PI3KAKT信号通路在ARC保护细胞氧化损伤中的作用机制研究.docx
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PI3KAKT信号通路在ARC保护细胞氧化损伤中的作用机制研究
分类号:
密级:
华中农业大学硕士学位论文
P13K/AKT信号通路在ARC保护细胞氧化损伤中的
作用机制研究
T胍卫皿CI{全ⅡSMSOFP13K以气】匿了SIGNAI,INGPATl|WAYIN
ARCPROTECTSCELLSFROMOXIDATIVEIN贝瓜Y
研究生:
夏田
学号:
2012302110206
指导教师:
郭定宗
指导小组:
郭定宗教授
李家奎教授丁明星教授邓干臻教授周东海副教授杨世锦高级工程师
专业:
临床兽医学研究方向:
动物营养代谢病
获得学位名称:
农学硕士获得学位时间:
2015年6月15日
华中农业大学动物医学院
二零一五年六月
万方数据
本论文承蒙高等学校博士学科点专项科研基金资助;编号“20100146110001"
万方数据
华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书
学位论文
否如需保密,解密时闻年月霞
是否保密
独创性声明
本人声明所黑突翡论文是我个人程导簿指导下送行的研究工作及取得翡谚究成果。
尽我所知,除了文申特别加以标注和致谢的地方终,论文中不包含葜拖人已经发袭或撰写过的研究成果,也不包含为获得华中农业大学戴葜德教育规稳的学位或证书弼使用逶的材料,指导教蜉趱此遴行了审定。
与我一禹王俸魏夏恋对本研究所做的任何贡献均巳在论文申徽了明确的说明,并表示了谢意。
研究生张/趾3慨知s年z月棚
学位论文使用授权书
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注:
保密学位论文(即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论文)在解密后适用于本授权求。
剃阮傀t毯锄张新诲
签名圜期:
文务心年6月//豳签名露期:
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注:
请将本表巍接装订在学位论文的赡燹jf【;醚袋之闻
万方数据
P13K/AKT信号通路在ARC保护细胞氧化损伤中的作用机制研究
摘要一i
Abstract........ii
英文缩略表iv
第一章P13K/AKT信号通路研究进展.1
1.1P13K/AKT信号通路发现简史l
1.2P13K/AKT的结构组成1
1.2.1P13K/AKT的蛋白结构.1
1.2.2AKT的变体2
1.2.3AKT的分布2
1.3P13K/AKT信号通路的活化3
1.4P13K/AKT的生物学功能3
1.4.1细胞增殖3
1.4.2细胞糖代谢4
1.4.3细胞保护4
1.5P13K/AKT信号通路与肿瘤疾病5
1.5.1AKT与肿瘤增殖6
1.5.2AKT与肿瘤细胞凋亡6
1.5.3AKT与肿瘤迁移6
1.6P13K/AKT信号通路与心脏疾病7
第二章ARC研究进展8
2.1ARC发现简史一8
2.2ARC的定位..8
2.3ARC结构9
2.4ARC与肿瘤疾病10
2.4.1ARC在肿瘤组织以及肿瘤细胞系的定位.10
2.4.2ARC在肿瘤组织以及肿瘤细胞系的生物学功能.10
2.5ARC与心脏疾病11
2.6ARC转录以及翻译后修饰12
2.7ARC抗凋亡的分子机制12
万方数据
华中农业大学2015届硕士研究生学位(毕业)论文
第三章鸡胚心肌细胞分离培养研究..14
3.1研究背景.14
3.2材料与方法.14
3.2.1实验材料..14
3.2.2实验药品..14
3.2.3实验仪器..15
3.2.4原代鸡胚心肌细胞分离培养方法..15
3.2.5Hela,293T细胞传代培养..16
3.2.6心肌细胞的形态学观察..16
3.2.7免疫细胞化学染色鉴定..16
3.3结果.17
3.3.1原代鸡胚心肌细胞培养的形态学观察..17
3.3.2原代鸡胚心肌细胞免疫细胞化学染色鉴定..18
3.3.3原代鸡胚心肌间接免疫荧光鉴定..18
