第二章预处理技术邱玉华版.docx
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第二章预处理技术邱玉华版
第二章预处理技术
第一节概述
学习目标
掌握预处理的本质;熟悉生物材料的预处理过程
通常,生物物质的分离纯化是以含生物物质的溶液为出发点,进行一系列的提取和精制操作。
因此,生物物质分离纯化的第一个必需步骤就是从生物材料出发,设法使所制备的目标产物转移到溶液中,同时去除其他悬浮颗粒(如培养基残渣、菌体、细胞或絮凝体等)以及改善溶液的性状,以利于后续各步操作,该过程通常称处理。
生物材料的预处理过程一般有以下几个步骤
①动物组织和器官要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分,然后绞碎,选择适当的溶剂形成细胞悬液。
②植物组织和器官要先去壳、除脂,再粉碎,选择适当的溶剂形成细胞悬液。
③发酵液、细胞培养液、组织分泌液以及制成的细胞悬液等则根据目标产物所处位不同进行相应的处理。
动物细胞培养的产物大多分泌在细胞外培养液中。
微生物代谢产物大多分泌到细胞外,如大多数小分子代谢物、细菌产生的碱性蛋白酶、霉菌产生的糖化酶等。
分泌在细胞外的产物称为胞外产物。
但有些目的产物存在于细胞内部,如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素等,称为胞内产物。
自20世纪80年代以来,随着重组DNA技术的广泛应用,许多具有重大价值的生物产品应运而生,如胰岛素、干扰素、白细胞介素2等,它们的基因分别在宿主细胞(大肠杆菌或酵母细胞等)内克隆表达成为基因工程产品,其中许多基因工程产品都是胞内产物。
而植物细胞产物多为胞内物质。
对于胞外产物,一般可直接利用过滤或离心方法,将菌体或其他悬浮杂质分离除去。
但有些生物物质在发酵结束时部分会沉积或被吸附在菌体中,应采取措施尽可能使其转移到液相中,通常采用调节pH至酸性或碱性的方法来达到。
例如四环类抗生素,由于其能与钙、镁等离子形成不溶解的化合物,故大部分沉积在菌丝中,用草酸酸化后就能转入水相,再经固液分离除去细胞(菌体)。
对于胞内产物,则应首先通过离心等方法收集细胞或菌体,经细胞破碎使生物物质释放到液相中,再将细胞碎片分离除去。
第二节发酵液过滤特性的改变与相对纯化
学习目标熟悉发酵液过滤性的改变方法;掌握发酵液的相对纯化方法。
微生物发酵液的成分极为复杂,其中除了所培养的微生物菌体及残存的固体培养基外还有未被微生物完全利用的糖类、无机盐、蛋白质,以及微生物的各种代谢产物。
微生物发酵液的特性可归纳为:
①发酵产物浓度较低,悬浮液中大部分是水;②悬浮物颗粒小,相对密度与液相相差不大;③固体粒子可压缩性大;④液相黏度大,大多为非牛顿型流体;⑤性质不稳定,随时间变化,如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响;⑥成分复杂,杂质较多,这些特性使得发酵液的过滤与分离相当困难。
通过对发酵液进行适当的预处理,即可改善其流体性能,降低滤饼比阻,提高过滤与分离的速率。
发酵液中杂质很多,对后步分离影响最大的是高价无机离子(Ca2+、Mg2+、Fe3+)和杂蛋白等,在预处理时应尽量除去这些物质。
一、发酵液过滤特性的改变
有关改善发酵液过滤特性的物理化学方法有调酸(等电点)、热处理、电解质处理、添加表面活性物质、添加反应剂、冷冻—解冻及添加助滤剂等。
1.降低液体黏度
根据流体力学原理,滤液通过滤饼的速率与液体的黏度成反比,可见降低液体黏度可有效提高过滤速率。
降低液体黏度的常用方法有加水稀释法和加热法等。
采用加水稀释法虽能降低液体黏度,但会增加悬浮液的体积,加大后继过程的处理任务。
而且,单从过滤操作看,稀释后过滤速率提高的百分比必须大于加水比才能认为有效,即若加水1倍,则稀释后液体的黏度必须下降50%以上才能有效提高过滤速率。
2.调整pH
pH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质,适当调节pH可改善其过滤特性。
此法是发酵工业中发酵液预处理较常用的方法之一。
对于氨基酸、蛋白质等两性物质,在酸性条件下带正电荷,在碱性条件下带负电荷,而在某一pH值下,净电荷为零,称为等电点。
在等电点下,两性物质的溶解度最小,此即为等电点沉淀法的依据。
如在味精生产中利用等电点(pH3.22)沉淀法提取谷氨酸。
对于蛋白质,由于羧基的电离度比氨基大,故蛋白质的酸性性质通常强于碱性,因而大多数蛋白质的等电点都在酸性范围内(pH4.0~5.5)。
