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当归根尾土中微生物多样性研究

本科毕业论文

题目当归根尾土中微生物多样性研究

学院

专业

毕业届别

姓名

指导教师

职称讲师

甘肃农业大学教务处制

二〇一六年六月

目录

摘要3

关键词3

Abstract3

Keywords3

前言3

1材料与方法3

1.1试验材料4

1.2研究方法4

1.2.1样品处理4

1.2.2培养基的配制4

1.2.3菌种分离培养4

1.2.4不同培养基菌落特征的描述5

1.2.5不同培养基上的菌落计数5

2结果与分析5

2.1当归根尾土中微生物不同培养基的菌落特征的描述5

2.1.1当归根尾土中细菌培养基上的菌落特征5

2.1.2当归根尾土中霉菌培养基上的菌落特征5

2.1.3当归根尾土中放线菌培养基上的菌落特征6

2.2当归根尾土中微生物不同培养基的计数6

2.2.1当归根尾土中细菌培养基上菌落的计数6

2.2.2当归根尾土中霉菌培养基上菌落的计数6

2.2.3当归根尾土中放线菌培养基上菌落的计数6

3讨论6

3.1当归根尾土中微生物多样性的讨论6

3.2微生物分离技术的讨论7

3.3微生物的稀释平板计数的讨论7

3.4对于本次试验优点、不足和收获的总结7

3.4.1本次试验优点7

3.4.2本次试验的不足之处8

3.4.3本次试验的收获8

参考文献8

致谢9

附录10

当归根尾土中微生物多样性研究

（甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州，730070）

摘要：

通过不同的培养基运用稀释平板分离法对当归尾土壤中的微生物进行初步的分离、菌落特征的描述和菌落的计数，以达到对当归根尾土中微生物多样性的初步认识。

实验结果表明，当归根尾土中的微生物，以细菌种类和数量最多，其种类达到了11种，数量达到了1.98×107个；霉菌次之，其种类达到了5种，数量达到了2.5×105个；放线菌最少，其种类达到了2种，数量达到了6.4×104个。

关键词：

当归根尾土；根际微生物；多样性；菌落特征；

Angelicaroottailinthesoilmicrobialdiversityresearch

wangbin

（MajorinBiologicalproductsintheCollegeoflifescienceandtechnologyofGansuAgricultureUniversity，GansuLanzhou，730070）

Abstract:

Throughdifferentmediumdilutionplateseparationisusedtocarriesonthepreliminaryseparation,angelicatailinthesoilmicrobialcolonyfeaturedescriptionsandcolonycounting,getintheendinthesoilinordertoachieveapreliminaryunderstandingofthemicrobialdiversity.ExperimentalresultsshowthatAngelicainthetailofthesoilmicrobes,withbacterialspeciesandthequantityisthemost,thetypereached12,thenumberreached1.98x107;Mouldtotakesecondplace,thetypereached5types,thenumberreached2.5x105;Upto2kindsofactinomycetes,atleastthesort,thenumberis6.4x104.

Keywords:

Angelicaroottailinthesoil；microorganism；diversity；colonycharacteristics

前言

当归（Angelicasinensis）为伞形科（Apiaceae）多年生草本植物，其根可入药，药性温、甘、辛，具有补血和血，调经止痛，润燥滑肠、抗癌、抗老防老、免疫之功效[1]。

主产甘肃东南部，以岷县产量多，质量好，其次为云南、四川、陕西、湖北等省，均为栽培。

1904年，德国微生物学家LorenzHiltner提出了根际概念，他将根际定义为根系周围、受根系生长影响的土体[2]。

在植物根际的微环境中，存在着大量的微生物，其数量要远远高于非根际环境。

近年来对药用植物与根际微生物关系的研究表明，许多药用植物及其根际微生物之间的关系密不可分，既包括促进植物生长的有益微生物，如帮助植物转化与吸收土壤养分等；也包括抑制植物生长的有害微生物，如通过自毒作用、改变土壤理化性质和降低土壤肥力等方式致使药用作物连作减产[3]。

因此，研究当归根际微生物的多样性，有助于了解当归根际微生物的种类，以便于当归植物更好地栽培。

本文就属于当归根际的根尾土中的微生物进行分离培养，从而初步了解当归的根尾土中微生物的种类和其数量。

1材料与方法

1.1试验材料

在试验地找到当归，用土壤刀从当归基部开始逐段逐层地小心挖去上层覆土，追踪根系的伸展方向，然后找到根尾部分，小心将根尾带土取出，保留距根表4mm左右的土壤，然后轻轻抖落当归根部大块不含根系的土壤，然后用灭菌镊子刮取附在根尾上的一薄层土壤作为根尾土壤，装入无菌塑料袋中。

