）人工合成目基因1、酶促方法2、化学合成法

5常见基因载体有，如何构建基因重组体

在体外将含目基因DNA片段和具有自我复制功能、并带有选择标记载体分子进行酶切连接，获重组DNA分子。

常见基因载体有：

链霉菌质粒、芽孢杆菌载体、质粒、噬菌体（phage）、黏粒（cosmid）、病毒载体等。

6DNA重组体有主要有哪几种表达系统？

各有什么特点？

基因工程包括转录、翻译及翻译后加工等过程。

根据宿主细胞种类不同，分为原核基因工程和真核基因工程。

原核基因工程以原核细胞作为表达宿主，如大肠杆菌、枯草杆菌等；而真核基因工程则以真核细胞为表达宿主，如酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞等。

（1）大肠杆菌表达系统：

遗传背景比较清楚，使用安全、技术操作简便，繁殖力强（20~30min即可繁殖一代），便于大规模培养，成本较低，表达水平较高（可达总蛋白5%~6%），下游技术成熟、易于控制。

目前使用最广泛、最成功表达系统。

（2）酵母表达系统：

是真核表达体系，对表达蛋白可进行折叠和翻译后修饰和糖基化；

表达量高，如明胶表达量达14。

8g/L;

培养成本低；

适用高密度发酵；

杂蛋白少，产物易纯化。

（3）哺乳动物表达系统：

中国仓鼠卵巢细胞（CHO）和猴肾细胞（COS）优点是能识别和剪切外源基因内含子并加工成为成熟mRNA.但其培养技术难度大，成本高，研究和生产周期长。

三体系表达特点比较

表达体系

产物

产生部位

培养方式

提纯

产物活性

潜在危险

大肠杆菌

多肽、蛋白质或融合蛋白质

菌体内

容易

部分可获得高产

一般

对原核者好

真核者稍差

不大

酵母

多肽、蛋白质或糖基化蛋白

菌体内或分泌出细胞

容易

可高产

菌体内，稍复杂

真核接近天然

不大

哺乳动物细胞

完整糖基化蛋白质

分泌出细胞

较难成本高

可高产

简单

几乎可为天然产物

需注意有致癌因素

7生物制药工艺中试放大目，如何进行中试放大。

中试放大是由小试转入工业化生产过渡性研究工作，对小试工艺能否成功地进入规模化生产至关重要。

这些研究工作都是围绕着如何提高收率，改进操作，提高质量，形成批量生产等方面进行。

中试放大方法有经验放大法，相似放大法和数学模型放大法。

主要采用经验放大法。

8术语

微生物纯培养：

系指只在单一种类存在状态下所进行生物培养。

所有微生物、植物和动物都可以进行这种培养，高等植物或动物无菌培养（无菌饲养）也可说是一种纯培养。

纯培养最重要是在于微生物生理研究，方法是依靠灭菌和分离，是由巴斯德（L．Pasteur）和柯赫（R．Koch）建立起来。

在自然界中，有培养条件很困难，特别是具有密切共生关系生物及进行寄生性营养生物；也有一些在理论上不可能进行纯粹培养生物。

诱变育种：

是指有意识地将生物体暴露于物理、化学或生物一种或多种诱变因子，促使生物体发生突变，进而从突变体中筛选具有优良性状突变株过程。

诱变育种主要包括出发菌株选择、诱变处理和筛选突变株3个部分。

蛋白质工程：

在基因水平上设计表达新功能蛋白。

转基因动物：

将外源基因导入哺乳动物受精卵或胚胎中，使导入基因和受精卵染色体整合，并将外源基因稳定地子代，使子代表现外源基因性状。

蛋白质组学：

研究细胞、组织或个体全部蛋白质全部表达状态和功能状态，是后基因时代重要研究方向

第三章、生物材料预处理

1、去处发酵液中杂蛋白方法：

（1）加入凝聚剂

（2）加入絮凝剂（3）变性沉淀（4）吸附（5）等电点沉淀（6）加各种沉淀剂

2、去处发酵液中钙、镁、铁离子方法：