利用酸性来调节发酵液pH使之达到等电点,可除去蛋白质等酸性物质。
在膜液过滤中,发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附,通过调整pH改变易吸附分子的电荷性质,即可减少堵塞和污染。
此外,细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个pH下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒,有利于过滤的进行。
3.加入反应剂
有时,加入某些不影响目的产物的反应剂,可消除发酵液中某些杂质对过滤的影响,从而提高过滤速率。
加入反应剂可和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀,如CaSO4、AlPO4等。
生成的沉淀能防止菌丝体黏结,使菌丝具有块状结构,沉淀本身可作为助滤剂,并且能使胶状物和悬浮物凝固,从而改善过滤性能。
如在新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠,生成的磷酸钙沉淀可充当助滤剂,另一方面可使某些蛋白质凝固。
又如环丝氨酸发酵液用氧化钙和磷酸处理,生成磷酸钙沉淀,能使悬浮物凝固,多余的磷酸根离子还能除去钙离子、镁离子,并且在发酵液中不会引人其他阳离子,以免影响环丝氨酸的离子交换吸附。
正确选择反应剂和反应条件,能使过滤速率提高3~10倍。
如发酵液中含有不溶性多糖物质,则最好用酶将其转化单糖,以提高过滤速率。
例如万古酶素用淀粉作培养基,发酵液过滤前加入0.025%的淀粉酶,搅拌30min后,再加2.5%硅藻土助滤剂,可使过滤速率提高5倍。
4.加入助率剂
助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒,它能使滤饼疏松,滤速增大。
这是因为充当过滤介质的助滤剂表面具有吸附胶体的能力,并且由此助滤剂颗粒形成的滤饼具有格子型结构,不可压缩,滤孔不会被全部堵塞,可能保持良好的渗透性,既能使悬浮液中细小颗粒状胶态物质截留在格子骨架上,又能使清液有流畅的通道。
所以使用惰性助滤剂能大大提高过滤能力和生产效率,改善滤液澄清度,降低过滤成本。
常用的助滤剂有硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、炭粒、淀粉等、其中最常用的是硅藻土。
助滤剂的使用方法有两种:
一种是在过滤介质表面预涂助滤剂,另一种是直接加入发酵液,也可两种方法同时兼用。
采用第一种方法,在一个旋转真空过滤机的转鼓上,预涂上助滤剂,就可以对非常细小或可压缩的低固含量(≤5%)悬浮液进行过滤。
在改进的旋转真空过滤机上,采用一把缓慢向鼓面移动的刮刀,在操作时,将滤饼连同一层助滤剂一起刮去,使过滤表面不断更新,以维持正常的过滤速度,直到助滤剂被全部移走后,再重新涂层。
采用第二种方法,则多数是将助滤剂与压滤机结合起来使用,对于菌体较细小、黏度较大的发酵液,可加放助滤剂后进行压滤,或者先将含助滤剂的悬浮液通过压滤机,形成过滤介质,然后对混有助滤剂的料液进行过滤,这样可提高滤饼的渗透性。
对于后一种方法,使用时要有一个带搅拌器的混合槽,充分搅拌混合均匀,防止分层沉淀。
助滤剂的微粒大小、粒度分布及添加量对过滤速度影响很大。
应针对不同的发酵液和过滤要求,通过过滤实验,优选最佳的助滤剂。
一般在助滤剂用量等于进料中固体含量时,滤速最快。
但是,使用助滤剂对发酵液预处理的方法也不足之处,因为粒度微细的助滤剂会降低滤液澄清度,另外某些抗生素还会与硅藻土产生不可逆的结合。
二、发酵液的应对纯化
发酵液中杂质很多,其中有些杂质不仅直接影响产品质量和收率,同时对后继提取和精制有很大影响。
如高价无机离子的存在,在采用离子交换法提取时,会影响树脂对生化物质的交换容量。
可溶性蛋白质的存在,不仅在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力,而且在使用有机溶剂法或双水相萃取时,易产生乳化现象,使两相分离不清。
此外,在常规过滤或膜过滤时,易使过滤介质堵塞或受污染,影响过滤速率。
因此,在预处理时,必须采用适当的方法使这些杂质沉淀,在固-液分离除去,以利于以后提取与精制过程的顺利进行。
1.高价无机离子的去除
发酵液中主要的无机离子有Ca2+、Mg2+和Fe3+等。
Ca2+的去除通常使用草酸。
但草酸溶解度较小,故用量大时,可用其溶性盐(如草酸钠)。
反应生成的草酸钙还能促进蛋白质凝固,改善发酵液的过滤性能。
