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色谱柱
第5章色谱柱
5-1引言
色谱柱是HPLC分离过程的核心。
一支稳定、高效的色谱柱对建立普适性强、重现性好的方法是必不可少的。
不同供应商的色谱柱,甚至来源相同、认为完全一样的色谱柱之间,可能也会存在很大差异,尤其是不同的色谱柱在塔板数、谱峰的对称性、保留值、峰间距以及使用寿命方面会有所不同,而这些不同对建立理想的HPLC方法会产生很大影响。
本章中,我们将提供一些有关色谱柱担体、固定相及柱填料的信息供读者参考;讨论色谱柱应用中的问题,以及适宜的解决方案,以确保方法普适性强、重现性好,同时也讨论了在常规HPLC分析中,为获得最佳结果,一支“好”色谱柱的重要意义。
选择HPLC柱时,大多数使用者都认为柱间的重现性是方法建立中极为重要的因素。
色谱工作者不愿在校准了一具体系统后,又不得不为一新色谱柱再重新建立HPLC方法。
一些生产厂能在一定程度上保证柱性能指标的重现性,如色谱柱塔板数(N),特定样品与条件下的选择性,反压(压力降),特定测试溶质的保留值(k)。
因此,对许多使用者来说,生产优质产品的厂家的信誉很重要。
价格对一些用户是重要的因素,但上述讨论的其它因素在建立一个普适性强、令人满意的方法时往往更加重要。
色谱柱价格在建立和应用普适性强、可靠的HPLC方法的整个费用中,仅占一小部分(见5-3节)。
5-2色谱柱与柱填料的特性
5-2-1柱填料
大多数用于HPLC分离的柱填料使用硅胶微粒(作担体)。
基于多孔聚会物担体或其它材料的色谱柱也已商品化,这些非硅胶填料由于有其特殊的应用,以后再作讨论。
由于硅胶担体与键合的有机表层(如C18或C8),应用范围广,我们将作重点讨论。
图5-1所示为HPLC中常用的几种微粒类型。
由于全多孔微球很好地兼顾了众多理想的性质:
效能、样品荷载量、耐久性、方便性以及有效利用率等,所以最为常用。
这些微粒有不同的粒径、孔径和表面积供选择,所以用这些物质能建立各类HPLC方法。
图5-1的微粒类型(图示大致为所用微粒的相对大小)。
实心微球型微粒固定相有一实芯核,起作用的是其表面很薄的外壳。
这些硅胶或聚会物基质的微粒,通常为1.5~2.5μm,因为其快速传质的动力学过程,对大分子有突出的福利效能。
因为这些实心超小微粒的表面积较小,样品容量有限,所以仅适于分析型HPLC。
这种超小微粒的色谱柱出峰极为尖锐(小体积),因此要求所用HPLC仪器的柱外峰展宽因素极小,以避免峰展宽。
灌注色谱填料包含孔径达4000~8000A0(艾)的贯穿孔,而且在这些贯穿孔网络中还有较小的内联孔(如300~1000A0(艾))。
在高流速时,溶质可通过对流和扩散的共同作用,进入(并离开)该孔结构。
其效果减少了峰展宽,所以大的多孔微粒在柱效方面与小微粒相当,但压力降却小得多。
目前这种类型填料的使用还较少,因此,其实用性还有待于进一步探讨。
不过,这种填料似乎非常适于大分子如蛋白质的制备分离,用于小分子的日常分析分离则较少。
颗粒大小(粒度)在HPLC中极为重要。
约5μm的微粒直径很好地兼顾了分析柱的柱效、反压和寿命。
更小的多孔微粒(如3μm)对快速分离很有用。
小至1.5μm的薄壳微粒对极快速地分离蛋白质等大分子较有用。
较窄的粒度分布(<±50%均值)能保证填充床的稳定、高效和压力降最小。
