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周燕茹初稿最终定稿
泰山学院
本科毕业论文
木聚糖降解酶系统
所在学院生物与酿酒工程学院
专业名称生物科学
申请学士学位所属学科理学
年级二〇一〇级
学生姓名、学号周燕茹2010120027
指导教师姓名、职称彭静静讲师
完成日期二〇一二年六月
摘要
当今世界能源日益短缺的危机已经越发明显,而在植物细胞壁中却含有纤维素、半纤维素等丰富的可再生资源。
我国是一个农业大国,具有大量的玉米芯、甘蔗渣、小麦麸秸秆等富含半纤维素类自然资源的农林废弃物,而木聚糖是植物半纤维素的主要成分,在木聚糖降解酶系统的作用下,可以被逐次降解成为低聚木糖及木糖,在饲料、造纸、食品和医药等行业应用都很广泛,所以研究木聚糖降解酶系统对于解决资源危机尤为重要。
本文重点介绍了木聚糖降解酶系统中的几种酶,木聚糖的结构与组成,并对木聚糖降解酶系统最主要的酶——木聚糖酶进行了详细的阐述。
关键词:
木聚糖,木聚糖酶,降解酶系统,研究进展
ABSTRACT
Intoday'sworld,energyshortageshavebeenmoreandmoreobvious.Itcontainscelluloseandhemicellulosesinplantcellwall,whicharerichrenewableresources.Ourcountryisalargeagriculturalnation,whichhasrichhemicellulosesforestrywaste,forexample,corncob,biogases,andsmallwheatbranstraw,andXylanplantisthemaincomponentsofhemicelluloses.InthedegradationundertheXylandegradingenzymessystem,itcanbesuccessivedegradatedtolow-molecular-weightXyloseandXylose,whichareverywidelyapplicatedintheanimalfeed,paper,foodandpharmaceuticalindustries.SoitisespeciallyimportanttoresearchtheXylandegradingenzymes,solvingresourcecrisis.ThispaperintroducestheseveralenzymesinthedegradingoftheXylanasesystem,Xylanstructureandcompositionandstatesthemostkeyenzymes-Xylanolyticenzymesindetail.
Keywords:
Xylan,Xylanolyticenzymes,Degradingenzymessystem,Researchprogress
目录
1引言1
2木聚糖降解酶系统1
2.1木聚糖降解酶系统的组成1
2.1.1β-1,4-内切木聚糖酶2
2.1.2β-木糖苷酶2
2.1.3α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶3
2.1.4其它3
2.2木聚糖降解酶系统的催化位点3
3木聚糖的结构和组成4
3.1硬木(针叶)木聚糖4
3.2软木(阔叶)木聚糖5
4木聚糖酶5
4.1木聚糖酶的分类5
4.1.1G/11族和F/10族5
4.1.2特异性酶和非特异性酶6
4.1.3其它分类6
4.2木聚糖酶的催化机制7
4.3木聚糖酶的耐热性7
5木聚糖酶的研究进展8
5.1细菌8
5.2真菌8
参考文献10
致谢12
1引言
植物细胞壁主要是由纤维素、半纤维素和木质素等物质组成的,这些物质是自然界中宝贵的可再生资源,被广泛地应用于造纸、食品、医药等行业。