（1）离子交换法去铁离子

（2）沉淀法钙和草酸钠或草酸镁去处用草酸沉淀不完全，碱性条件下用磷酸盐，或三聚磷酸钠，生成络合物（污染河水）

3、影响絮凝效果主要因素：

絮凝剂分子量、絮凝剂用量、pH及操作条件

絮凝剂分子量越大，链越长，吸附桥架效果就越明显，但分子链越大，絮凝剂在水中溶解度降低；

絮凝剂浓度越低，增加用量有助于架桥，提高絮凝效果，但过多引起吸附饱和，在胶粒表面形成覆盖层，使胶粒稳定，降低絮凝效果；

pH变化影响离子型絮凝剂功能团电离度，电离度提高使电排斥作用增强，架桥能力最佳；

搅拌应注意，刚开始搅拌迅速使絮凝剂分散，发挥絮凝作用，絮凝团形成后，高剪切力会打碎絮凝团。

4细胞破碎：

方法

原理

特点

机械法

匀浆法

基于液相剪切力

适用面广，处理量大，速度快，工业广泛使用，不适用某些高度分支微生物，产热大，可能会生物活性物质失活

珠磨法

研磨作用破碎

适用面广，处理量大，工业广泛使用，产热大，可能会生物活性物质失活

超声波

超声波空穴作用破碎

产热大，散热不易，成本高，适用小量样品破碎

物理法

干燥法

菌体细胞膜渗透性变化，自溶

较剧烈，易引起蛋白质或其他组分变性

冻融法

胞内冰晶引起细胞膨胀破碎

较温和，但破碎作用较弱，常需反复冻融，实验室使用

渗透压冲击法

渗透压突然变化，细胞快速膨胀变化

较温和，但破碎作用较弱，常和酶法合用

化学法

化学试剂处理

化学试剂溶解细胞或抽提某些细胞成分

需选择合适试剂，减少对活性物质破坏，可应用于大规模生产

制成丙酮粉

丙酮迅速脱水，破坏蛋白质和脂质结合键

迅速脱水，减少蛋白质变性，促进某些结合酶释放

生物法

酶解法

用酶反应分解破坏细胞壁上特有化学键

反应条件温和，但成本较高，一般仅适用于小规模应用

组织自溶法

利用组织中酶改变、破坏细胞结构、使组织自溶

反应条件温和、成本低，不适用于易受酶降解目物提取

5、超声波破碎细胞原理：

超声波破碎作用和液体中空穴形成有关。

当超声波在液体中传播时，液体中某一小区域交替重复地产生巨大压力和拉力。

由于拉力作用，出现细小空穴。

这种空穴泡在超声波继续作用下，又迅速闭合，产生一个极为强烈冲击波压力，由它引起黏滞性旋涡在悬浮细胞上造成了剪切应力，促使其内部液体发生流动，而使细胞破碎。

术语：

1、凝聚作用：

（coagulation）是指在某些电解质作用下，使胶体粒子扩散双电层排斥作用降低，破坏了胶体系统分散状态，而使胶体粒子聚集过程。

2、絮凝作用：

（flocculation）是指在胶体悬浮液中加入絮凝剂后，胶粒可强烈吸附在絮凝剂表面功能团上，而且一个高分子聚合物许多链节分别吸附在不同颗粒表面上，产生架桥联接，形成粗大絮凝团沉淀过程。

3、渗透压冲击法：

把细胞放在高渗溶液中，由于渗透压作用，细胞外水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压发生突然变化，胞外水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂，使产物释放到溶液中。

4、错流过滤：

滤液给过滤介质表面一个平行大流量冲刷，则过滤截止表面积累滤饼就会减少到可以忽略程度，而通过过滤介质流速却比较小。

第四章萃取法

1、溶液萃取法基本原理：

如某一抗生素在有机溶剂（不溶于水）中溶解度较大，当料液和有机溶剂接触后，抗生素就从水相转移到有机相中。

另外，抗生素在不同pH条件下，可以有不同化学状态（如游离态酸、碱或成盐），其分配系数亦有差别，若适度改变pH，可将抗生素自有机相再转入水相，这样反复萃取，可以达到浓缩和提纯目。