3.3.4Hela,293T细胞传代培养..19
3.4讨论.19
第四章ARC真核表达质粒的克隆与构建..2l
4.1研究背景.21
4.2材料与方法.22
4.2.1实验动物..22
4.2.2实验材料..22
4.2.3实验仪器..22
4.2.4ARC基因的克隆..23
4.2.5真核表达质粒P.IRES2.ARC.EGFP构建..25
4.2.6大肠杆菌感受态的制备..26
4.2.7真核表达质粒P.IRES2.ARC.EGFP转化..27
4.2.8真核表达质粒P.IRES2.ARC.EGFP鉴定..27
4.2.9真核表达质粒P.IRES2.ARC.EGFP、PEGFP.N1中提27
4.3结果28
4.3.1ARC基因的克隆与鉴定..28
4.3.2采用菌落PCR鉴定真核表达质粒P.IRES2.ARC.EGFP.28
II
万方数据
P13K/AKT信号通路在ARC保护细胞氧化损伤中的作用机制研究
4.3.3采用双酶切鉴定真核表达质粒P.IRES2.ARC.EGFP一29
4.3.4采用测序方法鉴定真核表达质粒P.IRES2.ARC.EGFP一30
4.3.5真核表达质粒P.IRES2.ARC.EGFP提取.30
4.4讨论31
第五章P13K/AKT信号通路在ARC保护细胞氧化损伤中的作用机制研究32
5.1研究背景32
5.2材料与方法33
5.2.1实验材料.33
5.2.2原代鸡胚心肌细胞培养.34
5.2.3Hela,293T细胞传代培养.34
5.2.4H202诱导细胞氧化损伤模型的建立.34
5.2.5细胞活力检测.35
5.2.6真核表达质粒P-IRES2一ARC.EGFP转染方法及步骤.35
5.2.7真核表达质粒P.IRES2.ARC—EGFP转染效率检测.36
5.2.8实时荧光定量PCR.38
5.2.9蛋白免疫印迹.39
5.2.10数据分析39
5.3结果39
5.3.1原代鸡胚心肌细胞培养.39
5.3.2Hela,293T细胞传代培养.40
5.3.3H202诱导细胞氧化损伤模型的建立.40
5.3.4真核表达质粒P—IRES2.ARC.EGFP转染效率检测.42
5.3.5ARC保护细胞氧化损伤.45
5.3.6P13K/AKT信号通路47
5.4讨论54
5.4.1ARC保护细胞氧化损伤.54
5.4.2P13K/AKT信号通路保护细胞氧化损伤55
5.4.3P13K/AKT信号通路与ARC保护细胞氧化损伤的作用机制.56
参考文献58
附录:
溶液配制72
致谢.75
ⅡI
万方数据
P13K/AKT信号通路在ARC保护细胞氧化损伤中的作用机制研究
摘要
P13K/AKT信号通路的激活可保护细胞免受外来刺激以维持机体稳态的构建。
ARC(a是目前唯一一个已知的
具有抗.a.a绅内。
源pt性os以is及rep外re源sso性r凋wi亡th的ac蛋asp白a,se机rec体ru受itm不e利nt因do素ma刺in激)时其表达量增高;ARC蛋白的活化为高度分化的心肌,骨骼肌等终末细胞以及肿瘤细胞提供保护。
目前,ARC发挥其保护作用的信号转导机理仍然不清楚;P13K/AKT信号通路是否介导ARC发挥其生物学效应尚未有文献报道,其相关作用机理有待进一步研究。
通过体外培养原代鸡胚心肌细胞,Hela以及293T细胞系;选择不同浓度H202作用于三种细胞以建立体外氧化损伤模型;运用基因工程技术构建真核表达质粒P。
IRES2.ARC.EGFP;转染该质粒于原代鸡胚心肌细胞、Hela以及293T细胞;运用CCK-8法以及PI染色法评估细胞活力以证实ARC的过表达是否保护细胞免受氧化损伤;Westemblot检测ARC、P.AKT以及P53蛋白的表达;Real.TimePCR半定量P13K、AKT以及P53基因的相对表达量;以此鉴定细胞氧化损伤模型下P13K/AKT信号通路的激活以及相关基因的作用关系。
应用P13K阻断剂LY294002抑制P13K/AKT信号通路的激活证明在细胞氧化损伤模型下P13K/AKT信号通路是否介导ARC保护细胞氧化损伤。
结果显示:
原代鸡胚心肌细胞、Hela细胞氧化损伤模型下P13K以及AKT基因以及P.AKT蛋白呈现高表达;但293T细胞P.AKT蛋白表达量不变;证明在原代鸡胚心肌细胞、Hela细胞氧化损伤模型下P13K/AKT信号通路的激活;抑制该信号通路明显降低原代鸡胚心肌细胞、Hela细胞活力;Hela以及293T细胞过表达ARC为其提供保护;但ARC的过表达未能保护原代鸡胚心肌细胞氧化损伤;LY294002抑制P13K/AKT信号通路的同时,ARC为Hela细胞提供保护;在293T细胞氧化损伤模型下,P53蛋白以依赖于H202作用剂量以及时间的形式呈现高表达,ARC过表达抑制293T细胞活力的下降。
综合以上结果得出:
在
氧化损伤模型下,ARC蛋白过表达或者P13K/AKT的激活可提供保护;ARC发挥其
生物学效应不依赖于P13K/AKT信号通路的激活。
本实验推测293T细胞过表达ARC抵抗氧化损伤可能是由于ARC发挥内源性抗凋亡功能从而抑制P53所启动的内源性凋亡途径。
关键词:
ARC;P13K;AKT;P53;信号通路;鸡胚心肌细胞
万方数据
华中农业大学2015届硕士研究生学位(毕业)论文
Abstract
P13K/AKTsignalingpathwayasapro-survivalsignalingpathway,activationofthesignalingpathwaymayprotectcellsagainstexternalstimuliinordertomaintainthehomeostasis.ARC(apoptosisrepressorwithacaspaserecruitmentdomain)istheonlyknownfactorinitsantagonismofbothextrinsic(deathreceptor)andintrinsic(mitochondrial/ER)apoptosispathways.WhileARCexpressionis,forthemostpart,limitedtoterminaldifferentiatedorcancercells,itengagespro-survivalsignaling
pathwayscommontonon-myogenic,non-neurogenichumancells.Atpresent,the
mechanismofsignaltransductionofARCexertsitsprotectiveeffectremainsunclear.
WhetherARCexertedthebiologicaleffectswasmediatedbyP13K/AKTsignalingpathwayhavenotbeenreportedbefore.TheoxidativeinjurymodelestablishedbydifferentconcentrationsofH202wasusedinprimarychickenembryoniccardimyocytes,
Helaand293Tcells.ARCwassubclonedintoP-IRES2一EGFP,thentheP-IRES2.ARC.EGFPplasmidwastransfectedintochickenembryoniccardimyocytes,Helaand293Tcells.CCK.8andPIstainingwereusedtoassesscellviabilityinorderto
demonstratewhetheroverexpressionofARCcanprotectthecellfromoxidativeinjury.
P13K,AKT.1andP53mRNAofthecellsweredetectedbyReal-TimePCR·PhosphorlatedAKT,ARCandP53proteinweredetectedbyWesternblot.ThespecialP13KinhibitorLY294002treatmentwasusedtoexploretheeffectofARCprotectscells
fromoxidativeinjurywasmediatedbyP13K/AKTsignalingpathway?
