生化分离工程期末考试.docx

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生化分离工程期末考试

第一章 绪论

1、生物分离工程：

从发酵液或酶反应液或动植物培养液中分离、纯化生物产品的过程。

2、生化分离工程的特点：

①目标产物浓度低、杂质含量高；②物料体系复杂——多相，非牛顿流体；③目标产物稳定性差；④分离过程可变性；⑤质量要求高⑥产品价格与产物浓度呈反比

第二章 发酵液的预处理和固液分离

1、预处理的目的：

促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率。

2、预处理的方法：

凝聚和絮凝、加热法、调节悬浮液的PH值、杂蛋白的去处、高价无机离子的去除、助滤剂和反应剂。

3、凝聚：

指在投加的化学物质作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成１mm大小块状凝聚体的过程。

机理：

1）中和粒子表面电荷；2）消除双电层结构；3）破坏水化膜。

4、絮凝：

指使用絮凝剂将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。

其中絮凝剂主要起架桥作用。

机理：

架桥作用。

采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分离。

5、絮凝的影响因素：

1.发酵液的性质；2.絮凝剂的浓度，最佳用量为粒子表面积约有一半被聚合物覆盖；3.絮凝剂的分子量；4.pH控制；5.搅拌速度。

6、混凝：

对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理，单独使用可达到较好絮凝效果；对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果。

这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。

7、杂蛋白的去除方法：

沉淀法（等电点沉淀法、酸碱调节）、变性法（蛋白质从有规则的排列变成不规则结构的过程称为变性）、吸附法（加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去）。

8、固液分离的方法：

过滤、离心、膜分离、双水相萃取、扩张床吸附。

9、影响发酵液固液分离的因素：

1）发酵液中悬浮离子的大小；2）发酵液的黏度（固液分离速度通常与粘度成反比，粘度越大，固液分离越困难。

）

10、过滤:

借助于过滤介质，在一定的压力差ΔP作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔道，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的单元操作。

11、离心技术分类：

（1）按分离因子Fr分类：

①常速离心机（Fr<3,000）；②中速离心机（Fr=3,000—5,0000）；③高速离心机（Fr≥5,0000）；④超速离心机（Fr=20,000—2,000,000）。

（2）按用途分类：

①分析性（超速离心机）；②制备性（实验室用、工业用）。

（3）工业应用分类：

①管式离心机；②多室式离心机；③碟式离心机；④螺旋卸料沉降离心机；⑤离心过滤

12、离心沉降原理：

在重力场中，当一固体微粒通过无限连续介质时，它的运动速度受两种力的影响：

一是微粒受到因微粒和流体介质间密度不同而产生的作用力Fg；二是微粒所受到的流体阻力作用Ff。

13、离心机的种类按速度和离心力：

1）常速离心机：

用于细胞、菌体和培养基残渣等分离；

2）高速（冷冻）离心机：

用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离；

3）超速离心机：

用于DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。

14、超速离心的离心方法：

差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心。

第三章  细胞破碎与分离

1、细胞破碎技术:

利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。

2、细胞破碎方法及其原理

①机械破碎：

通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。

②物理破碎：

通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。

③化学破碎：

通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎。

④酶促破碎：

通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎。

3、选择破碎方法的依据：

1.细胞处理量；2.细胞壁强度和结构；3.目标产物对破碎条件的敏感性；4.碎程度；5.目标产物的选择性释放。

4、包涵体：

一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。

目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。

5、高表达产生的积聚物在细胞内部形成不溶物原因？

答：

①蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀②蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀③蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀④表达蛋白过多，与其结合/诱导组分不足，不能形成溶解状态⑤蛋白质自身不稳定。

6、基因工程包涵体的纯化方法：

收集菌体细胞→细胞破碎→包涵体的洗涤→目标蛋白的变性溶解→目标蛋白的复性。

7、包涵体获得几种常见的工艺路线

（一）：

机械破碎→离心提取包含体→加变性剂溶解→除变性剂复性

特点:

是利用了包含体与细胞碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包含体，再对包含体溶解复性。

优点：

摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单了。

从这个角度上讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处。

缺点:

要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时间较长。

（二）：

机械破碎→膜分离获得包涵体→加变性剂溶解包含体 →除变性剂复性

特点：

应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质。

优点：

封闭式操作，不污染环境也不受环境污染，能量消耗也比离心法少。

缺点：

细胞碎片和包含体一起被膜挡住，难以分开，而且膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白质的滞留。

（三）：

化学破碎→离心除细胞碎片→除变性剂复性

优点：

用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。

缺点：

是所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离带来困难。

第四章沉淀法

1、沉淀：

利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。

2、沉淀法基本原理：

采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。

3、沉淀法的分类：

根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：

①盐析法；②等电点沉淀法；③有机溶剂沉淀法；④非离子型聚合物沉淀法；⑤聚电解质沉淀法；⑥成盐类复合盐沉淀法；⑦亲和沉淀法；⑧选择性变性沉淀法。

4、沉淀法操作步骤：

①加入沉淀剂②沉淀剂的陈化，促进粒子生长③离心或过滤，收集沉淀物。

5、盐析：

在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。

机理：

（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集；

（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域；（3）中和电荷，减少静电斥力。

6、硫酸铵饱和度：

250C时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L定义为100%饱和度。

7、盐析的影响因素：

①pH值；②温度；③蛋白质浓度；

8、有机溶剂沉淀法：

在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。

9、有机溶剂沉淀法机理：

①降低溶剂介电常数；②破坏水化膜；③相反力，疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结合形成疏水层。

10、乙醇：

沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；

11、选择性变性沉淀法：

选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀下来，而与目的物分开。

第五章 膜分离技术

1、膜分离技术：

用半透膜作为选择障碍层，利用膜的选择性，以膜的两侧存在的能量差作为推动力，允许某些组分透过而保留混合物中其它组分，从而达到分离目的的技术。

2、截留分子量：

微滤0.02～10μm；透析3000～几万Dalton；超滤50nm～100nm或5000～50万Dalton；纳滤200～1000Dalton或1nm；反渗透200Dalton。

3、膜材料的特性：

对于不同种类的膜都有一个基本要求：

①耐压：

膜孔径小，要保持高通量就必须施加较高的压力，②耐高温:

高通量带来的温度升高和清洗的需要；③耐酸碱：

防止分离过程中，以及清洗过程中的水解；④化学相容性：

保持膜的稳定性；⑤生物相容性：

防止生物大分子的变性；⑥成本低。

4、表征膜性能的参数：

①截断分子量；②水通量；③孔的特征；④pH适用范围；⑤抗压能力；⑥对热和溶剂的稳定性等。

5、影响截留率的因素：

分子形状；吸附作用；浓差极化作用；温度/浓度；错流速度；pH、离子强度影响蛋白质分子构型，影响。

6、水通量：

纯水在一定压力（0.35MPa），温度（25℃）下试验，透过水的速度L/hm2。

JW=W/At

7、微滤、超滤、纳滤、反渗透相同点：

①以膜两侧压力差为推动力；②按体积大小而分离；③膜的制造方法、结构和操作方式都类似。

区别：

①膜孔径：

微滤0.1－10m>超滤0.01－0.1>纳滤0.001－0.01m >反渗透小于0.001m；②分离粒子：

微滤截留固体悬浮粒子，固液分离过程；超滤、纳滤、反渗透为分子级水平的分离；③分理机理：

微滤、超滤和纳滤为截留机理，筛分作用；反渗透机理是渗透现象的逆过程：

④压差：

微滤、超滤和纳滤压力差不需很大，0.1－0.6MPa

8、微滤:

以多孔薄膜为过滤介质，压力差为推动力，利用筛分原理使不溶性粒子（0.1-10um）得以分离的操作。

操作压力0.05-0.5MPa。

应用:

1）除去水/溶液中的细菌和其它微粒；2）除去组织液、抗菌素、血清、血浆蛋白质等多种溶液中的菌体；3）除去饮料、酒类、酱油、醋等食品中的悬浊物、微生物和异味杂质。

9、超滤:

是以压力为推动力，利用超滤膜不同孔径对液体中溶质进行分离的物理筛分过程。

应用:

1）蛋白、酶、DNA的浓缩；2）脱盐/纯化；3）梯度分离；4）清洗细胞、纯化病毒；5）除病毒、热源。

10、反渗透：

利用反渗透膜选择性的只能通过溶剂而截留离子物质性质，以膜两侧静压差为推动力，克服渗透压，使溶剂通过反渗透膜实现对液体混合物进行分离的过程。

11、反渗透中溶剂和溶质是如何透过膜的，在膜中的迁移方式如何？

答：

溶解扩散模型，优先吸附模型（溶解扩散模型适用于均匀的膜，能适合无机盐的反渗透过程，对有机物优先吸附－毛细孔流动模型比较优越。

）

12、溶解－扩散模型（无孔学说）：

膜是均匀的，无孔，水和溶质分两步通过膜：

第一步：

首先吸附溶解到膜材质表面上；第二步：

在膜中扩散传递（推动力为化学位梯度），扩散是控制步骤，服从Fick定律。

13、优先吸附-毛细孔流动模型（有孔学说）：

优先被吸附的组分在膜面上形成一层吸附层，吸附力弱的组分在膜上浓度急骤下降，在外压作用下，优先被吸附的组分通过膜毛细孔而透过膜。

与膜表面化学性质和孔结构等多种因素有关。

14、纳滤：

分离范围介于反渗透和超滤之间，能截留透过超滤膜的那部分有机小分子，透过无机盐和水。

15、纳滤膜的特点：

1）纳滤膜的截留率大于95%的最小分子约为１nm,故称之为纳滤膜；2）从结构上看纳滤膜大多是复合膜，即膜的表面分离层和它支撑层化学组成不同。

其表面分离层由聚电解质构成；3）能透过一价无机盐，渗透压远比反渗透低，故操作压力很低。

16、纳滤的应用：

①小分子量的有机物质的分离；②有机物与小分子无机物的分离；③溶液中一价盐类与二价或多价盐类的分离；④盐与其对应酸的分离。

17、浓差极化：

膜分离过程中，膜面浓度高于主体浓度的现象。

18、浓差极化-凝胶层模型：

①当发生浓差极化后，膜面上浓度Cw大于主体浓度Cb，溶质向主体反扩散；②当溶质向膜面的流动速度与反扩散速度达到平衡时，在膜面附近存在一个稳定的浓度梯度区，这一区域称为浓度极化边界层；③在边界层中取一微元薄层，对此微元薄层作物料衡算。

推导边界层形成后，通量与Cw及Cb的关系。

19、影响膜过滤的各种因素：

1.压力：

在超滤中压力升高引起膜面浓度升高，则透过膜的溶质也增大，因而截留率减小；2.浓度；3.温度，在超滤或微滤中，一般说来，温度升高都会导致通量增大，因为温度升高使粘度降低和扩散系数增大；4.流速,根据浓差极化-凝胶层模型,流速增大,可使通量增大；5.其它因素，在反渗透中特别要注意不要使溶解度小的溶质析出，膜过滤含胶体粒子，以免膜堵塞。

20、膜的污染：

是指处理物料中的微粒，胶体或溶质大分子与膜存在物理化学作用或机械作用而引起的在膜表面或膜孔内吸附，沉积造成膜孔径变小或堵塞，使膜产生透过流量与分离特性的不可逆变化现象。

大体可分为沉淀污染、吸附污染、生物污染。

21、防止膜污染的方法：

①进料液的预处理：

预过滤、pH及金属离子控制；②选择合适的膜材料：

减轻膜的吸附；③改善操作条件：

加大流速。

22、膜污染的清洗方法：

物理法：

海绵球擦洗、热水法、反冲洗和循环清洗；化学法：

（选择清洗剂要注意三点：

1.要尽量判别是何种物质引起污染；2.清洗剂要不致于对膜或装置有损害;3.要符合产品要求。

）

23、化学法常用的清洗剂有：

NaOH、酸、表面活性剂、氧化剂、酶、有机溶剂

24、膜污染的清洗方式:

利用膜的不对称性和膜组件的结构特点进行清洗。

第六章 溶剂萃取法

思考题：

1.将青霉素由水相萃取到丁酯相中，其pK=2.75，萃取条件：

pH=2.5，T=10℃，VF∶VS=1∶1，测得萃取前发酵液（水相）效价20000u/ml，平衡后废液效价645.2u/ml，求分配系数K和K0？

弱酸的表观分配系数：

K=K0/（1＋10pH－pK）。

弱酸的表观分配系数：

K=K0/（1＋10pK－pH）

2.为什么青霉素在酸性（pH≤2.5）条件下，而红霉素却要在碱性（pH≥9.8）条件下才能被萃取到丁酯中去呢？

答：

（1）根据表观分配系数公式可知，弱酸的表观分配系数：

K=K0/（1＋10pH－pK）弱酸的表观分配系数：

K=K0/（1＋10pK－pH）。

对于弱酸：

pH

pH>pK时，分配系数大。

（2）不同pH条件影响弱电解质电离，从而影响分子的极性，根据相似相溶原则，在弱极性的丁酯中极性小的分子溶解度比水中大

青霉素红霉素

酸碱性

pH

pH>pK

弱酸性（2.75）弱碱性（9.4）

游离分子“+”

“–”游离分子

根据相似相溶原则，在弱极性的丁酯中游离分子极性小，溶解度比水中大，故从水相转入丁酯相中，而发酵液中存在的其它杂质由于极性情况与抗生素不同，故很少进入丁酯中，这样就达到一定程度的纯化。

酸性物质：

pH>pK时，主要以负离子存在；pH

生化物质

杂质

萃取操作条件的控制

酸性

碱性（pK碱杂>pK生）

酸性（pK酸杂

酸性（pK酸杂>pK生）

萃取时杂质自然除去

pK酸杂

萃取时无法去除

反萃取pK酸杂>pH>pK生

碱性

酸性（pK酸杂

碱性（pK碱杂>pK生）

碱性（pK碱杂

萃取时杂质自然除去

pK碱杂>pH>pK生

萃取时无法去除

反萃取pK碱杂

1、弱电解质的表观分配系数K：

分配达平衡时，溶质在两相的总浓度之比。

2、带溶剂：

对于水溶性强的溶质，可利用脂溶性萃取剂与溶质间的化学反应生成脂溶性复合分子，使溶质向有机相转移。

3、乳化：

水或有机溶剂以微小液滴分散在有机相或水相中的现象。

这样形成的分散体系称乳浊液。

4、乳浊液的破坏措施：

物理法：

离心、加热，吸附，稀释；化学法：

加电解质、其他表面活性剂。

5、乳浊液稳定性和下列几个因素有关：

①界面上保护膜是否形成；②液滴是否带电；③介质的粘度：

表面活性剂分子在分散相液滴周围形成保护膜。

保护膜具有一定的机械强度，不易破裂，能防止液滴碰撞而引起聚沉。

介质粘度较大时能增强保护膜的机械强度。

6、影响物质分配的因素主要有：

①聚合物及其分子量的影响；②系线长度对分配平衡的影响；③体系中无机盐离子的影响；④体系pH的影响；⑤温度。

7、大规模操作一般在室温下进行,不需冷却。

原因：

a.成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用,常温下蛋白质不会发生变性;b.常温下溶液粘度低，容易相分离;c.常温操作节省冷却费用。

第八章双水相萃取

1、萃取:

又称液－液萃取,指当含有生化物质的溶液与互不相溶的第二相接触时,生化物质倾向于在两相之间进行分配,当条件选择得恰当时,所需提取的生化物质就会有选择性地发生转移,集中到一相中,而原来溶液中所混有的其它杂质分配在另一相中,这样就能达到某种程度的提纯和浓缩。

影响因素:

①影响萃取操作的因素：

pH、温度、盐析；②有机溶剂的选择；③带溶剂；④乳化与去乳化。

2、双水相萃取法：

又称双水相分配法，利用物质在不相溶的，两水相间分配系数的差异进行萃取的方法。

特点：

①保留产物活性。

②不存在相的分离。

③溶液分相不依赖有机溶剂。

④固液分离。

优点：

易于放大，分配系数K值重复性好，故可直接放大。

第九章  超临界流体萃取法

超临界流体萃取：

利用超临界流体的特殊性质，使其在超临界状态下，与待分离的物料接触，萃取出目的产物，然后通过降压或升温的方法，使萃取物得到分离。

第十章 电泳技术

1、电泳：

带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。

2、电泳技术的特点:

①凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离,并可进行定性或定量分析;②样品用量极少;③设备简单;④可在常温进行;⑤操作简便省时;⑥分辨率高。

3、影响电泳的外界因素:

①电场强度；②电泳介质的pH值；③缓冲液的离子强度；④电渗作用；⑤粒子的迁移率；⑥吸附作用。

4、迁移率：

是指载流子在单位电场作用下的平均漂移速度，即载流子在电场作用下运动速度的快慢的量度，运动得越快，迁移率越大；运动得慢，迁移率小。

溶液中带电粒子在电场（E）中向着与它相异电荷的电极移动。

5、电渗现象：

液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动的现象。

6、常用的电泳分析方法：

纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳、等速电泳、双向凝胶电泳（二维电泳）、免疫电泳。

7、试述聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质原理？

答:

具有分子筛和电泳的双重作用

（1）SDS-PAGE的原理:

蛋白质分子的聚散

SDS是一种阴离子去污剂,作为变性剂和助溶性试剂,能断裂分子内和分子间的氢键,是分子去折叠,破坏蛋白质分子的二级,三级结构;而强还原剂,如二硫苏糖醇,β-硫基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子量：

SDS：

阴离子去污剂，水溶液中一单体和分子团存在。

能破坏蛋白质分子之间及与其他分子间的非共价键，形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，使蛋白质丧失了原有电荷状态，形成仅保持原有分子大小为特征点负离子团。

具有分子筛和电泳的双重作用

第十一章 色层分离法

1、层析介质：

要求：

①不溶于流动相；②化学稳定；③机械强度；④大的表面积；⑤粒度均匀。

种类：

①无机（氧化铝，硅胶，活性碳）②有机（琼脂糖，纤维素，聚丙烯酰胺等）。

2、层析的分类：

⑴根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类：

①吸附层析法（离子交换色层分离法、疏水作用色层分离法、金属螯合色层分离法、共价作用色层分离法）；②分配层析法；③凝胶过滤法。

⑵根据实验技术的分类:

低压层析技术、中压层析技术、高压层析技术、电泳法

⑶根据固定相的形状不同的分类：

柱层析法、纸层析法、薄层层析法。

⑷根据流动相的物态不同的分类：

汽相层析法、液相层析法。

⑸操作方式不同的分类：

迎头法、顶替法、洗脱分析法。

3、层析剂种类：

氧化铝、硅胶、活性炭、琼脂糖、纤维素。

4、层析分离的基本原理：

层析分离是一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同的程度分布在两个相中

5、离子交换树脂的结构：

其结构由三部分组成：

1.不溶性的三维空间网状结构构成的树脂骨架，使树脂具有化学稳定性和机械强度；2.是与骨架相联的功能基团；3.是与功能基团带相反电荷的可移动的离子，称为活性离子，它在树脂骨架中的进进出出，就发生离子交换现象。

第十二吸附与离子交换法

1、阳离子交换树脂：

活性离子为阳离子称阳离子交换树脂，与阳离子发生交换

2、阴离子交换树脂：

活性离子为阴离子称阴离子交换树脂，与阴离子发生交换

3、离子交换操作步骤：

树脂的选择→树脂预处理→离子交换吸附→洗脱→再生。

4、离子交换吸附:

溶液中待交换离子与树脂上的活性离子发生交换反应的过程

使尽可能多的待交换离子吸附到树脂上，同时保证其选择性.

5、软化水:

将水中硬度去除或降低到一定程度的水，水在软化过程中，仅硬度降低而总含盐量不变。

脱盐水:

指水中盐类除去或降低到一定程度的水,含盐量小于1-5毫克/升。

纯水:

是指水中的强电解质和弱电解质去出或降低到一定程度的水含盐量小于1毫克/升。