唐玉秋3稿刘.docx
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唐玉秋3稿刘
渤海大学
毕业论文(设计)
题目扁杏仁水解蛋白的喷雾干燥及其抗氧化活性
完成人姓名唐玉秋
主修专业食品科学与工程
所在院(系)化学化工与食品安全学院
入学年度2008年
完成日期2012年月日
指导教师刘贺
任务书
姓名
唐玉秋
专业
食品科学与工程
入学年度
2008年
题目
扁杏仁水解蛋白的喷雾干燥及其抗氧化活性
主要内容:
(1)水酶法提取扁杏仁蛋白水解液;
(2)不同条件的喷雾干燥实验;
(3)还原力的测定;
(4)清除羟自由基能力测定;
(5)螯合亚铁离子能力测定;
进度:
2011.05.30选定论文题目
2011.05.31—2011.06.02查阅并阅读论文相关资料与准备阶段
2011.06.02—2011.06.30做预实验并确定实验方案进行实验阶段
2013.03.28—2012.04.14主要进行毕业论文的数据整理与撰写,并完成一稿论文
2012.04.14—2012.04.24进行相关修改完成毕业论文二稿
2012.04.25—2013.完成论文三稿
下达任务时间:
指导教师签字:
院长(主任)签字:
论文
上交时间
指导教师评阅意见
一稿
2012.04.14
1、格式要严格按照学院要求进行修改,调整。
2、文中还有错别字,要注意认真检查修改。
3、摘要过于简单,补充一些实验结果。
4、引言部分重新组织,有重复的地方。
5、其他意见详见原文修订部分。
二稿
2012.04.24
各部分的缩进要相同,引言目录应该从第一页开始,表格内部的格式应该居中,表格不要出现跨页现象,参考文献应该标注页码,文字方面还要下功夫处理。
三稿
2012.
指导教师签字:
年月日
指导教师评阅成绩:
指导教师签字:
答辩委员会意见:
主任签字:
年月日
答辩委员会评定成绩:
主任签字:
年月日
答辩委员会对学位授予的建议:
扁杏仁水解蛋白的喷雾干燥及其抗氧化活性
唐玉秋
(渤海大学化学化工与食品安全学院食品科学与工程2008级)
指导教师:
刘贺
摘要:
生物体内的许多具有抗氧化活性的物质属于蛋白质类,而且蛋白质具有优良的乳化型特性,能够在油水界面起到介导作用,对于清除生物体内过量自由基,抑制膜脂质过氧化具有重要意义,扁杏仁蛋白氨基酸组成与谷物氨基酸组成形成互补,是一种良好的蛋白质营养强化剂。
鉴于考虑到高温压榨提取植物油脂会破坏蛋白功能特性,而溶剂萃取油脂具有溶剂残留的潜在风险,需要采用水酶法进行植物油脂的提取。
本论文通过响应面设计方法探讨了喷雾干燥工艺参数对扁杏仁水解蛋白溶液干燥效果及水解蛋白粉抗氧化活性的影响,利用水酶法提取杏仁蛋白水解液,改变其缩水比例、进风温度、进料速度进行喷雾干燥,计算各种条件下的回收率,通过测得的还原力、清除羟自由基能力、螯合亚铁离子能力等了解喷雾干燥对其抗氧化活性的影响,获得了表征相关指标的数学模型,在实践过程中可以对相关指标进行预测。
结果是采用哪一种优化过的工艺参数,取决于对产品指标的要求,但总体而言,脱水比例在0.5~0.6之间,进风温度在200℃左右,进料速度在270~320mL/h,可以获得较好的综合效果。
本论文为开发具有抗氧化活性的保健产品提供依据,为扁杏仁水解蛋白的后续分级纯化及深入研究其活性机理奠定基础。
关键词:
扁杏仁;水解蛋白;喷雾干燥;抗氧化活性
英文摘要?