2、溶液萃取法按操作方式不同，可分为单级萃取和多级萃取，后者分为错流萃取和逆流萃取。

当萃取剂用量相同时，二级萃取收率比单级萃取收率高，在萃取用量一定情况下，萃取次数愈多，则萃取愈完全。

多级逆流和错流萃取相比，萃取剂耗量较少，萃取液平均浓度较高。

3、乳化剂能使乳化液稳定：

（1）、界面膜形成表面活性剂分子聚集在界面上，形成紧密吸附层，在分散相表面形成保护层。

（2）、界面电荷影响：

O/W型乳状液油滴多数是带负电，W/O型乳状液中水滴则带正电。

产生排斥力。

（3）、介质黏度：

乳化剂能增加乳状液黏度，增加保护膜机械强度，则形成界面膜不易被破坏，并可阻止液珠聚结。

4、破坏乳化剂方法：

（1）、加入表面活性剂

（2）离心（3）加电解质（4）加热（5）吸附法破乳（6）高压电破乳（7）稀释法（8）其他途径：

超滤、反应萃取、中性磷萃取、脂肪类萃取剂

5、影响乳化剂类型因素有：

（1）乳化和破乳化

（2）pH影响（3）温度和萃取时间影响（4）盐析作用影响（5）溶剂种类、用量及萃取方式选择

6、影响双水相萃取因素：

（1）成相高聚物分子量

（2）成相高聚物浓度——界面张力（3）电化学分配——盐类影响（4）疏水效应（5）温度及其他因素

7、影响超临界流体萃取因素：

（1）压力影响

（2）温度影响（3）助溶剂（4）物料性质影响

8术语

双水相萃取：

不同高分子溶液相互混合可产生两相或多相系统，利用物质在互不相溶两水相分配系数差异来进行萃取方法。

双节线：

高聚物P、Q浓度均以重量百分含量表示，相图右上部为两相区，右下部为均相区，两相和均相分界线叫双节线

多级错流萃取：

料液经萃取后萃余液再用新鲜萃取剂进行萃取方法。

多级逆流萃取：

在第一级中加入料液（F），萃余液顺序作为后一级料液，而在最后一级加入萃取剂（S），萃取液顺序作为前一级萃取剂。

由于料液移动方向和萃取剂移动方向相反，故称为逆流萃取。

反胶束萃取：

表面活性剂溶于非极性溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，在有机溶剂内形成聚集体，其中表面活性剂非极性基团在外，和非极性溶剂接触，而极性基团在外，形成极性核，从而能够溶解极性物质，进行萃取。

超临界流体萃取：

（supercriticalfluidSCF）是利用处于临界压力和临界温度以上一些溶剂流体所具有特异增加物质溶解能力来进行分离纯化技术。

第五章沉淀和结晶

1、盐析沉淀是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度差异，通过向溶液中引入一定数量中性盐，使目物或杂蛋白以沉淀形式析出，从而达到纯化目方法。