在当今世界能源日益短缺的情况下,这些资源正越来越受到重视[1]。
我国是一个农业大国,具有丰富的玉米芯、甘蔗渣、小麦麸秸秆等富含半纤维素类自然资源的农林废弃物,并且粮食产量与这些废弃物基本上以1:
1.1的量产出,随着粮食生产的发展,每年这些资源都成为环保负担[2],而90%以上的秸杆半纤维素是木聚糖,所以木聚糖的开发利用对解决能源危机起着不可估量的作用[2]。
木聚糖是高度分支的多糖,其结构复杂,主链和侧链上均具有多种取代基团,其基本结构单元是由β-1,4或β-1,3糖苷键连接的多聚木糖链,它的完全降解需要多种专一性的水解酶(即木聚糖降解酶系统)的参与,主要有β-1,4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰木聚糖酯酶等[3]。
它们不但可以降解木聚糖生成木糖,而且能以农作物残渣中的半纤维素为原料生产经济价值较高的产品等。
在世界能源日益紧缺的今天,木聚糖降解酶系统越来越受到人们的关注[3,4]。
由于木聚糖降解酶系统具有的重要应用价值,国内外不少研究者正在致力于它的开发研究。
我国科学家对于半纤维素酶等的认识较为透彻,并且在食品行业、饲料的加工、溶解纸浆以及医药等方面的应用已经取得了可观的进展,但对木聚糖降解酶系统的研究论述还相对较少,尤其对于半纤维素的开发利用,人们的认识往往局限于从半纤维素发酵生产乙醇的方向。
而国外科学家不但对木聚糖酶的研究在实际上加以应用,并取得了良好的效果,还在理论上作了大量系统的阐述[5]。
本文主要介绍了木聚糖降解酶系统中的几种酶,木聚糖的结构与组成,并对木聚糖降解酶系统中的最主要酶——木聚糖酶进行了比较详细的综述。
2木聚糖降解酶系统
2.1木聚糖降解酶系统的组成
木聚糖多为异聚多糖,是植物半纤维素的主要成分。
木聚糖的结构复杂,其主链和侧链上均具有多种取代基团,所以它如果要完全被降解,就需要多种专一性酶的参与,主要有β-1,4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-葡萄糖醛酸苷酶等,其中β-1,4-内切木聚糖酶是最主要的酶。
这些酶的共同作用,将木聚糖分解成为它的各种组成分糖,有关这些酶的作用特点如表1[5,6]。
表1木聚糖降解酶系统中各种酶的作用
酶名
作用
β-1,4-内切木聚糖酶
负责木聚糖主链骨架的降解
β-木糖苷酶
负责寡聚糖的进一步降解
α-葡萄糖醛酸苷酶
负责木聚糖支链的降解
乙酰木聚糖酯酶
负责作用于细胞内外的乙酰取代基团
香豆酸酯酶
负责切除香豆酸和阿拉伯糖残基之间的酯键
阿魏酸酯酶
负责切除阿魏酸与阿拉伯糖残基之间的酯键
2.1.1β-1,4-内切木聚糖酶
国内外很多科学家已经通过实验证实,多数真菌和细菌的β-1,4-内切木聚糖酶是单亚基蛋白,相对分子质量一般为8500~85000,pI值为3.6~10.3,并且绝大多数β-1,4-内切木聚糖酶的PH值通常情况下小于7.0[7]。
另外,β-1,4-内切木聚糖酶可以水解DP值大于2.3的一些木聚糖,它的亲和力随着DP值的增大而逐渐的增大[8,9]。
多数研究表明,由于空间障碍,木聚糖主链上的一些取代基团会对木聚糖酶解的过程产生阻碍作用,当他们采用某些化学手段除去了这些取代基团后,结果显示酶与底物的表观结合程度将会明显的加强[8]。
还有一些取代基团能够使酶的催化基团有正确的取向,并且能够定位于酶的特定切割位点,也就是说这些木聚糖酶要想降解木聚糖,木聚糖主链上的一些取代基团对于其作用的发挥起着很大的限制作用[9]。
2.1.2β-木糖苷酶
β-木糖苷酶的形式多种多样,主要有单体、二聚体或四聚体等,相对分子质量一般为26000~360000,pI值为3.3~7.3[9]。
β-木糖苷酶存在于很多微生物中,但在细菌和酵母中,它主要存在于细胞内。