低温保存并带回实验室。

将当归根尾土壤样品放在4℃的冰箱里保存[4,5]。

1.2研究方法

1.2.1样品处理

在无菌条件下，取10g土样，放入到90mL的无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中。

在室温下用手振荡摇匀20min，使土样与水充分混合，将细胞分散。

静置，成为土壤菌悬液（10-1）。

在超净工作台下，用200～1000μL的移液枪从中吸取1mL土壤菌悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，振荡混匀（10-2）。

然后换用一支已灭菌的吸头，从此管中吸取1mL注入另一盛有9mL无菌水的试管中（10-3），依此类推制成10-4，10-5，10-6各种稀释度的土壤菌悬液。

1.2.2培养基的配制

牛肉膏蛋白胨培养基[6]：

牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH7.2～7.4，121℃下灭菌20min。

马丁氏培养基[6]：

KH2PO41g,MgSO4▪7H2O0.5g,蛋白胨5g,葡萄糖10g,琼脂15～20g,蒸馏水1000mL，pH自然（在1000ml蒸馏水中加1%孟加拉红水溶液3ml,每100ml加2ml氯霉素），121℃下灭菌20min。

高氏一号培养基[6]：

可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO4•3H2O0.5g，MgSO4•7H2O0.5g，FeSO4•7H2O0.01g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH7.4~7.6，121℃下灭菌20min。

制法：

先用少量冷水把可溶性淀粉调成糊状，用文火加热，然后再加水及其他药品，待各成分溶解后再补足水至1000mL。

1.2.3菌种分离培养

在超净工作台下将处理好的根尾土壤菌悬液，用20μL～200μL的移液枪以200μL的接种量按照不同菌种所要求的稀释度的顺序分别接种到牛肉膏蛋白胨培养基、马丁氏培养基、高氏一号培养基，并根据不同菌种所适宜的温度，分别将接种后的牛肉膏蛋白胨培养基、马丁氏培养基、高氏一号培养基放置到37℃培养箱、28℃培养箱、28～30℃培养箱中培养至长出菌落为止。

1.2.4不同培养基菌落特征的描述

将长出菌落的培养基从培养箱中取出，观察培养基上的菌落特征，并记录好其菌落特征。

1.2.5不同培养基上的菌落计数

按照菌落技术原则（见附录）对不同培养基进行计数，在计数过程中，选菌落分散、菌落数适量且各平行皿菌落数接近的稀释度的平皿计数，通常细菌和放线菌选取菌落数在30～300之间的平皿，霉菌选菌落数在10～100之间的平皿，最后换算成每克当归根尾土中所含菌数。