基本原理：

一、盐离子和蛋白质表面具相反电性离子基团结合，形成离子对，因此盐离子部分中和了蛋白质电性，使蛋白质分子之间电排斥作用减弱而能相互结合。

二、中性盐亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，疏水区相互作用，使其沉淀。

2、影响盐析效果因素：

（1）无机盐种类

（2）溶质（蛋白质）种类影响（3）蛋白质浓度影响（4）温度影响（5）pH影响

3、影响沉淀效果因素：

（1）有机溶剂种类及用量

（2）pH影响（3）温度（4）无机盐含量（5）某些金属离子助沉淀作用（6）样品浓度

4、形成过饱和溶液方法：

（1）蒸发法

（2）温度诱导法（3）盐析结晶法（4）透析结晶法（5）有机溶剂结晶法（6）等电点法（7）微量扩散法（8）化学反应结晶法（9）共沸蒸馏结晶

5、影响晶体大小因素：

（1）过饱和度：

增加过饱和度能使成核速度和晶体生长速度加快，对前者影响较大，过饱和度增加，晶体较细小。

（2）温度快速冷却，达到较高过饱和度，晶体细小形成针状晶；反之，缓慢冷却得到较粗大晶体。

（3）搅拌速度：

搅拌能促进成核和加快扩散，提高晶核长大速度，过快则晶体会被打碎。

经验表明，搅拌速度愈快，晶体愈细。

（4）晶种加入晶种能诱导结晶，还能控制晶体形状、大小和均匀度。

6、等电点沉淀特点，如何应用

对于两性物质，等电点时净电荷为零，使稳定双电层及水化膜变弱或破坏，分子间排斥电位降低，吸引力增大，相互聚集，产生沉淀。

等电点沉淀法操作简便，试剂消耗少，给体系引入外来物质少，常用纯化方法，主要适用于水化程度不大，在等电点时溶解度很低物质。

应用：

胰岛素纯化时，在pH8。

0除去碱性杂蛋白，调pH3。

0除去酸性杂蛋白，粗提液经此处理后纯度大大提高，有利于后步提取操作。

7术语

Ks盐析：

在一定pH和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析。

β盐析：

在一定离子强度下仅改变pH和温度进行盐析。

盐析分布曲线：

蛋白质沉淀速度可用—dS/dP对盐饱和度（P）作图表示。

蛋白质沉淀速率开始时十分迅速，以后变慢，从起始沉淀到沉淀结束，形成具有尖峰曲线。

透析结晶法：

为了使蛋白质溶解度变化缓慢而且连续，而进行透析方法；在盐浓度缓慢降低结晶情况下，进行透析。

第六章吸附法

1、化学吸附和物理吸附区别：

当吸附剂和吸附物之间作用力是通过分子间引力（范德华力）产生吸附称为物理吸附，最常见一种吸附现象。

在吸附剂和吸附物之间有电子转移，发生化学反应而产生化学键，这种吸附称为化学吸附。

物理吸附是可逆，可以是单分子层吸附或多分子吸附，选择性较差。

物理吸附和吸附剂表面积、孔分布和温度等因素有密切关系。

化学吸附选择性强，即一种吸附剂只对某种或特定几种物质有吸附作用，只能形成单分子层吸附，吸附后较稳定，不易解吸，平衡慢。

项目

物理吸附

化学吸附

作用力

范德华

库仑力

吸附力

较小，接近液化热

较大，接近反应热

选择性

几乎没有

有选择性

吸附速度

较快，需要活化能很小

慢，需要较高活化能

吸附分子层

单分子层或多分子层

单分子层

2、吸附剂及被吸附物极性对吸附影响：

一般极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质。

极性吸附剂适宜从非极性溶剂中吸附极性物质，非极性吸附剂适宜从极性溶剂中吸附非极性物质。

如活性炭从水中吸附有机化合物；硅胶是极性，适宜从有机溶剂中吸附极性物质。

3、吸附剂用量及吸附剂浓度对于吸附效果影响：

一般吸附物浓度大时，吸附量也大。

由于杂质存在，浓度升高后，吸附杂质量也上升，吸附选择性差。

提高吸附选择性，常将料液适当稀释。

吸附量是指单位重量吸附剂所吸附物质量。

4两种以上常用吸附剂性质，用途。

活性炭：

吸附能力很强非极性吸附剂。

价格低，来源广。

除杂，生化药物分离。

人造沸石：

人工合成无机阳离子交换剂。

带正电荷。

和钠离子交换。