总的说来,3或5μm全多孔微球填充HPLC色谱柱,能满足大多数分离的需要,我们推荐大多数的方法建立用这些粒度的色谱柱。
表5-1总结了HPLC分离用微粒的理想的物理特性,以及它们的重要性。
一般使用7~12nm(70~120A0(艾))孔径的全多孔微粒。
表面积150~400m2/g的全多孔微粒分离小分子较有利。
表5-2列出一些窄孔径C18商品柱的典型物理性质。
对于分子量大于10000Da分子的分离,需用孔径大于15nm的微粒,使这些溶质容易进入到微孔结构内部的活性表面。
各种情况下,都应保证溶质在微孔里能迅速扩散与柱效良好。
孔径至少是溶质流体动力学直径的4倍,才能确保溶质的有限扩散不至于使柱效下降。
大孔微粒的比表面积有10~150m2/g不等,取决于微孔直径的大小;孔径越大表面积越小。
表5-2分析柱的理想的微粒特性
特性
用途
5μm全多孔微粒
大多数分离
3μm全多孔微粒
快速分离
1.5μm薄壳微粒
极快速分离(尤其是大分子)
±50%(均值的)粒径分布
稳定、重现、高柱效、柱压低
7~12nm孔径,150~400m2/g(小孔)
小分子分离
15~100nm孔径,10~150m2/g(小孔)
大分子分离
表5-2一些C18色谱柱硅胶担体的物理性质
色谱柱
孔直径(nm)
表面积(m2/g)
体积孔隙率%(ml/ml)
HypersilODS
12
170
57
LiChrosorbC18
10
355
71
NovapakC18
6
——
——
NucleosilC18
10
350
69
SymmetryC18
10
335
66
ZorbaxODS
6
300
5
ZorbaxRx,SB,XDB
8
180
50
5-2-1-1硅胶填充微粒如前所述,硅胶基质是目前最为常用的HPLC柱填料。
这主要是基于硅胶担体良好的物理特性。
通过控制全多孔硅胶微粒的制作工艺,能够得到平均孔径变化范围宽(如8、30、100μm)、孔径分布范围窄和粒度选择性较大(如10、5、3μm)的填料。
能满足大、小分子的分析及制备。
大多数硅胶微粒的突出优点是它们的机械强度很高,这一点可保证填充床长时间在很高的操作压力下工作,柱效保持稳定。
刚性、高强度的微粒还使柱的反压较低,寿命较长。
在用于制作HPLC填料的材料中,硅胶基质色谱柱的柱效最高,这也是其重要优点之一。
球形与不规则形硅胶微粒在色谱中均有使用,但球形微粒具有一些特有的优点。
球形微粒强度高,更易装填成高效柱,重现性好。
不规则形微粒填充柱开始时与相同粒度的球形柱的柱效相当,但使用中往往会产生较高的反压(由于不规则形微粒的破碎,产生“细粉”)。
因为价格低与其它的考虑,不规则形大微粒广泛应用于制备与处理(见第13章)。
硅胶担体的表面性质极为理想,在于其表面能通过化学改性(修饰)引入种类繁多的、具有不同官能团的键合相。
硅胶基质填料与水及所有有机溶剂兼容,在更换溶剂时,填料的大小不会变化(如溶胀)。
这种特性使填充床在用各种类型溶剂时以及使用梯度洗脱期间,仍能保持稳定。
作为HPLC色谱柱的担体,硅胶并非完美无缺。
在高pH时硅胶能溶解。
要获得满意的使用寿命,不应在pH8以上使用某些硅胶基质的色谱柱(即通常用可溶性硅酸盐沉淀制成的所谓“Sol——gel”氧化硅胶或干凝胶类型)。
然而,基于聚集硅溶胶制得硅胶微粒的色谱柱(称为溶胶凝胶型),至少可在pH9条件下操作。