但草酸价格较贵,应注意回收。
如四环类抗生素废液中,加入硫酸铅,在60℃下反应生成草酸铅。
后者在90~95℃下用硫酸分解,经过滤,冷却,结晶后可以回收草酸。
草酸镁的溶解度较大,虽然发酵液中Mg2+的浓度一般不是很高,到加入草酸不能除尽Mg2+。
要除去Mg2+,可以加入三聚磷酸钠(Na5P3O10),它和Mg2+形成可溶性络合物。
Na5P3O10+Mg2+→MgNa3P3O10+2Na+
用磷酸盐处理,也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。
要除去Fe3+,可加入黄血盐,使形成普鲁士蓝沉淀。
4Fe3++3K4Fe(CN)6→Fe4[Fe(CN)6]3↓+12K+
2.杂蛋白的去除
在发酵液中除了上述高价无机离子外,还存在有可溶性蛋白质。
发酵液的预处理,从根本上说,是如何使可溶性蛋白质充分变性沉淀,以便随固形物一同除去。
改善发酵液过滤特性的方法中,其中许多可在改善过滤特性的同时除去杂蛋白。
下面介绍几种常用的方法。
(1)沉淀法蛋白质是两性物质,在酸性溶液中,能与一些阴离子如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等的酸根离子形成沉淀;在碱性溶液中,能和一些阳离子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。
(2)变性法蛋白质从有规则的排列转变成不规则结构的过程称为变性。
变性蛋白质的溶解度较小。
使蛋白质变性的方法很多,其中最常用的是加热法。
加热不仅使蛋白质变性,同时降低液体黏度,提高过滤速率。
例如,将柠檬酸发酵液加热至80℃C以上,使蛋白质变性凝固和降低发酵液黏度,即可大大提高过滤速率。
使蛋白质变性的其他方法有大幅度调节PH以及加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。
如在抗生素生产中,常将发酵液pH调至偏酸性范围(pH2~3)或较碱性范围(pH8~9)使蛋白质凝固,一般以酸性条件下除去的蛋白质较多。
变性法存在一定的局限性,如热处理通常对原液质量有影响,特别是会使色素增多,该法只适用于对热较稳定的生化物质,否则容易使其破坏,同时对某些生化物质效果也并不是很理想;极端pH也会导致某些目的产物失活,并且要消耗大量酸碱;而加有机溶剂成本高,通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。
(3)吸附法加人某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白而将其除去。
例如在四环类抗生素中,采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾(K2Zn3[Fe(CN)6]2)的胶状沉淀来吸附蛋白质,利用此法除去蛋白质已取得很好的效果。
在枯草芽孢杆菌发酵液中加入氯化中,钙和磷酸氢二钠,两者生成庞大的凝胶,把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去,从而可加快过滤速率。
第三节凝聚和絮凝技术
学习目标:
熟悉凝聚的原理;掌握絮凝的基本原理和影响因素;掌握絮凝剂的选择方法。
使用凝聚和絮凝技术能有效地改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态,使其凝集起来,从而增大体积,以便于固液分离,常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理中。
过去常常混淆凝聚与絮凝的概念,现在趋于明确区分开来。
凝聚是指在电解质作用下,由于胶粒之间双电层电排斥作用降低,电位下降,而使胶体体系不稳定的现象。
絮凝则是指在某些高分子絮凝剂存在下,基于桥架作用,使胶粒形成较大絮凝团的过程。
一、凝聚
发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的表面一般带有电荷,带电的原因很多,主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。
通常发酵液中细胞或菌体带有负电荷,由于静电引力的作用使溶液中带有相反电荷的粒子(即正离子),被吸附在其周围,在其界面上形成了双电子层,如图2—1所示,这种双电层的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。