β-木糖苷酶的最佳底物是二聚木糖,它属于外切酶,对底物的亲和力随着底物的DP值降低而逐渐增加,并且对多聚木聚糖几乎无活力[9]。
与β-1,4-内切木聚糖酶一样,β-木糖苷酶也可以使木聚糖降解为木聚寡糖或者木糖[10]。
2.1.3α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶
国内外对于α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶的研究自始至终都很少,原因是由于缺少合适的天然底物,阿拉伯糖苷酶的存在形式也是多种多样的,但主要以单体形式存在[9,10],此外还有二聚体、四聚体、六聚体和八聚体等,相对分子质量为53000~495000,pI值通常为2.6~9.4,最适PH值在2.6~7.0之间[11]。
α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶只有两种:
外切型和内切型,但主要是外切型,外切型主要作用于p-硝基酚-呋喃型阿拉伯糖苷和分枝阿拉伯聚糖,而内切型仅能作用于线性阿拉伯聚糖[12]。
2.1.4其它
α-葡萄糖醛酸苷酶主要水解葡萄糖醛酸和木糖残基之间的α-1,2-糖苷键,其相对分子质量一般在1000以上,pI值一般都小于4.0,最适PH值在3.3~6.0之间[13]。
另外,α-葡萄糖醛酸苷酶的底物特异性随酶的来源不同而不同[14]。
乙酰木聚糖酯酶和酚酸酯酶则更为简单。
乙酰木聚糖酯酶主要作用于木糖残基C-2和C-3位上的乙酰取代基团。
而酚酸酯酶主要包括两种酶,即香豆酸酯酶和阿魏酸酯酶,前者主要是切除香豆酸与阿拉伯糖残基之间的酯键,后者主要是切除阿魏酸与阿拉伯糖残基之间的酯键[14,15]。
2.2木聚糖降解酶系统的催化位点
木聚糖降解酶系统中各种酶的催化是有一定规律的,首先,由β-1,4-内切木聚糖酶(endoβ-1,4-xylanase)随机断裂木聚糖的骨架,使之降解成为木聚寡糖、木二糖和少量的木糖,降低了聚合度,然后由外切酶β-木糖苷酶(β-1,4-xylosidase)将木寡糖和木二糖从非还原性末端开始,完全降解为木糖[15]。
侧链水解酶作用于侧链上的取代基与木糖骨架之间的键,并且在水解酶的作用下将木聚糖分解成为它的组成性单糖,其作用位点如图1[16]。
图1木聚糖降解酶系统水解植物木聚糖结构位点示意图
Endoxylanase:
内切木聚糖酶;β-Xylosidase:
β-木糖苷酶;α-Glucuronidase:
α-葡萄糖醛酸酶;α-Arabinofuranosidase:
α-阿拉伯呋喃糖苷酶;AcetylXylanEsterase:
乙酰木聚糖酯酶
3木聚糖的结构和组成
木聚糖是存在于植物细胞壁中最丰富的半纤维素,在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素,约占细胞干重的35%。
但是其化学结构较纤维素复杂得多,它的主链由β-1,4-糖苷键相连的β-D-毗喃型木糖残基聚合而成,另外,其主链上还带着一些不同的取代基如乙酰基、阿拉伯糖基、4-O-甲基葡萄糖醛酸和阿魏酸残基等[16,17]。
这种半纤维素的彻底降解需要多种水解酶的协同作用,如木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖酶和β-葡萄糖醛酸酶,通过这些酶的协同作用,将木聚糖转化为它的组成分糖。
如果将其彻底分解会得到木糖、β-葡萄糖醛酸和少量的阿拉伯糖,可以用作基本碳源生产各种发酵产品,例如各种氨基酸、单细胞蛋白等[15,17]。
一般将木聚糖分成硬木(针叶)木聚糖和软木(阔叶)木聚糖两种[18]。
3.1硬木(针叶)木聚糖