pH>9时,硅胶担体能迅速溶于某些流动相中,最终造成填充柱床塌陷,伴随柱效的遽然下降,峰不对称性加剧。
(有时,在特定流动相条件下,一些溶胶-凝胶型硅胶基质填充色谱柱能在pH11下工作,结果良好;见5-2-3-4节)硅胶基质的另一个缺点是其表面的酸性,不适宜分离碱性化合物。
幸运的是,如下所讨论,新型的高纯硅胶担体的酸性较弱,能最大限度地减小碱性溶质时存在的问题。
HPLC球形多孔硅胶的合成,可采用一些不同方法。
图5-2所示为一些商品硅胶微粒的外观比较(表面形貌,形状和粒度分布)。
由于其表面积、纯度、孔径分布和表面化学的不同,会表现出不同的色谱性能。
略
图5-2一些多孔硅胶微粒的透射电镜照片。
未改性硅胶表面化学性质随制备条件而变化,文献中已有讨论。
水合硅胶含有硅羟基表层(-SiOH)。
加热高于8000C时,这些硅羟基大部分会被脱掉,在HPLC中已无使用价值。
用于HPLC的硅胶应完全羟基化,水合硅胶表面的硅羟基最大浓度约为8μmol/m2,这时使用效果最佳。
如图5-3所示,水合硅胶的表面含有不同种类的硅羟基。
如图5-3上图所示,硅羟基一般有三种存在类型。
这些不同类型的硅羟基可用幻角自旋(MAS)的SiNMR法与傅立叶变换的漫反射红外光谱法(DRIFT)进行鉴别并测定。
自由或孤立(无氢键键合)的硅羟基一般产生于低浓度中,这些自由硅羟基由于其酸性很强,能与碱性溶质产生强烈无益的结合。
因此,含自由、酸性硅羟基浓度高的硅胶往往使碱性样品的保留值增加,峰变宽、拖尾。
图5-3HPLC硅胶担体的表面
完全羟基化的硅胶基质填料,具有最高浓度成对的与缔合的硅羟基(见图5-3),最有利于碱性化合物的色谱分离。
这些硅胶表面的成对硅羟基浓度往往很大(见图5-3),有时可达总数的25~30%。
成对的硅羟基的酸性比自由硅羟基的弱,一般分离碱性溶质较“顺利”。
完全羟基化的HPLC硅胶缔合的或氢键键合的硅羟基浓度最高,所以最理想。
硅羟基酸性小,分离碱性溶质较“顺利”。
一些商品硅胶填料为部分羟基化状态,填料通常酸性较强,不适于分离碱性化合物。
硅胶担体的纯度对许多极性化合物的分离也极为重要。
如图5-3下图所示,某些硅胶被一定金属污染(Fe、Al、Ni、Zn等)。
这些金属杂质能与螯合溶质络合,引起不对称或峰拖尾,甚至化合物完全被保留,不能洗脱出。
硅胶晶格中的其它金属(尤其是铝)能使表面硅羟基活性增强,酸性增强。
因此,许多HPLC分离,尤其是碱性与强极性化合物需用高纯硅胶。
这些硅胶的纯度极高,如表5-3中分析的一种类型所示。
用色谱试验来说明硅胶表面酸性与螯合或络合效应已有报道。
表5-3用ICP-AES/MS法分析ZorbaxRx-SIL硅胶的典型微量元素
元素
含量a(ppm)
Na
10
Ca
2
K
<3
Al
1.5
Fe
3
Mg
4
Zn
1
a总量:
<35ppm(未检出其它元素,<1ppm);99.995%。
有些色谱用硅胶,按它们作为色谱柱担体分离碱或酸性化合物的理想程度,被评定分级。
过去的纯度不高的酸性硅胶(称A型硅胶),能用于分离中性和非电离的化合物。
新型的高纯度的弱酸性硅胶(称B型),一般对离子或可电离的化合物,尤其是碱性物质分离较好。
表5-4列出了一些可用于分离碱性化合物的新型硅胶名单(以字母顺序排列)。
随着使用者与生产商对这些高纯度硅胶制成的色谱柱优点的认识,表5-4还会继续快速增长。