Theresultsshowedthat:
P13KandAKTmRNAandphosphorlatedAKTproteinofchickenembryoniccardimyocytes,Helacellsinducedbyoxidativeinjurywerehighlyexpressed;butthephosphorlatedAKTproteinexpressionwasunchangedin293Tcells.ThecellviabilitywassignificantlyreducedinthetreatmentofLY294002.OverexpressionofARCprotectedHelaand293Tcells,butnotchickenembryoniccardimyocytesfromoxidativeinjury,andthesurvivaleffectwasindependentofP13K/AKTsignalingpathwayinHelacells.TheupregulationofP53proteinin293Tcellsunderoxidativeinjurymodel
11
万方数据
P13K/AKT信号通路在ARC保护细胞氧化损伤中的作用机制研究
inatimeanddosedependentmannerandARCmaintained293Tcellviabilityinthissituation.Basedontheaboveconclusions,ARCproteinorP13K/AKTmayprovideaprotectiveeffectintheoxidativeinjury.ARCexertedthebiologicaleffectwasnotdependentontheactivationofP13K/AKTsignalingpathway.OverexpressionofARCagainstoxidativedamagemaybeduetoendogenousARCexecsanti-apoptoticfunctiontoinhibitendogenousapoptosispathwayinitiatedbyP53.
Keywords:
ARC;P13K;AKT;P53;signalingpathway;chickenembryonic
cardimyocytes
111
万方数据
华中农业大学2015届硕士研究生学位(毕业)论文
英文缩略表
缩略词英文全称中文全称
lV
万方数据
P13K/AKT信号通路在ARC保护细胞氧化损伤中的作用机制研究
第一章P13K/AKT信号通路研究进展
1.1P13K/AKT信号通路发现简史
1977年Staaletal从自发性淋巴瘤的AKR老鼠里分离到了AKT8白血病病毒,并克隆AKT8病毒的部分衍生性序列以此命名为AKT(Staaletal1977)。
AKT8病毒在体外可侵袭细胞,并且接种AKT8病毒的老鼠发展为淋巴肿瘤,特证明AKT可能是一个潜在的致癌基因:
在人的胃肠癌组织检测到AKTl基因呈现高表达,再次证明其在肿瘤疾病中可能扮演着与之相关的生物学角色(Staaletal1987)。
早期的科学家们认识到磷酸肌醇的生物学功能是作为细胞表面第二信使;20世纪80年代的研究发现磷酸肌醇与多瘤病毒T抗原pp60卜眦andpp68卜硒有相互联系(Whitmanetal1985)。
磷酸肌醇酶的活性与相关酪氨酸激酶作用使其自身羟基位点磷酸化生成磷脂酰3磷酸肌醇(phosphatidylinosit01.3-phosphate,PIP3)(Augeretal1989)。
AKT的激活可被P13K(phosphatidyrlinositol3-kinase)抑制剂渥漫青霉素
(Wortmannin)以及PNl7Ras阻断,而P13K诱导AKT的激活,从而证明AKT为P13K的下游底物(Frankeetal1995)。
在20世纪90年代,科学家们逐渐认识到P13K在细胞有丝分裂、细胞生存、细胞骨架重构以及细胞能量代谢等方面发挥着重要的生物学功能(Wymannetal1998)。
1.2P13虬/AKT的结构组成
1.2.1P13K/AKT的蛋白结构
P13K是由催化亚单位pll0和调节亚单位p85所组成的二聚体蛋白(Cameronetal2007)。
定位于细胞膜表面的受体酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase,RTK)与P13K的P110tx、11013、p1108亚基结合激活P13K,而p110v由G蛋白偶联受体P101
调节亚基募集激活(Bos1995)。
AKT(proteinkinaseB,PKB)属于丝氨酸苏氨酸蛋白激酶家族成员,分子量为60KD,其结构与蛋白激酶A有68%的同源性,与蛋白激酶C有73%的同源性,因此又称为与蛋白激酶A/C相关的蛋白激酶(relatedto
theAandCproteinkinase,RAC.PK);为避免与鸟苷三磷酸酶GTPases的Rac重复,又名PKB(Jonesetal1991;Wymannetal1998)。
AKT蛋白的1.106位氨基酸为普
万方数据
华中农业大学2015届硕士研究生学位(毕业)论文
列克底物蛋白(pleckstrinPH)同源结构域:
第1.147位氨基酸为AKT结构域(AKThomology,AH),其主要涉及下游复杂信号转导调节;第148.411氨基酸构成激酶活化区,其内包含一个保守的苏氨酸位点(Thr308);第412-480氨基酸构成C末端调节区,富含疏水氨基酸和脯氨酸,可以和SH3区(srchomology3Domain)结合,其内包含一个保守的丝氨酸位点(Ser473);Thr308、Ser473位点磷酸化是AKT活化所必需的(Dattaetal1995)。
1.2.2AKT的变体
在哺乳动物体内AKT编码三种高度同源的AKT变体:
AKTa、AKT[3、AKT?