其换算公式[7]如下：

每克当归根尾土中所含菌数=同一稀释度的平均菌落×稀释倍数

2结果与分析

2.1当归根尾土中微生物不同培养基的菌落特征的描述

2.1.1当归根尾土中细菌培养基上的菌落特征

不同菌落

特征的编号

菌落颜色

菌落大小

（直径/mm）

干湿

菌落形状

是否透明

表面光泽

表面形状

凸起情况

边缘状况

DGX1

灰白色

3～5mm

干燥

圆形

否

无光泽

光滑

扁平

整体

DGX2

乳白色

1mm以下

湿润

圆形

否

闪光

光滑

凸起

整体

DGX3

深橘黄色

0.5mm以下

湿润

圆形

是

金属光泽

光滑

凸起

整体

DGX4

浅粉橘红色

1mm以下

湿润

圆形

是

闪光

光滑

凸起

整体

DGX5

灰黄色

3～5mm

干燥

圆形

否

无光泽

褶皱

扁平

整体

DGX6

深黄色

3～5mm

湿润

圆形

否

闪光

光滑

凸起

整体

DGX7

灰白色

4～5mm

湿润

圆形

否

无光泽

同心环

扁平

整体

DGX8

暗红色

1mm以下

湿润

圆形

否

金属光泽

光滑

高凸起

整体

DGX9

浅黄色

1mm以下

湿润

圆形

是

闪光

光滑

扁平

整体

DGX10

无色

1～3mm

湿润

扁圆形

是

闪光

光滑

凸起

整体

DGX11

暗灰色

1～3mm

干燥

圆形

否

无光泽

光滑

凸起

整体

表一当归根尾土中细菌培养基上的菌落特征

2.1.2当归根尾土中霉菌培养基上的菌落特征

不同菌落

特征的编号

菌落颜色

菌丝情况

菌落的状况

干湿

是否透明

有无孢子

边缘状况

DGM1

白色

有长菌丝

蜘蛛网状

湿润

否

无

整体

DGM2

白色菌丝

菌丝相互缠绕

绒毛状

湿润

否

有黑色的孢子

不整体

DGM3

白色菌丝

菌丝短小

絮状

湿润

否

无

不整体

DGM4

黑色

菌丝细密，短小

圆形

湿润

否

无

整体

DGM5

绿色

菌丝短小

絮状

干燥

否

无

不整体

表二当归根尾土中霉菌培养基上的菌落特征

2.1.3当归根尾土中放线菌培养基上的菌落特征

不同菌落

特征的编号

菌落颜色

菌落大小

（直径/mm）

干湿

凸起情况

边缘状况

有无产生色素

DGF1

暗灰

1mm左右

湿润

扁平

整体

产生黑色素

DGF2

白色

2mm左右

干燥

凸体

整体

无

表三当归根尾土中放线菌培养基上的菌落特征

2.2当归根尾土中微生物不同培养基的计数

2.2.1当归根尾土中细菌培养基上菌落的计数

稀释度

不同重复次数下的菌落数

不同稀释下的

平均菌落数

1

2

3

10-4

多数不可计

多数不可计

多数不可计

—

10-5

165

287

141

198

10-6

78

56

87

74

表四当归根尾土中细菌培养基上菌落的计数

从表四中的数据可知，稀释度为10-6的平均菌菌落数/稀释度为10-5的平均菌落数之比=740/198=3.74＞2（见附录菌落计数原则②），由换算公式可知，1g当归根尾土中有1.98×107个细菌。

2.2.2当归根尾土中霉菌培养基上菌落的计数

稀释度

不同重复次数下的菌落数

不同稀释的

平均菌落数

1

2

3

10-2

113

97

115

108

10-3

86

83

97

89

10-4

28

26

21

25

表五当归根尾土中霉菌培养基上菌落的计数

将表五中的数据换算可知（见附录菌落计数原则）,1g当归根尾土中有2.5×105个霉菌。

2.2.3当归根尾土中放线菌培养基上菌落的计数

稀释度

不同重复次数下的菌落数

不同稀释的

平均菌落数

1

2

3

10-1

287

262

293

281

10-2

156

140

143

146

10-3

58

69

65

64

表六当归根尾土中放线菌培养基上菌落的计数

将表六中的的数据计算可知（见附录菌落计数原则）,1g当归根尾土中有6.4×104个放线菌。

3讨论

3.1当归根尾土中微生物多样性的讨论

根际微生物是影响的土壤范围内生长繁殖的微生物种群，有细菌、放线菌、真菌、藻类和原生动物等，数量比根际外多几倍至几十倍[8]。

本试验通过将不同稀释度的当归根尾土壤菌悬液接种不同的培养基以达到初步分离、菌落特征的描述和计数的目的，实验结果表明，以细菌的种类和数量最多，其种类达到了12种，数量达到了1.98×107个；霉菌次之，霉菌次之，其种类达到了5种，数量达到了2.5×105个；放线菌最少，其种类达到了2种，数量达到了6.4×104个。

并结合所查阅的相关文献，充分表明当归根尾土中的微生物多样性，有助于当归的栽培和增产[9]。

因此，对于药用植物的根际微生物的研究今后应备受重视。

3.2微生物分离技术的讨论

通过本次试验，让我认识到了单一的培养基达不到分离微生物的目的。

因此，我们需通过每种微生物的特性用选择培养基加以分离，从而得到纯的培养物。

对于微生物（细菌、真菌、放线菌）的分离，一般是根据该微生物对营养、PH、氧气等要求的不同，给它们适宜的生活条件，或加入某种抑制剂造成只利于该菌种生长，不利于其他菌种生长的环境，从而淘汰不需要的菌种。

分离微生物常用的方法有稀释平板分离法和划线分离法。

最终目的是要在培养基上出现欲分离微生物的单个菌落，并加以进一步地分离纯化从而得到纯的菌株[10]。

本实验采用的是平板分离法，其是普遍用于微生物的分离与纯化的方法。

通过平板分离法，对不同的培养基所形成的菌落形态进行观察，发现许多菌落呈现的颜色、形态、透明程度，均有所不同，从而为进一步的纯化试验做好准备。

3.3微生物的稀释平板计数的讨论

微生物的稀释平板计数是根据在固体培养基上所形成的一个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成，且肉眼可见的子细胞群体这一生理及培养特征进行的[11]。

也就是说一个菌落即代表一个单细胞。

计数时，首先将待测样品制成均匀的一系列不同稀释液，并尽量使样品中的微生物细胞分散开来，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个菌），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。