图5-4比较了用C18柱分离碱性药物的一些情况,有的为A型硅胶,有的为B型硅胶作基质。
以弱酸性硅胶为担体的色谱柱(B型)表现出优良的谱峰形状与柱效。
用不同的硅胶担体往往会使化合物的保留值、峰间距与峰拖尾有很大的差异。
减小这些差异的技术将在7-3-3节中进行讨论。
基于B型硅胶所表现出的特殊优势(见表5-4),将来有可能需要在大多数的HPLC方法建立中使用(包括碱性与非碱性样品)。
5-2-1-2多孔聚合物用多孔聚合微粒填充的色谱柱也可用于HPLC。
这些聚合微粒中有些(如聚苯乙烯)是疏水性的,可直接用于反相分离,而不需添加表面涂层。
用于反相HPLC的大多数聚合微粒由二乙烯基苯交联的聚苯乙烯制成,类似于那些用作离子交换剂的树脂。
其它聚合物微粒,如取代异丁烯酸与聚乙烯醇,也已经商品化,但用得还不多。
全多孔与薄壳型微粒均有。
与硅胶担体一样,孔径较小的多孔聚合微粒用于小分子溶质,孔径较大的用于大分子的分离。
多孔聚合物的主要特点是在pH1~13均可用。
这些色谱柱能在高pH下分离强碱性溶质,这时化合物以自由态和非电离态存在,色谱峰形较好。
见图5-5的应用示例。
该方法分离这类化合物,可替代离子对色谱法(见7-4节的离子对分离碱性化合物),而且流动相中不必添加离子对试剂。
多孔聚合物的另一潜在优点是有很强的疏水保留性(相对于硅胶基质的C18柱),对亲水性较强的化合物也有足够的保留。
大孔的多孔聚合物对蛋白质样品的分离非常有用(见11-2节)。
因为多孔聚合物在高pH时很稳定,强保留物质可用0.1M的氢氧化钠从柱中洗脱。
与相同粒度的硅胶基质色谱柱比较,多孔聚合物柱的缺点是柱效低。
已有的应用文献表明,它的塔板数一般不到类似的硅胶基质色谱柱的一半。
聚合物柱还有一个特殊问题,这种担体在不同有机改性剂中溶胀程度不同。
因此填充床会因微粒溶胀不同而变化,该性质可能是聚合物柱效率低的原因。
在梯度洗脱中更明显,因为分离过程中有机溶剂浓度是变化的。
为尽量减小可能的问题,一些色谱工作者只在单一有机改性剂的等度分离中才用聚合物基质柱。
图5-4以A型与B型硅胶担体的色谱柱分离三环抗抑郁药的比较
色谱柱:
15×0.46cm;流动相:
乙腈-0.025M磷酸钠缓冲液(30:
70),pH2.5+三乙胺与三氟醋酸各0.2%;流速:
1.0ml/min;400C;254nm检测;进样5μL。
表5-4推荐用于分离碱性化合物的一些硅胶基质担体与色谱柱
Altima
RSIL
Betasil
SupelcosilABZ+
DeltaBond
SupersphereRP
EncapharmRP
Symmetry
Hypersil–DBS
SynchropakRP-SCD
Inertsil
Techspere-BDS
Kromasil
Vydac
LiChrospherSelectB
YMC-Basic
NucleosilAB
ZorbaxRx,SB,XDB
通过改变色谱柱硅胶基质的官能团,可以变其反相分离的选择性(见6-3-3节)。
以其它官能团改性的多孔聚合微粒,如C18、NH2和CN,也可改变固定相的选择性。
不过,目前用于聚合物色谱柱的功能团仅有几种。
改性聚合物柱填料应用于某些离子交换有明显优势。
多孔聚合物(例如:
二乙烯基苯交联的聚苯乙烯)加可电离的官能团,如-COOH、-SO3H、NH2和NR3+,为分离众多的酸性与碱性化合物提供了可能,这些柱填料物质用于生物样品的分离、提纯最多。