双电层的电位越高,电排斥的作用越强,胶体粒子的分散程度也就越大,发酵液过滤就越困难。
凝聚作用就是向胶体悬浮液中加入某种电解质,在电解质中异电离子作用下,胶粒的双电层电位降低使胶体体系不稳定,胶体粒子间因相互碰撞而产生凝集的现象。
电解质的凝聚能力可用凝聚值来表示,使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度(mmol/L)称为凝聚值。
根据,Schuze-Hardy法则,反离子的价数越高,该值就越小,即凝聚能力越强。
阳离子对带负电荷的发酵液胶体粒子凝聚能力的次序为Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+。
常用的凝聚电解质有硫酸铝[Al2(SO4)3·18H2O(明矾)、氯化铝(AlCl3·6H2O)、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、氯化铁(FeCl3·6H2O)、ZnSO4、石灰等。
二、絮凝
采用凝聚方法得到的凝聚体,其颗粒常常是比较细小的,有时还不能有效地进行分离而采用高分子物质的絮凝法常可形成粗大的絮凝体,使发酵液较易分离。
使用絮凝技术预处理发酵液的优点不仅在于提高固-液分离速度,分离菌体、细胞和细胞碎片等,还在于能有效去除杂蛋白和固体杂质,提高滤液质量。
1.絮凝剂及絮凝作用。
絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物,其相对分子质量可高达数万至一千万以上,它们具有长链状结构,其链接上还有许多活性官能团,可以带有多价电荷(如阴离子或阳离子),也可以不带电性(如非离子型)。
它们通过静电引力、范德华力或氢键的作用,强烈地吸附在胶粒的表面。
当一个高分子聚合物的许多链接分别吸附在不同的胶体表面上产生架桥连接时,就形成了较大的絮团,这就是絮凝作用。
如果胶粒相互间的排斥电位不太高,只要高分子聚合物的链节足够长,跨越的距离超过颗粒间的有效排斥距离,也能把多个胶粒拉在一起,导致架桥絮凝。
高分子絮凝剂的吸附架桥作用如图2-2所示。
2对絮凝剂化学结构的一般要求
对絮凝剂的化学结构一般有两方面的要求,一方面要求其分子必须含有相当多的活性官能团,使之能和胶粒表面相结合;另一方面要求其必须具有长链的线性结构,以便同时与多个胶粒吸附形成较大的絮团,但相对分子质量不能超过一定限度,以使其具有良好的溶解性。
3絮凝剂的分类及常用絮凝剂。
根据絮凝剂活性基团在水中解离情况的不同,絮凝剂可分为非离子型、阴离子型和阳离子型三类。
根据其来源的不同,工业上使用絮凝剂又可分为如下三类:
①有机高分子聚合物,如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物。
②无机高分子聚合物,聚合铝盐、聚合铁盐等。
③天然有机高分子絮凝剂,如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、几丁质、脱乙酰几丁质等。
目前最长用的絮凝剂是人工合成的高分子聚合物,例如有机合成的聚丙烯酰胺类和聚乙烯亚胺衍生物。
由于有机合成的聚丙烯酰胺类絮凝剂具有用量少(一般为10-6数量级)、絮凝体粗大,分离效果好、絮凝速度快以及种类多等优点,所以适用范围广。
它们的主要缺点是有一定的毒性,特别是阳离子型聚丙烯酰胺,一般不宜用于食品以及医药工业。
近年来发展的聚丙烯酸类阴离子絮凝剂无毒,可用于食品和医药工业。
微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂,它是一种由微生物产生的具有絮凝细胞功能的物质,主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素及核酸等高分子物质。
微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合成的絮凝剂相比,最大的优点是安全、无毒和不污染环境,因此发展很快。
4影响训练效果的因素。
影响絮凝的因素很多,絮凝效果与发酵液的性状有关,如细胞浓度、表面电荷的种类和大小等,故对于不同特性的发酵液应选择不同种类的絮凝剂。
对于一定的发酵液,絮凝效果还与絮凝剂的用量、相对分子质量和类型、溶液的ph、搅拌速度和时间等因素有关。
同时,在絮凝过程中,常需加入一定的助凝剂以增加絮凝效果。
(1)絮凝剂的浓度料液中的絮凝剂浓度增加有助于架桥充分,但过多的加量反而会引起吸附饱和,在每个胶粒上形成覆盖层而使胶粒产生再次稳定现象。