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目录
0引言1
1试验材料与设备3
1.1试验材料与试剂3
1.2试验设备4
1.3其它试验装置与用具4
2试验方法4
2.1蛋白水解液的提取4
2.2喷雾干燥工艺流程5
2.3还原力的测定6
2.4清除羟自由基能力测定6
2.5螯合亚铁离子能力测定6
3结果与分析6
3.1产品回收率10
3.2还原力分析11
3.3羟自由基清除率17
3.4Fe2+螯合能力18
4结论与展望19
参考文献19
致谢21
0引言
大扁杏又称甜杏(Prunussibiricavar.suavosperma),属蔷薇科杏属,是龙王帽、一窝蜂、白玉扁、北山大扁等品种的总称,是我国特有的经济树种[1]。
近年来,仁用杏在我国的栽培面积得到迅速扩大[2]。
扁杏仁中富含高品质油脂,油脂中不饱和脂肪酸含量达到95%以上。
近年来,考虑到高温压榨提取植物油脂会破坏蛋白功能特性,而溶剂萃取油脂具有溶剂残留的潜在风险,不少学者尝试采用水酶法进行植物油脂的提取,如菜籽油的水酶法提取,大米胚芽油的提取[5],以及花生油的水酶法提取[6]等。
除了油脂以外,扁杏仁所含蛋白质比例最高,扁杏仁蛋白氨基酸组成与谷物氨基酸组成形成互补,是一种良好的蛋白质营养强化剂,清蛋白和球蛋白是杏仁蛋白的主要蛋白成分,含量分别为45.76%和40.32%,谷蛋白含量较少,几乎不含醇溶蛋白。
杏仁分离蛋白粘度低于大豆分离蛋白,发泡能力与大豆分离蛋白相当,吸油性比大豆蛋白强,乳化能力显著高于大豆分离蛋白,体外试验表明杏仁分离蛋白容易被胃蛋白酶水解[8]。
水酶法在提取油脂的同时,酶将蛋白水解,水解蛋白具有区别于原蛋白的功能特性如乳化性、起泡性等物理性质,更重要的是水解蛋白有可能具有抗氧化及降血压等生理活性[9]。
张君慧研究了不同水解度大米蛋白酶解物对抗氧化活性的影响,表明一定水解度的大米蛋白酶解物具有还原能力、清除羟自由基及氧自由基的能力。
为了方便贮藏及流通,需要对水解溶液进行干燥,干燥方法很多,其中喷雾干燥是一种较理想的技术,喷雾干燥是利用雾化器将料液分散为细小的雾滴,并在热干燥介质中迅速蒸发溶剂形成干粉产品的过程,一般喷雾干燥包括四个阶段:
(1)料液雾化;
(2)雾群与热干燥介质接触混合;(3)雾滴的蒸发干燥;(4)干燥产品与干燥介质分离。
料液的形式可以是溶液、悬浮液、乳浊液等泵可以输送的液体形式,干燥的产品可以是粉状、颗粒状或经过团聚的。
喷雾干燥技术的应用已有100多年的历史,但在我国发展起步较晚。
自1865年喷雾干燥最早用于蛋品处理以来,这种由液态经雾化和干燥在极短时间直接变成为固体粉末的过程,在20世纪取得了长足的进展。
它使许多有价值但不易保存的物料得以大大延长保质期,使一些物料便于包装、贮存和运输。
同时,简化了一些物料的加工工艺[21]。
在水解蛋白的干燥研究方面,Trindade等人以大豆分离蛋白及明胶包埋酪蛋白酶解物,通过喷雾干燥工艺制备水解蛋白粉,一方面优化了干燥效率,同时显著地降低了水解蛋白的苦味[11]。
在自由基生物学中的抗氧化剂常指化学与生物化学上具有抗氧化作用的一类化合物。
包括内源性抗氧化剂和外源性抗氧化剂两大类。
其中内源性抗氧化酶类为超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶及与这些酶作用有关的其它酶,如谷胱甘肽转硫酶、谷胱甘肽还原酶等。
这些酶的协同作用有效的清除氧自由基及其衍生的活性产物。
内源性非酶抗氧化剂是指生物体内部产生的具有抗氧化功效的一类物质,包括金属硫蛋白、铜蓝蛋白、硒蛋白、谷胱甘肽、新抗氧蛋白、胆红素、白蛋白及尿酸等。
内源性非酶抗氧化剂和内源性酶类抗氧化系统协同作用共同维护生物体内自由基的平衡。
外源性抗氧化剂是指生物体通过膳食、医药摄取的抗氧化剂。
