精品黄曲霉素M1试剂盒说明书1.docx
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精品黄曲霉素M1试剂盒说明书1
黄曲霉素M1ELISA检测试剂盒
1、概述
黄曲霉素是霉菌的产物,高毒性并致癌。
黄曲霉素M1不是微生物而是在动物体中由黄曲霉素B1转化形成的。
当奶牛食用有黄曲霉素B1污染的饲料后,通过消化和分泌,黄曲霉素就会转化为羟基化的黄曲霉素M1,绝大部分分泌到乳汁中。
因此,黄曲霉素M1浓度反映了饲料中黄曲霉素B1的含量。
欧盟对奶中的黄曲霉素M1限量是0.05ppb(50ppt)。
用竞争酶联免疫分析法检测生物样本中的黄曲霉素M1。
所有酶联免疫分析的试剂包括标准品都由试剂盒提供。
检测数量:
96孔(含标准品孔)
检测时间:
20分钟
2、原理
分析在包被有黄曲霉素M1抗体的聚苯乙烯微孔中进行。
黄曲霉素M1标准溶液和样品加入微孔,在温浴过程中,游离的黄曲霉素M1分子与抗体结合,没有结合的物质在清洗步骤中被清洗,第二次温浴时已经加入HRP-黄曲霉素M1酶标物,它将没有结合的抗体位点全部覆盖。
通过加入基底物质可以确定酶活性,第三次温浴时酶将无色的显色剂转变成一种蓝色,加入终止液使蓝色变成黄色,用酶标仪在450nm测定吸光度,通过颜色深浅不同换算成黄曲霉素M1的浓度值。
3、应用范围
黄曲霉素M1ELISA试剂盒用于定量检测牛奶和奶酪中的黄曲霉素M1。
4、提供的试剂
1、微孔板:
96孔(12×8,可拆卸)
2、酶标物:
冻干粉一瓶
3、酶标物稀释液:
13ml一瓶
4、样品稀释液:
一瓶(使用时加入40mL双蒸水充分溶解后使用)
5、清洗液(10×):
50ml一瓶
6、显色剂:
13ml一瓶
7、终止液:
13ml一瓶
5、8、黄曲霉素M1标准品溶液:
6×1ml/瓶(0ng/mL,0.005ng/mL,0.03ng/mL,0.15ng/mL,0.5ng/mL,2ng/mL)
6、
7、试剂盒未提供的材料
1、10-1000ul不同规格的微量移液器
2、50-300ul多道移液器
3、酶标仪(有450nm滤光片)
4、离心机(如果离心速度低最好使用低温离心机)
5、带盖试管
6、涡旋振荡器
7、正己烷
8、二氯甲烷
9、离心管
10、去离子蒸馏水
8、试剂贮存
1、试剂盒贮存在2~8℃,切勿冰冻
2、未用完的微孔板反应该密封干燥2~8℃保存
9、注意事项
1、终止液具有刺激性,显色剂具有毒性,切勿接触皮肤
2、试剂盒过期后不得使用
3、请勿混用不同批号的试剂
10、工作溶液准备
1、酶标物工作液:
使用时精确加入12mL酶标物溶解液充分溶解,使用前恢复至室温,并且摇匀,切勿涡旋振荡。
2、样品稀释液工作液:
使用时加入40ml双蒸水充分溶解后使用。
3、清洗液:
用蒸馏水1:
10稀释(1+9)。
注意:
如有结晶请在室温下摇动彻底溶解
4、显色剂:
已备用,请避免光线直照
5、终止液:
已备用
6、黄曲霉毒素M1标准品:
已备用
9、样品处理
一、牛奶
1、样品冷藏,2~8℃下3000g离心10分钟
2、分离奶脂和奶清
3、奶清直接检测(稀释倍数:
1倍)
二、奶粉
1、称取奶粉1g加10ml蒸馏水
2、振荡使奶粉彻底溶化后取50ul用于检测
3、稀释倍数:
10
三、奶酪
1、不要另加液体捣碎样本