如在α-淀粉酶发酵液的絮凝试验中,絮凝剂加量对絮凝效果(滤速)的影响。
如图2-3所示。
适宜的加量通常由实验得出。
(2)溶液pH溶液pH的变化常会影响离子型絮凝剂中功能团的电离度,从而影响分子链的伸展状态。
电离度增大,由于链节上相邻离子基团间的静电排斥作用,而使分子链从卷曲状态变为伸展状态,所以架桥能力提高。
例如,采用碱式氯化铝和阴离子聚丙烯酰胺搭配使用的混凝方法处理2709碱性蛋白酶发酵液,发酵液pH是对阴离子聚丙烯酰胺絮凝效果的影响如图2-4所示。
由图可见,pH适当提高能增大过滤的速度,这是因为聚丙烯酰胺分子链上的羧解离程度提高,而使其达到较大的伸展程度,发挥了最佳的架桥能力。
(3)絮凝剂的相对分子质量虽然高分子絮凝剂分子量提高、链增长,可使架桥效果明显,但分子量不能超过一定的限度,因为随分子量提高,高分子絮凝剂的水溶性降低,因此,分子量的选择应适当。
④搅拌速度和时间搅拌速度和时间在絮凝过程中也是十分重要的,加入絮凝剂的初期应高转速,使絮凝剂快速均匀分散到料液中,不形成局部过浓,但接着应低速搅拌,有利于絮凝剂长大成团;如仍高速搅拌易将絮凝团打碎,影响絮凝效果,所以应采用变速搅拌。
5.絮凝技术发展的新动向
三、混凝
对于带负电性的菌体或蛋白质来说,采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附架桥的双重机理,所以可以单独使用。
对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂,则主要通过分子间引力和氢键作用产生吸附架桥,所以它们经常与无机电解质凝聚剂搭配使用。
首先加入电解质,使悬浮粒子间的双层电位降低、脱稳,凝聚成微粒,然后再加入絮凝剂絮凝成较大颗粒。
无机电解质的凝聚作用为高分子絮凝剂的架桥创作了良好的条件
,从而大大提高了絮凝的效果。
这种包括凝聚和絮凝机理的过程,称为混凝。
第四节细胞破碎技术
学习目标
了解细胞壁的结构特点;
掌握细胞破碎的方法;
熟悉细胞破碎仪器的使用特性。
为了提取细胞内的蛋白质、酶、多肽和核酸等生物物质,首先必须收集细胞或菌体进行细胞破碎。
细胞破碎就是采用物理、化学、酶或机械的方法,在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜,设法使胞内产物最大程度地释放到液相中。
破碎后的细胞浆液经固液分离除去细胞碎片后,再采用不同的技术手段进一步分离纯化。
微生物的细胞和植物细胞外层均为细胞壁细胞壁里面的细胞膜和它所包围的细胞浆和称原生质体。
而动物细胞没有细胞壁仅有细胞膜通常细胞壁较坚韧细胞膜较脆弱易受渗透压冲击而破碎因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。
因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。
因为细胞壁是具有一定刚性的坚韧物质。
起到保护细胞的作用。
当细胞与周围环境交换营养物质或代谢产物时。
细胞壁起了调节的作用。
此外,细胞壁还具有抗机械撞击作用的功能。
如帮助细胞抵抗来自发酵液混合的剪切应力静压力或渗透压力等。
所以是难以破碎的。
因此对细胞壁的物理化学结构做详细的了解对方这方法的研究和应用非常必要。
一、细胞壁的结构及特点
细胞壁的化学组成是非常复杂的,它不仅取决于所研究的生物类型还取决于细胞的年龄和生长生理学。
1.微生物细胞壁的化学组成和结构
(1)细菌的细胞壁几乎所有细菌的细胞壁都是由坚固的肽聚糖组成,它是一个难溶于水的大分子复合体,由多糖链借短肽交联而成,具有网状结构,包围在细胞周围,使细胞具有一定的形状和强度。
细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构,其网状结构的致密程度和强度取决于多糖链上所存在的肽键数量和其交联的程度。
交联程度越大,网状结构就越致密。
破碎的难度就越大。
革兰阳性细菌的细胞壁与革兰阴性细菌有很大不同(图2-5)。
革兰阳性细菌的细胞壁较厚,只有一层(20~80nm),主要由肽聚糖构成,占细胞壁成分的40%~90%,其余是多糖和胞壁酸。
其肽聚糖结构为多层网状结构,其中75%的肽聚糖亚单位相互交联,网格致密坚固。
革兰阴性细菌的细胞壁包括内壁层和外壁层,内壁层较薄(2~3nm),由肽聚糖组成,占细胞壁成分的10%左右;外壁层较厚(8~10nm),主要由脂蛋白和脂多糖组成。
革兰阴性细菌细胞壁的肽聚糖为单层网状结构,它们只有30%的肽聚糖亚单位彼此交联,故其网状结构不及革兰阳性细菌的坚固,显得比较疏松。