适当摄入外源性抗氧化剂可以降低体内自由基水平,防止脂质过氧化,帮助机体抵御疾病。
生物体内的许多具有抗氧化活性的物质属于蛋白质类,而且蛋白质具有优良的乳化型特性,能够在油水界面起到介导作用,对于清除生物体内过量自由基,抑制膜脂质过氧化具有重要意义。
蛋白质水解成多肽后,具有抗氧化作用的基团充分暴露出来,能够更好的发挥抗氧化作用,往往蛋白质的水解物的抗氧化活性比相应的蛋白质抗氧化作用更强[26]。
抗氧化物质的还原能力与其抗氧化能力之间存在着一定的关系,一般情况下这种关系是正相关的关系。
抗氧化剂是通过自身的还原作用给出电子,这些电子的受体往往是活泼的自由基,自由基与电子发生反应而成为较为稳定的物质,从而阻断自由基之间的连锁反应,以达到清除自由基的同的[22]。
还原能力的大小直接反映了抗氧化活性的强弱。
因此测定酶解产物的还原能力可以预知其抗氧化活性。
抗氧化剂可以作为活性氧的淬灭剂、自由基受体或金属离子螯合剂等多种方式阻止自由基链式反应,消除脂质过氧化等其他物质的氧化对生物体的伤害。
过渡态金属如铁、铜是诱导多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化的催化剂,尤其是亚铁离子是最具有影响力,因此螫合亚铁离子能力与抗氧化有密切的关系[23]。
菲洛嗪能够与亚铁离子结合形成复合物。
在波长562nm处具有强的吸收。
因此测定金属离子如亚铁离子螯合能力的大小也是评价氧化剂抗氧化性能常用的方法。
螯合能力越强被评价的抗氧化剂潜在的抗氧化性就愈强。
自由基是由氧化反应而产生的对身体有害的物质。
空气中的氧气会令铁钉生锈、油漆褪色、切开的苹果变成褐色,这些过程都属于氧化反应。
同样地,自由基会破坏健康的细胞,侵害人体内的蛋白质、酶等物质,造成人体组织器官受到破坏,加速机体的衰老进程并诱发癌症,心、脑血管等各种疾病。
多酚作为一类氧化还原电位很低的还原剂,具有很强的供氢能力,H+与羟基自由基(·0H)结合,能使之还原为惰性化合物或较稳定的自由基,从而清除体内过多的有害自由基[24]。
Louise等人研究了鸡肉水解蛋白的喷雾干燥工艺,探讨了工艺参数对干燥效果及产品抗氧化性的影响,干燥效果指标包括回收率,出口温度,热量利用率等,DPPH清除率在38.7%~59.4%之间[12]。
这段和前面一段介绍自由基的,整合一下。
响应面法于20世纪50年代最先应用于化学工业中,目的在于确定最优操作过程.Hiu和Hunterl966年的论文详细介绍了早期响应面在化学领域的应用情况.现在,响应面仍然在化学中有很重要的应用.响应面法被频繁地用来确定各种反应物的剂量,使得响应达到最优值或预期值.响应面是利用合理的试验设计并通过实验得到的一定数据,采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系,通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数,解决多变量问题的一种统计方法,随着计算机的发展,它已成为精度高、应用广并具有实用价值的优化技术,响应值和变量之间的关系可以形象地用响应面表示出来,它可用在以下3个方面:
1、描述单个试验变量对响应值的影响;2、确定试验变量之间的相关关系;3、描述所有试验变量对响应值的综合影响。
响应面有许多方面的优点,但它仍有一定的局限性。
首先,如果你将因素水平选的太宽,或选的关键因素不全,将会导致响应面出现吊兜和鞍点,因此事先必须进行调研,查询和充分的论证;其次,通过回归分析得到的结果只能对该类实验作估计;第三,当回归数据用于预测时,只能在因素所限的范围内进行预测。
即使如此,响应面仍不失为一种研究多因素问题强有力工具[25]。
这段话可放到展望部分。