硬木木聚糖是由O-乙酰基-4-O-甲基葡萄糖醛酸木糖聚合形成的,它是一条大约72个β-木糖吡喃型残基通过β-1,4-糖苷键相连而形成的木聚糖主链(平均聚合度在160-210之间),平均每15个木聚糖的残基就由β-1,2-糖苷键连上一个4-O-甲基葡萄糖醛酸取代基[15,18]。
硬木木聚糖是高度乙酰化的形式,每隔10个木糖单位的C-2和C-3位都会有7个O-乙酰,并且有1个4-O-甲基葡萄糖醛酸基团位于其C-2位[19]。
在木聚糖的提取过程中,乙酰基团能够在主链C-2位和C-3位这两个位置之间转移,而用碱液来提取木聚糖时,这些基团就会很容易被除去[18]。
3.2软木(阔叶)木聚糖
软木半纤维素中的组成性木聚糖主要是阿拉伯糖-4-O-甲基葡萄糖醛酸木聚糖(平均的聚合度在72-82之间),平均每6个木糖单位就会有一个4-O-甲基葡萄糖醛酸取代基,每8-9个木糖残基带一个α-L-阿拉伯呋喃糖单元[18]。
软木中的木聚糖(如图2)与硬木中的相比,它是非乙酰化的,约13%的木糖残基为α-L-阿拉伯呋喃糖基所替代,乙酰基通过β-1,3-糖苷键与木糖残基的C-3位置相连,β-D-毗喃型木糖残基与4-甲基葡萄糖醛酸和L-呋喃型阿拉伯糖三者的比例约为100:
20:
13,秸杆中的半纤维素就属于此种类型[19]。
图2软木木聚糖的主要成分—阿拉伯葡萄糖醛酸木聚糖的结构示意
4木聚糖酶
4.1木聚糖酶的分类
4.1.1G/11族和F/10族
根据对催化区的保守氨基酸和疏水簇的分析,将糖苷键水解酶分为58个族,而木聚糖酶被划入了2个族,即G/11家族和F/10家族。
F/10家族木聚糖酶分子量比较高,来源微生物比较广泛,较低等细菌和较高等真菌是主要的来源;除此之外,还有一些嗜冷性的细菌和嗜热性的细菌。
F/10木聚糖酶的三维结构是(β/α)8折叠桶,它的蛋白质序列长度从300个氨基酸长度到1126个氨基酸长度,差距比较大,这主要是因为F/10木聚糖酶结构比较复杂,含有各种作用不同的结构域,不仅有起水解作用的催化结构域,还有和底物结合的结构域,中间通过一系列的连接区将其结合起来。
除此之外,该家族的木聚糖酶还可以作用于对硝基苯和对硝基苯纤维二糖,并且需较少数量底物结合位点,底物降解后的主要产物为低聚木糖(聚合度1-5)[20]。
G/11家族木聚糖酶的分子量一般较小,主要来自细菌,只有极少量来源于真菌。
G/11木聚糖酶的典型三维结构呈现β-折叠片形的三明治状结构,其蛋白质的序列从189个氨基酸长度到933个氨基酸长度,但210左右氨基酸长度的居多,这是因为除了极少数以外,它们中的绝大部分都是由一个催化结构域组成的。
其中来源于瘤胃菌(Ruminococcus flavefaciens)[20]的木聚糖酶具有G/11和F/10木聚糖酶双重的活性;在其N端有G/11木聚糖酶活性的结构域,而在其C端构成有F/10活性的结构域,中间以连接区域相结合。
G/11家族的木聚糖酶对木聚糖有很高的特异性,酶解后的主要产物为木糖(聚合度5-10)[21]。
4.1.2特异性酶和非特异性酶
根据对所催化底物特异性的差异,木聚糖酶分为特异性酶和非特异性酶两种[21]。
特异性酶仅仅作用于木聚糖底物,但是,许多木聚糖酶都属于非特异性酶,它们不但作用于木聚糖,还作用于纤维素和人工底物等,称双功能酶。
通过测定Kcat/Km值,可以知道非特异性酶主要是木聚糖酶,还是纤维素酶[22]。
对于这两种酶的不同,有人认为是由于它们活性位点的不同,但大部分人却认为是由于两者底物结合基团的不同,而不是它们催化基团的不同[22]。
4.1.3其它分类
除了切断主链的不同外,根据它们是否可以催化释放出阿拉伯糖侧链取代基,可分为脱支链酶和非脱支链酶[22]。
另外,还可从酶的分子量上进行划分,分为低分子量木聚糖酶和高分子量木聚糖酶[23]。
4.2木聚糖酶的催化机制
多数实验都已经证实,木聚糖酶是由羧基参与的酸碱催化,这与葡聚糖酶的作用方式有点相似。