经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。

从本次试验的菌落计数的结果来看，每种平板中的菌落数值均较大，由此可见根际微生物种类繁多和数量较大。

3.4对于本次试验优点、不足和收获的总结

3.4.1本次试验优点

（1）为了试验的成功，我们查阅大量的相关文献并及时和老师们取得沟通；

（2）为了保证接种的成功，所用器具和培养基进行彻底灭菌并且接种也在无菌条件（即酒精灯火焰旁）下进行操作且接种操作时管尖不能接触液面，每接一个稀释度换一个已灭菌的移液枪尖，以防止所接菌种被杂菌污染和不同稀释度交叉干扰；

（3）为了取得试验分离菌种最好的效果，我进行3次重复的预试验，并遵守实验设计的基本准则：

重复、随机、对照;

3.4.2本次试验的不足之处

由于经验不足，操作的不正确，导致实验数据出现一定的误差。

3.4.3本次试验的收获

虽然由于本次试验经费的不够导致不能进行进一步地当归根尾土中微生物的分离纯化，但是我还是学习并掌握了微生物的分离技术操作过程。

通过稀释平板分离法对当归根尾土中的微生物进行分离、菌落特征的描述和计数。

通过对细菌、真菌、放线菌的种类和菌落数量的比较，让我对当归根尾土中微生物多样性有了进一步的了解与认识。

通过实践，巩固了理论知识，为以后的学习和工作打下了坚实的基础。

参考文献

[1]中国药典.一部[S].2005:

89.

[2]陆雅海,张福锁.根际微生物研究进展[J].土壤,2006,02:

113-121.

[3]肖艳红,李菁,刘祝祥,李佑稷,李贵,龙华.药用植物根际微生物研究进展[J].中草药,2013,04:

497-504.

[4]RileyD,BarberSA.BocarbonateaccumulationandpHchangesatthesoybeanroot-soilinterface[J].SoilScienceSocietyofAmericaJournal,1969,33:

905～908.

[5]RileyD,BarberSA.Saltaccumulationatthesoybeanrootsoilinterface[J].Soil

ScienceSocietyofAmericaJournal,1970,34:

154～155.

[6]周德庆.微生物学实验教程第2版[M].高等教育出版社,372.

[7]许光辉,邓洪元.土壤微生物分析方法手册[M].北京:

农业出版社,1986.

[8]吴佳徽.黄栌林土壤微生物多样性研究[D].北京林业大学,2011.

[9]HartmannA,SchmidM,WenzelW,HinsingerPh.Rhizosphere2004-PerspectivesandChallenges-ATributetoLorenzHiltner.Munich,Germany:

GSF-NationalResearchCenterforEnvironmentandHealth,2005.

[10]赵斌,何绍江.微生物学实验[M].北京:

科学出版社,23.

[11]赵斌,何绍江.微生物学实验[M].北京:

科学出版社,36

致谢

本论文是在导师老师的亲切关怀和悉心指导下完成的。

从论文的选题，实验设计到整个实验过程，以及学习、生活等各个方面，老师始终给予我耐心细致的指导和无私的帮助，使我在理论知识水平、实验技能和分析问题、解决问题的能力等方面有了显著的提高。

老师严谨的治学态度和对科学不懈追求的精神，使我深受教益。

在此，谨向老师致以最诚挚的谢意！

论文的实验部分是在校内的农学楼的中草药标本室完成的，期间得到了导师和农学院老师的大力支持。

在试验和论文制作过程中，许多人给予了我热情的帮助和支持，值此论文完成之际特别感谢导师张老师、郭凤霞老师以及与我做同一个课题的同组同学。

同时，还要感谢生命科学技术学院曾教导过我的老师，老师们的谆谆教诲将是我今后学习和工作的动力。

多年的求学生涯无不蕴含着亲情的温暖与关怀，在此也向我的家人、朋友和舍友表示衷心的感谢，是他们从精神和物质上给予我鼓励和支持，才使我得以顺利地完成学业。

2年5月

附录

菌落的计数原则

在计数过程中，选菌落分散、菌落数适量且各平行皿菌落数接近的稀释度的平皿计数，通常细菌和放线菌选取菌落数在30～300之间的平皿，霉菌选菌落数在10～100之间的平皿，最后换算成每克当归根尾土中所含菌数。

当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。

如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。

当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。

再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。

计数原则：

选平均菌落数在30~300之间者进行计算

①仅1个稀释度的平均菌落数在此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数报告之。

②若有2个稀释度的平均菌落数在30~300之间时，则按两者的菌落总数之比来决定，若比值小于2应报告两者的平均数；若大于2则报告其中较小的菌落总数。

③若所有稀释度的平均菌落数均大于300，以稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

④若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

⑤若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

⑥若所有的菌落数匀为“无法计数”时，应注明水样的最大稀释倍数。

⑦在求同稀释度的平均数时，若其中1个平板上有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。

若片状菌落约为平板的一半，而另一半平板上菌落分布很均匀，则可按半平板上的菌落计数然后乘以2作为整个平板的菌落数。