目前关于扁杏水解蛋白方面的研究还少见报道,本论文拟采用喷雾干燥的方法对扁杏水解蛋白溶液进行脱水处理,同时探讨不同的工艺参数对干燥效果和水解蛋白抗氧化活性的影响,为开发具有抗氧化活性的保健产品提供依据,为扁杏仁水解蛋白的后续分级纯化及深入研究其活性机理奠定基础。
本试验选取料液浓度、进料速度和进风温度三因素作为试验因子,运用响应面法研究其对扁杏仁蛋白粉抗氧化活性的影响规律。
1试验材料与设备
1.1试验材料与试剂
扁杏核:
采自辽宁义县;
氢氧化钠:
天津市风船化学试剂科技有限公司;
碱性蛋白酶:
北京鸿润科技有限公司;
中性蛋白酶:
北京鸿润科技有限公司;
盐酸:
徐州威瑞普化工有限公司;
磷酸二氢钾:
天津市北方天医化学试剂厂;
EDTA:
北京中生瑞泰科技有限公司;
铁氰化钾:
天津市天福达实业公司;
过氧化氢:
天津市风船化学试剂科技有限公司;
2-D脱氧核糖溶液:
北京澄道科技有限公司;
抗坏血酸溶液:
天津市风船化学试剂科技有限公司;
氯化铁:
国药集团化学试剂有限公司;
三氯乙酸:
天津市风船化学试剂科技有限公司;
硫代巴比妥酸:
美国sigma公司;
氯化亚铁:
天津市风船化学试剂科技有限公司;
菲咯嗪:
美国sigma公司;
DPPH溶液:
北京中生瑞泰科技有限公司;
乙醇:
天津市天力化学试剂有限公司;
1.2试验设备
恒温水浴锅:
国华电器有限公司;
喷雾干燥器:
天津市天力化学试剂有限公司;
旋转蒸发仪:
上海亚荣生化仪器厂;
循环水式多用真空泵:
郑州长城科工贸有限公司;
721分光光度计:
上海欣茂仪器有限公司;
电热恒温鼓风干燥箱:
上海—恒科学仪器有限公司;
L535台式低速冷冻离心机:
长沙湘仪离心机仪器有限公司;
1.3其它试验装置与用具
锥形瓶、分析天平、量筒、烧杯、比色管、温度计、容量瓶、胶头滴管、广口瓶、玻璃棒、移液枪、离心管、洗洁精、试管架、洗瓶、冰箱。
2试验方法
2.1蛋白水解液的提取
取去皮扁杏儿200g,经粉碎后以1:
5(w/v)的比例与水混合,用2mol/L的NaOH调PH为9至10,在60℃反应1小时后加入1.5%的碱性蛋白酶在35℃下反应1.5小时,然后加入1%的中性蛋白酶在40℃下反应30min离心,取出游离油,过滤取清液进行离心,取出上清液调pH到4.5再次进行离心,取出清液按照试验设计的脱水比例进行减压浓缩。
2.2喷雾干燥工艺流程
将减压浓缩后的水解蛋白溶液预热至50℃,然后通过蠕动泵将溶液导入喷雾干燥器,进气压力为0.3MPa,雾化频率为60Hz,撞针间隔时间设置为5S,采用响应面试验设计考察水解蛋白溶液减压浓缩脱水比例、进风温度及进料速度对喷雾干燥效果及水解蛋白粉抗氧化活性的影响,设定的试验因素水平见表1。
表1响应面试验因素水平表
Table1Responsesurfacelevelofexperimentalfactors
序号
因素
减压浓缩脱水比例(X1)
进风温度(℃)(X2)
进料速度(mL/h)(X3)
1
0.4
190
300
2
0.4
210
300
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
0.6
0.6
0.5
0.5
0.5
0.5
0.4
0.6
0.4
0.6
0.5
0.5
0.5
190
210
190
190
210
210
200
200
200
200
200
200
200
300
300
250
350
250
350
250
250
350
350
300
300
300
2.2.1产品回收率的计算
回收率=(接收瓶中回收的水解蛋白粉质量/进料液中总固形物质量)×100%
2.3还原力的测定
称取5mg不同水解度的样品溶于2ml的去离子水中,震荡使其充分溶解,加入0.2mol/LpH6.6的磷酸缓冲液2ml,质量分数为1%的铁氰化钾(K3Fe(CN)6)溶液2ml,混匀,50℃水浴下保温20min,再加入质量分数为10%的三氯乙酸(TCA)溶液2ml,震荡混匀后离心(3000r/m、10min)。