首先由位于活性位点处的的谷氨酸的羧基提供质子给β-1,4-糖苷键,糖苷键断裂以后,由带负电的天冬氨酸、谷氨酸或组氨酸稳定住过渡态碳,然后由H2O分子提供OH-给木糖的C-1,从而把糖残基还原;提供H+给Glu的羧基,使木聚糖酶复原[23,24]。
另外还有一些研究认为,木聚糖酶催化底物水解时,形成了一个酶-糖苷复合物。
Cu2+、Hg2+等可以影响酶分子中的一些二硫键或者直接攻击酶分子中的其它一些氨基酸残基,从而改变酶的构象,使酶失活[23]。
4.3木聚糖酶的耐热性
随着基因工程和发酵技术的迅速发展,酶制剂的成本已大幅度下降,以木聚糖酶为代表的多种酶制剂已经广泛的应用于各行各业,除了由于木聚糖酶具有的较高的催化活性外,还主要是因为它的较好的耐热性[25]。
多年来国内外的学者围绕着木聚糖酶的耐热机理和优化应用等方面也已经做了大量的研究,并且取得了较大进展。
迄今为止,人们用了很多方法来研究酶蛋白的耐热机制,例如,利用分子模型法、光衍射法和核磁共振法来研究耐热蛋白的三维结构等,来比较耐热蛋白和非耐热蛋白一级序列的同源性,并且在研究过程中已经发现了一系列的规律[26]:
(1)耐热蛋白和非耐热蛋白的疏水核心的差别不是很大,而蛋白质表面的一些残基的某些微小变化对耐热蛋白的热稳定性起着重要的作用;
(2)氨基末端的不同根本决定着酶蛋白的耐热性;
(3)在嗜热微生物的体内,耐热蛋白对热的耐受性需要很多种辅助因子的参加,因此在体外要使这些蛋白因子仍然具有强的热耐受性,就必须在溶液中加入一些辅助的因子或者是化合物等;
(4)一些属于芳香族氨基酸的木聚糖酶分子能够使酶分子之间形成黏性斑,这些黏性斑使酶分子之间形成二聚或多聚体,这些多聚体的形成是否对酶的热耐受性起作用还没有得到证实。
5木聚糖酶的研究进展
在自然界中,木聚糖酶的来源非常的广泛,从海洋生物、藻类到陆地细菌、真菌以及反刍动物的瘤胃,甚至蜗牛、陆地植物组织、甲壳动物和各种无脊椎动物中都存在。
由于木聚糖酶具有重要的应用价值,目前人们已经加大了对木聚糖酶的开发研究。
目前已经报道的能产木聚糖酶的微生物已经有很多,如细菌、链霉菌、黑曲霉、木霉、青霉等,现在人们研究和应用的最多的是细菌、黑曲霉和木霉[27,28]。
5.1细菌
大多细菌属于体温型微生物,适宜生长温度在35~40℃,所以在细菌中更易于筛选出耐热性能比较好的产酶菌株。
细菌性的木聚糖酶多数属于10族内切酶,酶的稳定PH范围很广[28],由于内切性木聚糖酶含量比较高,所以其分解木聚糖的效率也比较高。
杆菌和放线菌是最常用于表达木聚糖酶的细菌,其中的大肠杆菌被用作基因工程宿主菌,近几年来的研究成果如表2所示[29]。
表2 研究成果
发表时间
菌种
是否工程菌
发酵方式
酶活
2004
Bacilluscirculans
否
液态深层发酵
8.4U/ml
2005
Bacilluspumilus
否
固态发酵
7087U/g(干培养基)
2006
Escherichiacoli
否
液态深层发酵
852.41U/ml
2007
Bacillussubtilis
是
液态深层发酵
3194.25U/ml
2008
Bacillussubtilis
否
固态发酵
7087U/g(干培养基)
2009
Alphaproteobacteria
否
液态深层发酵
2122.5U/ml
2010
Lactobacillusbulgaricus
是
液态深层发酵
128U/ml
5.2真菌
真菌通常分为酵母菌(yeast)、霉菌(mould)和蕈菌(mushroom,大型真菌)三大类,其中霉菌和毕赤酵母(Pichiapastoris)[28]在发酵生产木聚糖酶方面发挥了巨大的作用。
霉菌是丝状真菌的俗称,其中有许多种具有能表达木聚糖酶的木聚糖酶基因,因产酶水平高于酵母菌和细菌而引起研究者格外的关注,目前用于研究木聚糖酶表达的霉菌主要有黑曲霉(Aspergillusniger)[28],青霉菌(Penicilliumcanescens)[28],伯克霍尔德氏菌(Burkhloderiasp)[28],嗜热拟青霉(Paecilomycesthemophila)[29],里氏木霉(Trichodermareesei)[29],绿色木霉(Trichodermavirides)[29]等。