这些分离常需要在高pH下操作,如清除内毒素和其它生物污染物。
在这类应用中,与硅胶基质柱相比,多孔聚合物的优点是稳定性更好。
但与硅胶基质的离子交换剂比较,聚合物基质离子交换剂通常与其它聚合物基质柱填料存在同样的缺点:
柱效低、分离慢。
5-2-1-3其它无机填料其它用于HPLC的无机担体填料色谱柱也已经商品化。
由于其特殊的性质,它们一般用于特殊的应用,然而,这些无机填料的使用经验比已广泛应用的硅胶基质柱的和多孔聚合物柱的少得多。
未衍生化的石墨碳正逐步被接纳为反相色谱柱的填料,已经制得具各种粒度的多孔小球。
用这种填料的分离略不同于硅胶基质烷基键合相。
石墨碳的表面即是保留的基础——不再需其它固定相。
该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物的保留强。
石墨碳已证明可用于分离某些几何异构体,如图5-6所示。
石墨碳柱也可用于保留与分离那些因亲水性太强、在C18键合相柱上保留较小的化合物。
如已分离了药物等一些极性化合物。
由于在HPLC流动相中不会被溶解,这类柱可在任何pH与温度下使用。
图5-5pH11时多孔聚合物柱的色谱图
美西律及其片剂基质,添加1%的杂质(Ⅰ)。
色谱柱:
12.5×0.4cmAshipakODP-50;流动相:
28:
72(v/v)乙腈-水,用二乙胺调pH至11;流速:
0.9ml/min;400C;264nm检测;进样20μL。
注意杂质的吸收系数比较大。
石墨碳色谱柱与硅胶微粒相比,其缺点是柱效低、极易碎裂。
用一些流动相/溶质系统,尤其是大k值的组分,不易获得好峰形。
杂质往往会聚集于柱床上,最终以背景干扰流出。
因此,石墨碳柱要求用高纯流动相,被吸附的杂质会不可逆地改变色谱柱的性能,所以样品清除布置对延长色谱柱寿命很有用。
这种材料的色谱柱仅有短柱,而且比较贵。
目前可供选择的孔径还不多。
小孔与大孔的氧化铝也可用于HPLC。
氧化铝被制成不同的粒度,但不象色谱用硅胶的品种那么多。
氧化铝微粒刚性强,可制成稳定的柱床。
未经改性的氧化铝能在正相条件下分离弱极性溶质(见6-6节)。
氧化铝担体用聚合相进行涂层后,如聚丁二烯,可进行反相分离。
通过烯烃与硅氢改性氧化铝担体的作用,也可制得烷基改性固定相,但商品固定相官能团种类的范围非常有限。
氧化铝基质填料的一个优点是可在pH高达12的流动相中使用。
强碱性化合物用高pH的流动相,不加离子对试剂即能分离。
氧化铝基质的填料不能用于羧酸样品,因为这些化合物与氧化铝不可逆地结合。
有些商品氧化铝对碱性化合物也很活泼。
除了流动相pH值可高于10,氧化铝基质的应用与硅胶的相当类似,无明显的优势。
因而,氧化铝柱尚未达到广泛应用的硅胶填料柱的认可程度。
图5-6在石墨柱上分离顺-反异构体。
样品:
平喘药(ly170680);色谱柱:
10×0.46cmHypercarb;流动相:
630ml甲醇与320ml二氯乙烷,加6.8ml三氟醋酸;流速:
1.0ml/min;UV检测器264nm。
氧化锆基质的填料也可用于HPLC。
多孔微球与无孔超微球的制备与应用均有报道。
然而,目前商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球柱。
这些坚固的填料可用于所有已知的HPLC洗脱剂,pH范围1~14,温度高达1000C。