取离心后的上清液2ml,加入2ml去离子水和0.4ml质量分数的0.1%的三氯化铁溶液,震荡混匀后在50℃水溶液下保温10min,体系溶液由黄色变为蓝色在700nm下进行比色,以去离子水替样品作为空白。
2.4清除羟自由基能力测定
蒸馏水配制不同浓度的样品溶液。
将以下试剂或样品依次加入试管中:
0.4ml磷酸二氢钾—氢氧化钾溶液(ph7.5),0.1ml样品、0.1ml2mmol/LEDTA溶液、0.1ml过氧化氢溶液、0.1ml60mol/L2-D-脱氧核糖溶液、0.1ml2mmol抗坏血酸溶液和0.1ml1mmol/L氯化铁溶液,混合均匀后于37℃水溶液中保温1h,然后再加入1ml20%(w/v)三氯乙酸终止反应。
再向试管中加入1ml1%(w/v)硫代巴比妥酸,置于90-100℃水浴中反应15min。
迅速冷却至室温后在532nm下测定吸光度值(AS和ASB)。
空白管以0.1ml蒸馏水代替样品溶液,其他操作同样品管,可测得空白管吸光值(AC和ACB)按式计算:
清除率%=([AC-ACB]-[AS-ASB])/[AC-ACB]*100
2.5螯合亚铁离子能力测定
称取一定量的样品,用蒸馏水配制成不同浓度,取1ml样品溶液,加入0.05ml2mmol/L氯化亚铁溶液和1.85ml蒸馏水,混合均匀后再加入0.1ml5mmol/L菲咯嗪溶液,震荡后均匀后于室温下静置10min,在562nm下测定吸光值(AS和ASB)。
取1ml蒸馏水代替样品溶液,其它操作同样品管,测得吸光值(AC和ACB)。
按式:
清除率%=([AC-ACB]-[AS-ASB])/[AC-ACB]*100
3结果与分析
就干燥方法而言,喷雾干燥技术具有许多优点,但也有人认为热敏性物料在喷雾干燥时容易被氧化[16],从而可能会降低水解蛋白的抗氧化能力。
喷雾干燥影响粉体质量的工艺参数有:
料液浓度、进料速度、雾化压力、进风温度、出口温度、进风量等[17],这些因素都可能不同程度影响到干燥效果及产品的抗氧化活性,本试验采用的喷雾干燥机为试验型,有些参数不能调控,因此本试验选取料液浓度、进风温度和进料速度作为试验因素,由前期预试验可知,随着入料浓度的增加出粉率逐渐增加扁杏仁蛋白粉的含水量和体积浓度含量逐渐变小。
入料浓度在40%~60%之间时,随着浓度的增加喷雾效果越好,入料浓度越低,但料液水分蒸发所需要的能量越多,喷雾干燥成本也越高;当入料超过60%之后,粘壁越来越严重,料液粘度越来越大,入料越困难;随着进料速度的增加出粉率增加,但到达一定值时出粉率逐渐降低;扁杏仁蛋白粉的含水量则增加进料速度在250ml/h~350ml/h喷雾效果最好;进风温度与水分蒸发量有密切关系,温度越高水分蒸发越快,但是温度过高樱桃粉容易出现焦糊,进风温度在190℃~210℃时喷雾干燥的效果最好,因此选择上述试验因素的基础上因此,设计如表1的因素水平表,采用响应面设计以优化喷雾干燥工艺参数,用一个二次多项式来表征参数与指标间的数学模型:
Y是测定的响应值,b0,b1,bii,bij是回归模型中的参数项。
Xi,Xj是不同变量的水平,e为试验的误差。
利用SAS9.2进行响应面分析,计算回归方程中各项系数,并进行显著性检验[18]。
采用SAS系统设计试验方案并获得相关结果见表2。
回归方程的参数估计见表3,响应面回归方程及方差分析分别见表4和表5。
表2响应面设计方案及结果
Table2Responsesurfacedesignsandtheresults
序
号
脱水比例(X1)
进风温度(℃)(X2)
进料速度
(mL/h)(X3)
回收率(%)
还原力(A700)
羟自由基
清除率(%)
Fe2+螯合
率(%)
1
0.4
190
300
49.962
0.314
38.93
55.02
2
0.4
210
300
54.973
0.287
44.77