磷酸钙凝胶：

吸附作用主要是钙离子和蛋白质负电基团结合。

白陶土：

活性物质分离纯化吸附剂，也可作为助滤剂和去除热原吸附剂。

白陶土能吸附分子量较大杂质，包括导致过敏物质，常用它脱色。

：

氧化铝：

适用于亲脂性成分分离价廉，再生容易，活性易控制，操作不便，手续繁琐，处理量有限

硅胶：

活性强弱和自由水含量有关，自由水多，活性低，自由水少，活性高。

5、大网格高聚物吸附剂和传统吸附剂相比优点：

选择性好、解吸容易，理化性质稳定，机械强度好，反复使用，流体吸力较小。

6术语：

正吸附：

吸附提取液中有效成分。

负吸附：

去除提取液中杂质。

大网格高聚物吸附剂：

和大孔网状离子交换树脂具有相同大网状骨架，保留离子交换树脂功能团，性质和活性炭、硅胶等吸附剂相似。

第七章凝胶层析

1、公式Ve=Vo+KdVi各字母含义，凝胶层析原理。

Ve——淋出体积Vo——粒尖体积Vi——填料孔体积Kd——排阻系数或分配系数

凝胶层析原理：

平衡排除理论一个高聚物分子流出体积是由在宏观流动相和微观孔体积中平衡分配系数所决定。

这里所谓平衡是指扩散平衡，即溶质分子扩散进入一个填料颗粒孔中且再出来所需要时间远小于溶质区段在此停留时间。

换言之，当溶质分子流过一个填料颗粒这段距离时，溶质分子已多次进出于填料孔，达到平衡。

平衡条件只是在流速很慢时一个极端情况。

2、常用凝胶名称、特点及用途。

名称

特点

用途

葡聚糖凝胶（SephadexG）

最常用，稳定，对阳离子轻微吸附，多次重复使用

分离

修饰葡聚糖凝胶

聚丙烯酰胺凝胶

化学稳定好，成分不易脱落，适用pH广，机械强度好，无带电基团，分辨率较高

琼脂糖类凝胶

多孔玻璃微球

化学稳定性高、强度大、高压下操作，好流速；缺点是对糖类、葡萄糖吸附

疏水性凝胶

只适用分离分子量较小物质

分离不溶水有机物质

3、选择凝胶：

选择何种凝胶及其型号、粒度，一方面是考虑凝胶性质，包括凝胶分离分子量范围，（渗入限和排阻限），理化稳定性、强度、非特异吸附性质等；另一方面还要注意分离目和样品性质。

4、好凝胶层析效果如何选柱、装柱。

选柱：

层析柱有效体积和柱比选择必须根据样品数量、性质及分离目加以确定。

对于类分离，柱床体积一般微样品溶液体积5倍或略微多一些就够了，柱比5：

1或10：

1，对于分级分离，要求柱床体积大于样品体积25倍以上，柱比在25~100之间。

底端支持物满足两个条件：

不易阻塞，死腔小。

装柱：

正式装柱前必须检查柱底凝胶支持物是否符合要求。

要求不漏不堵，不吸附样品，且能保持一定流速。

在装柱时，连续搅拌下小心装柱。

开始装柱时，避免胶粒直接冲击支持物，空柱种应约留1/5水或溶剂。

所用凝胶必须是用相应溶剂系统充分溶胀。

为了防止柱中出现气泡，凝胶悬液温度必须和室温平衡并用水泵减压排气。

进胶过程必须连续、均匀，不要中断，并在不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发生凝胶分层和胶面倾斜。

5、溶质通过色谱峰时造成峰加宽效应包括：

（1）分子扩散：

使用颗粒度小而均匀填料可以降低扰动作用。

（2）涡流扩散：

涡流扩散对凝胶色谱峰加宽比较重要。

应用小而均匀填料紧密地装在内径适当柱中可以减少由涡流扩散造成峰加宽，提高效柱。

（3）流动相中传质阻力造成色谱峰加宽。

扩散速度越快，流速不平衡影响就越小。

（4）固定相中传质阻力造成色谱峰加宽。

填充介质粒度越小所造成峰加宽效应也小。

溶液在柱外产生峰加宽：

（1）连接管路

（2）检测池

6、利用凝胶层析测量蛋白质分子量。

测定依据是不同分子量物质，只要在凝胶分离范围内（渗透限和排阻限之间），洗脱体积Ve及分配系数Kd值随分子量增加而下降。

对于一个特定体系，待测定物质洗脱体积和分子量之间关系：

Ve=-KlgM+C

（1）求解法以两个已知分子量蛋白质过柱，求出C和K，将待测物Ve代入得到M。

（2）标准曲线法以多个已知分子量标准蛋白过柱，测取各自Ve值。

以Ve作纵坐标，lgM作横坐标，，制作标准曲