氧化锆基质柱在高pH下的操作能力使其能用于分离未电离的强碱性化合物。
这些方法可替代通常硅胶基质柱在低pH或用离子对色谱法分离该类化合物。
由于氧化锆填料是最近几年才开始研究,不同粒度、孔隙度的固定相目前尚没有。
因此,目前氧化锆柱填料比硅胶与聚合物基质的材料有什么重要用途与优势尚无定论。
用氧化锆柱的一个实验难题是必须严格除去二氧化碳。
否则,氧化锆表面与二氧化碳牢固键合,会改变其色谱性质。
另一个考虑是氧化锆也会牢固地与氟化物、磷酸盐以及其它路易斯酸键合。
该性质说明必须用含有这些阴离子的流动相仔细地预处理该担体的表面,以保证分离的重现性。
氧化锆表面还与羧酸及磺酸牢固地键合,或许也不可能分离含有这些化合物的混合物。
5-2-2色谱柱的构型
大多数用于HPLC的色谱柱是用一节内壁经高度抛光处理的直不锈钢管,用收缩接头将其与HPLC仪器连接。
不锈钢可用于所有有机溶剂与大多数水性缓冲液。
然而,含氯的流动相会缓慢地“卤素腐蚀”不锈钢材质(尤其在低pH时),所以使用该流动相时应倍加小心。
综合考虑的话,大多数HPLC用不锈钢色谱柱最好。
也有用玻璃、玻璃衬里不锈钢与塑料制作的商品柱,用于可能与不锈钢发生有害作用的特殊样品。
然而,资料中能证明不锈钢柱发生这类问题的很少。
这些与不锈钢成分(铁、铬、镍)牢固络合的样品最有可能产生这类问题。
色谱柱内壁的表面积很小,所以发生不良反应的机会不大。
多孔烧结物(滤片)封闭色谱柱的两头,固定住填料微粒。
一般来说,5μm与3μm的微粒分别用2μm与0.5μm孔径的不锈钢滤片。
不锈钢柱发生的问题,通常要追溯到入口不锈钢滤片,它的表面积比可能与样品发生不良反应的色谱柱内壁要大得多。
峰形不好与样品回收率低,可能预示滤片出现问题。
多孔钛与聚合物滤片的活性弱,可用于对付这类偶尔发生的问题。
有人建议分离生物样品时用玻璃柱,由于受压力的限制(如<1000psi),其应用受到限制。
玻璃衬里的不锈钢柱可用常规的HPLC压力,但这些组件较易碎裂,需小心使用。
经验表明,玻璃柱分离生物样品的需求并不多,(方便的)不锈钢柱足以应付大多数的应用。
在用其它材料不合适时,可用带有聚合物接头的刚性聚合物(PEEK)柱。
这些色谱柱具有铝外壳,能承受较高的操作压力。
也有弹性聚合物外壳的色谱柱。
径向加压柱(美国WATERS公司)借助液体对柱半径的压力,可随时对填料物质加压。
这种类型柱的优点是价格低,而且是非金属结构。
然而,由于形成最佳填充柱床可能有困难,用该法时柱效以及柱间的重现性可能不好,这类柱的控温也有困难,如需连接加长柱时,需另外的液压装置。
对收缩接头柱,不同填料均可应用。
如果制作良好的话,这类色谱柱的柱效与重现性水平最高。
另外,价格低的不锈钢卡套柱也有各种尺寸与不同填料类型。
卡套柱实际上是装有填料的空管坯(两端未装接头)。
用可重复使用的柱架与接头将这些填充管连接于HPLC仪器上。
这些廉价的卡套柱对常规测定,尤其不需极高柱效时,极其诱人。
为较低费用,生产厂商一般不对每支卡套柱效进行测定。
而在随机从每批中选择测之。
不过,通常都标有最小柱效,而且有时能为每个组件进行担保。
表5-5总结了商品色谱柱构型。
建立分析方法通常用内径0.46cm或0.3cm、粒度3~10μm的色谱柱最好。
5μm微粒的色谱柱通常可兼顾理想柱效、重现性和可靠性。