58.26
3
0.6
190
300
64.670
0.258
53.27
45.14
4
0.6
210
300
60.483
0.31
50.75
43.77
5
0.5
190
250
56.784
0.305
46.92
63.93
6
0.5
190
350
53.315
0.301
42.04
59.07
7
0.5
210
250
57.253
0.331
47.51
57.79
8
0.5
210
350
55.239
0.254
45.24
48.91
9
0.4
200
250
50.873
0.417
40.57
67.04
10
0.6
200
250
67.628
0.346
57.8
63.93
11
0.4
200
350
51.612
0.275
41.75
67.41
12
0.6
200
350
53.455
0.312
43.66
48.94
13
0.5
200
300
60.238
0.305
50.94
65.32
14
0.5
200
300
58.340
0.328
48.75
68.25
15
0.5
200
300
60.681
0.332
50.51
66.35
表3回归方程参数估计表
Table3Theestimatedparametersofmodel
参数
回收率
还原力
羟自由基清除率
Fe2+螯合能力
估计值
Pr>|t|
估计值
Pr>|t|
估计值
Pr>|t|
估计值
Pr>|t|
b0
-879.62
0.051
-12.179*
0.037
-1087.696**
0.010
-4406.73**
0.0014
b1
831.44**
0.006
-6.170*
0.039
828.083**
0.002
987.84*
0.0395
b2
5.92
0.126
0.139*
0.018
8.051*
0.024
41.99**
0.0013
b3
0.87
0.065
0.001
0.773
0.747*
0.049
0.47
0.5544
b11
-99.34
0.266
0.517
0.625
-130.958
0.089
-584.38*
0.0144
b12
-2.30*
0.030
0.020
0.093
-2.090*
0.017
-1.15
0.485
b22
-0.01
0.180
0.000346*
0.018
-0.018*
0.032
-0.10**
0.0013
b13
-0.75**
0.005
0.005*
0.037
-0.766**
0.001
-0.77
0.0537
b23
0.001
0.654
0.000
0.114
0.001
0.324
-0.00201
0.54
b33
-0.001*
0.015
0.000
0.332
-0.001**
0.006
0.000413
0.5446
注:
**.差异高度显著(P<0.01);*.差异显著(P<0.05)。
表4响应面回归方程及优化结果
Table4Responsesurfacemodelsandoptimizationresults
响应值
二次多项式回归模型
最优值
最优水平实测值
回收率(Y1)
Y1=-879.62+831.44X1+5.92X2+0.87X3-99.34X12-2.3X1X2-0.01X22-0.75X1X3+0.001X2X3-0.001X32(R2=0.9676)
MAX=65.474%;
(X1=0.586,X2=198℃,X3=276.5mL/h)
66.32%
还原力(Y2)
Y2=-12.179-6.170X1+0.139X2+0.001X3+
0.517X12+0.020X1X2+0.000346X22+0.005X1X
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