(AKTl、AKT2、AKT3)。
三种AKT变体在体内发挥着重要的生物学功能;例如:
体内AKTl基因的删除导致老鼠躯干发育受到限制以及其体内血糖代谢紊乱(Choetal2001a);而AKT2敲除的小鼠能够正常生长,但机体血糖代谢紊乱,并且其肝脏以及肌肉表现出明显的胰岛素抵抗效应(Choetal2001b)。
2004年Georgeetal在
高加索人群的胰岛素敏感性组织中鉴定出了含错义突变的AKT2基因,该基因编码的274位精氨酸突变为组基酸(R-H)导致AKT2的催化结构域构象改变从而影响其下游作用底物的催化活性;体外酶活性的实验证明:
其位点的突变直接抑制位于AKT2下游的葡萄糖合成激酶(glycogensynthasekinase,GSK)活性(Georgeetal
2004)。
而AKT2与AKT3基因的删除对大脑发育分化有显著影响,并且机体表现
为糖代谢紊乱,伴随严重的生长缺陷;AKTl与AKT2的删除,诱发多种生理发育缺陷,例如神经以及心血管系统发育障碍(Dummleretal2007)。
然而,Taniyamaetal发现在心肌内特异性过表达AKT3的转基因小鼠其表现为心肌恶性肥大;在生长第4.12周心肌收缩正常并且抵抗阿霉素(doxorubicin)的刺激,其仍然表现为较高的生存活力;但在第20周转基因小鼠心脏明显恶化,不足以抵抗doxorubicin的刺
激(Taniyamaetal2005)。
1.2.3AKT的分布
AKT主要分布在细胞胞浆。
早在1991年Coffer与Woodgett运用Northemblot检测到大多数组织均有AKTmRNA的分布,尤其在心脏、肺脏、脑部呈现高表达(Coffereta11991)。
相对AKTl或者AKT2而言,AKT3的分布相对受限制;其主
万方数据
P13K/AKT信号通路在ARC保护细胞氧化损伤中的作用机制研究
要在脑部以及睾丸呈现高表达,在心脏、脾脏、肺脏、骨骼肌表达相对较低(Coffer
etall998)。
1.3P13K/AKT信号通路的活化
之前的研究已经初步阐明了P13K/AKT信号激活的分子机$|J(Sugden2003;Lietal2007oAKT位于P13K下游,其以依赖于P13K激酶的形式激活(Alessietal1998)。
P13K/AKT信号通路的激活在于胞膜配体与受体的结合:
激素、细胞因子、整合素、多肽或者小分子导致细胞膜受体的磷酸化,RTK或者G蛋白偶联受体的构象改变;位于细胞膜激活的受体与P13K的P85.SH2结构域结合形成复合物;RTK募集P13K的P1lOot、11013、p1108亚基并激活P13K,而p1101,由G蛋白偶联受体
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- PI3KAKT 信号 通路 ARC 保护 细胞 氧化 损伤 中的 作用 机制 研究