3μm微粒的色谱柱能快速分离或柱效高,如2-3-3-1节中的讨论。
然而,3μm柱的常见问题是它们可能更易发生堵塞,大大降低了色谱柱的寿命。
带有压缩接头的色谱柱适于大多数应用,尤其是那些操作压力高的长柱。
通过改变分析柱长度几乎能对所有的应用进行优化。
表5-5色谱柱构型(不锈钢)a
类型
内径(cm)
长度(cm)
粒度(μm)
分析型
加压柱头
0.3——0.46
3——25
3——10
卡套
0.3——0.46
7.5,10
3——10
微球
0.1,0.21
15,25
3——8
半制备型
0.8——1.0
10——25
5——20
制备型
2.0——5.0
10——25
5——20
a在某些构型中,也可采用玻璃、玻璃衬里、塑料与PEEK材质。
3.5μm微粒填充的色谱柱似乎能很好地兼顾高效与柱寿命。
与5μm微粒柱比较,柱效有明显改善;在柱长度相同时,用一半分离时间能获得与其相当的分离度。
而且在使用高流速时,柱效损失并不大,所以,如需要,可进行快速分离(见图5-18)。
由于3.5μm微粒柱使用2μm孔径的入口滤片,比传统的3μm微粒柱使用的0.5滤片的堵塞倾向要小得多。
3.5μm微粒柱要求粒度分布窄,无“细粉”,使色谱柱的反压适中。
0.3cmID色谱柱的溶剂消耗只是广泛使用的0.46cm柱的一半,当用0.21cm细径柱时,可比0.46cmID柱减少4倍,而0.1cmID的细径柱可用的分析溶剂更少,这些组件有的长度可达25cm,粒度范围在3~8μm之间。
细径柱的主要优点的单位质量样品的检测灵敏度高。
这些构型最适于受质量限制(非体积限制)样品的应用。
当HPLC仪器与质谱仪及其它需输入小体积溶剂的仪器联用时,细内径色谱柱特别有用(并往往是必须的)。
由于用这些细径柱不易得到均一的填充床,有时塔板数会低于同类的0.46cmID柱,而且,柱外效应往往极为明显,尤其是柱内径小于0.3cm时,可能需特殊的仪器组件才可获得满意结果。
如表5-5所示,带收缩接头的半制备和制备型不锈钢柱,常用的内径范围为0.8~5cm。
(尽管更大的内径也已商品化,但通常更适于中试装置与处理操作。
)这些半制备和制备色谱柱中填充的往往是柱效低的大颗粒(如10~15μm)。
当分离的样品量很大时,色谱柱效就不那么重要了。
表5-5中未列出内径细达50μm的熔融石英填充式细管柱。
有几家供应商可提供这些色谱柱,主要用于与质谱仪连接,对大多数的常规应用不大适合。
这类柱的一般应用尺寸为25或50cm×380μmID。
用于该构型的微粒一般为3~5μm,但更小的有报道。
当用这些柱时,必定需要特殊仪器,因为峰体积极小,极易引起峰展宽。
5-2-3固定相
5-2-3-1键合硅胶硅胶基质的反相填料一般通过在担体表面上共价键合有机硅烷或沉积聚合物有机涂层。
图5-7所示为使用最广泛的有机硅烷填料的表面反应式。
许多键合相填料用单官能团试剂制得,如图5-7a所示,也有些商品填料是用三官能团(有时也用双官能团)硅烷与胶硅表面反应的交联型聚合表层(图5-7b与c)。
图5-7c中的方法一般用于引入能与氯硅烷反应的R基团(如氨基或二醇基相),这些反应通常用三官能团硅烷[如(EtO)3-Si-(CH2)3-NH2],重现性往往不好。
图5-7键合相填料的化学反应。
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- 色谱