2、称取2g碎奶酪放入带盖试管
3、加入15ml二氯甲烷振摇抽提30分钟
4、过滤上清液
5、转移3.75ml抽提液到另一试管,60℃下氮气吹干
6、用750ul样品稀释液重新溶解并涡旋混匀1分钟
7、加入750ul正己烷,涡旋抽提1分钟
8、2000g离心15分钟
9、移去上层正己烷
10、取50ul甲醇/acqueous相,用200ul样品稀释液在小试管中稀释后混匀取50ul用于检测
稀释倍数:
2
10、检测步骤
一、实验须知
1、使用前用2小时左右时间让试剂恢复到室温
2、用后立即将试剂放回2~8℃
3、不要改变分析步骤,尤其:
-微孔板在20~25℃下恢复到室温
-务必使用精确的微量进样器和枪头
-一旦开始就不要中断所有步骤
-ELISA结果的可重复性极大程度的取决于洗板操作,请严格按照要求操作
4、为避免交叉污染,每个标准品和样品均应使用不同的枪头加样
5、加样时请勿让枪头接触微孔中的溶液或内表面
二、分析步骤
1、做好记录,标记B0,标准和样本的位置,请确保重复双孔检测
2、从反应板上取出所需要的数量微孔,将多余的重新放回2~8℃保存
3、将酶标物(冻干粉)、清洗液(10X)配制成工作液
-在B0孔中加入50μL已稀释的样品稀释液
-在各标准孔中加入50μL的标准品溶液
-在各样品孔中加入50μL样品溶液
4、所有微孔加100ul酶标物工作液(强烈要求使用多道移液器)
5、轻轻晃动反应板几秒钟
6、室温(20-25℃)温浴10分钟,温浴期间振荡混匀3-4次
三、清洗步骤
-倾倒微孔中的液体
-在所有微孔中加满洗涤液(250~300μL)
-重复上述两步骤3遍以上
-在吸水纸上拍打,彻底清除微孔中的残留液和气泡(拍打后未被清除的气泡可用吸耳球吹去)
拍干后立即进行下一步骤,切勿让微孔干燥
四、显色步骤
1、用多通道微量移液器在所有微孔中加入100ul显色剂(强烈推荐使用多道移液器),振摇混匀几秒钟,使之彻底混匀。
2、室温显色10分钟
3、加入100ul终止液(强烈推荐使用多道移液器),混匀。
4、450nm测定吸光度。
10分钟内读取结果最佳,30分钟内有效
11、结果计算
根据下列公式进行结合率的计算
标准(或样品)的吸光度B
零标准的吸光度B0
然后根据结合率在标准曲线上获得相应的浓度值。
12、特异性
物质
交叉反应
黄曲霉素M1
100%
黄曲霉素M2
3%
黄曲霉素B1
2.8%
黄曲霉素B2
<0.1%
黄曲霉素G1
<0.1%
黄曲霉素G2
<0.1%
13、试剂盒参数
本试剂盒灵敏度IC50值:
0.03~0.06ng/ml。
B0吸光度最佳值应大于0.8。
试剂盒吸光度板内误差小于7%,板间误差小于10%。
不同奶样最低检测限:
0.08ug/kg
奶羊回收率大于80%
14、标准曲线模式
试剂盒提供的标准线范围为0.005-2ppb
15、结果评价
结果出来以后应该对实验进行校正,校正方法是通过对比试验数据和试剂盒参数来进行的,如果各项参数超出范围,建议对试剂盒有效期,波长范围和操作步骤进行核查,如果都没有差错,请联系我们的技术人员。
注意:
本方法属于初筛方法,样本阳性(根据欧盟法律浓度高于50ppt)确定方法必须是LC/MS/MS或者GC/MS。
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