(2)酵母菌的细胞壁酵母菌的细胞壁与细菌不同,酵母细胞壁由特殊的酵母纤维素构成,它的主要成分为葡聚糖(30%~34%)、甘露聚糖(30%)、蛋白质(6%~8%)等,比革兰阳性菌稍厚,但不及格兰阳性细菌细胞壁坚韧。
细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成,它构成了细胞壁的刚性骨架,使细胞具有一定的形状;覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白;最外层是甘露聚糖,由1,6-磷酸二酯键共价连接,形成网状结构,在该层的内部,有甘露聚糖-酶的复合物,它可以共价连接到网状结构上,也可以不连接。
与细菌细胞壁一样,破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。
(3)真菌的细胞壁真菌的细胞壁较,厚约100~250nm主要由多糖组成(80%~97%),其次还含有较少量的蛋白质和脂类。
不同的真菌,其细胞壁的组成有很大的不同,其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成。
几丁质是由数百个N-乙酰葡聚糖胺分子以β-1,4-葡萄糖苷键连接而成的多聚糖。
它与纤维素结构很相似,只是每个葡萄糖上的第二个碳原子和乙酰氨基相连,而在纤维素结构中是与羟基相连。
少数低等水生真菌的细胞壁由纤维素构成。
与酵母和细菌的细胞壁一样,真菌细胞壁的强度和聚合物网状结构有关。
不仅如此,它还含有几丁质和纤维素的纤维状结构,所以强度有所提高。
2.植物细胞壁
对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁两部分。
初生壁与次生壁的区别主要不在于其化学成分,而是在出生地形成后,细胞仍可以继续增大,而不增加初生壁的厚度。
次生壁是在初生壁上曾厚的部分,次生壁生成时,细胞不再增大。
初生壁与次生壁的主要化学成分均为纤维素,纤维素系分子是由1000~10000个β-葡萄糖分子酶促装配成的长链。
纤维素分子又可进一步组装成微纤丝,微纤丝在交织成网状,就构成细胞壁的基本骨架。
有时,微纤丝又可聚集成粗约0.5μm的大纤丝,散布在微纤丝构成的网架中。
此外网眼中的空隙常为溶于水的果胶质、木质素和角质等所填充,从而使整个细胞壁既具有刚性又具有弹性。
初生壁一般为1~3μm厚,富有弹性,由多糖和蛋白质构成,多糖主要成分为纤维素、半纤维素和果胶类物质。
次生壁一般为4μm厚,常由三层组成。
在次生壁中,纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多,纤维素的纤丝排列的更紧密和有规则,而且存在木质素(酚类组分的聚合物)的沉积。
因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性,使植物细胞具有很高的机械强度。
3.细胞壁的结构与细胞的破碎
微生物细胞壁的形状和强度取决于构成细胞壁的聚合物以及它们相互交联或与其他壁组分交联的强度。
各种微生物细胞壁的结构和组成差异很大,由遗传信息、生长环境和菌龄等因素决定。
如真菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构,所以强度有所提高。
破碎细胞壁的主要阻力是网状结构的共价键。
在机械破碎中,细胞的大小和形状以及细胞壁的厚度和聚合物的交联程度是影响破碎难易程度的重要因素。
细胞个体小、呈球形、壁厚、聚合物交联程度高是最难破碎的。
虽然通过改变遗传密码或者培养的环境因素可以改变细胞壁的结构,但到目前为止还没有足够的数据表明利用这些方法可以提高机械破碎的破碎率。
在使用酶法和化学法溶解细胞时,细胞壁的组成最重要,其次是细胞壁的结构。
了解细胞壁的组成和结构,可有助于选择合适的溶菌酶和化学试剂,以及在使用多种酶或化学试剂相结合时确定其使用的顺序。
二、细胞破碎效果的检查
细胞的破碎效果可以用破碎率来表示。
破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比,可采用以下几种测定方法。
1.直接测定法
利用适当的方法检测破碎前后的细胞数量即可直接计算其破碎率。
对于破碎前的细胞,可利用显微镜或电子微粒计数器直接计数。
破碎过程中所释放出的物质如DNA和其它聚合物组分会干扰计数,可采用染色法把破碎的细胞与未受损害的细胞完整区分开来
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