Yang等以绿色木霉(T.virides)[30]为产酶菌,当采用小麦秸秆为碳源进行固态发酵和液态发酵后,得到了酶活力为18580U/g的木聚糖酶。
Mohana等将菌株伯克霍尔德氏菌(B.deriasp)的固体发酵条件优化后,木聚糖酶活力最高达7500U/g[30,31]。
毕赤酵母(P.pastoris)能以甲醇为唯一碳源和能源进行生长,它首先利用醇氧化酶(AOX)将甲醇氧化成为过氧化氢以及甲醛,醇氧化酶的两个编码基因是AOX1和AOX2[32]。
经过检测,在甲醇培养的细胞中,AOX可占总蛋白的30%以上。
许多生物制品如重组人白介素等都是应用毕赤酵母(P.pastoris)表达得到的。
几年前,Ruanglek等对一株重组毕赤酵母(P.pastoris)进行专门研究,发现其表达的重组木聚糖酶最适反应温度为55℃,比原木聚糖酶提高了5℃,PH作用范围为3.6~6.5,并且在PH为5时具有最高酶活(800U/mg),相对部分商业酶,该酶对米糠和大豆粉纤维的体外消化率分别要高1.8和2.4[33]。
参考文献
[1]阎伯旭,高配基.纤维素酶分子结构与功能研究进展[J].生命科学,1995,7(5):
22-25.
[2]朱静,严自正.微生物产生的木聚糖酶的功能和应用[N].生物工程学报,1996,12(4):
375-378.
[3]邹永龙,王国强.木聚糖降解酶系统[J].植物生理学通讯,1999,35(5):
404-410.
[4]蔡敬民,张洁,于宙等.工业微生物[M].天津,南开大学出版社,1996,17-20.
[5]江均平,严自正,张树政.纤维素酶的研究进展[J].生命科学,1996,26
(2):
17-20.
[6]曾宇成,张树政.木聚糖酶的功能和应用[N].微生物学报,1987-21-27(4).
[7]邵蔚蓝,薛业敏.以基因重组技术开发木聚糖类半纤维素资源[J].食品与生物技术,2002,21
(1):
88-931.
[8]岳晓禹,贺小营,牛天贵等.木聚糖酶的研究进展[M].酿酒科技,2007:
42.
[9]江正强.微生物木聚糖酶的生产及其在食品工业中应用的研究进展[J].中国食品学报,2005,5
(1):
1-8.
[10]孙振涛,赵祥颖,刘建军等.微生物木聚糖酶及其应用[J].生物技术,2007,17
(2):
93-97.
[11]薛业敏,毛忠贵,邵蔚蓝.利用玉米芯木聚糖酶法制备低聚木糖的研究[J].中国造,2003,129(6):
7-9.
[12]邓伟,李秀婷,江正强等.橄榄绿链霉菌木聚糖酶组对面包品质的改善[J].中国粮油学报,2005,20
(1):
1-5.
[13]李秀婷,李里特,江正强等.等耐热木聚糖酶对面包品质的改善[J].中国粮油学报,2005,20
(1):
1-5.
[14]Wong,K.K.Y.,Tan,L.U.L.Saddler,J.N.Multiplicityofβ-1,4-xylanaseinmicroorganisms:
functionandapplications[J].MicrobiolRev,1988,52:
305-317.
[15]宋娜,丁长河,李里特.高温蒸煮玉米芯酶法制备低聚木糖工艺研究[J].食品工业,2007,28(5):
1-4.
[16]王萍,吕姗姗.碱液提取小麦麸皮木聚糖酶的研究[J].食品研究与开发,2006,127(9):
7-10.
[17]邹永龙,王国强.木聚糖降解酶系统[J].中国科学院上海植物生理研究所,1999,35(5):
50-
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