水稻转基因实验技术手册.docx
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水稻转基因实验技术手册
水稻转基因实验技术手册
遗传工程实验室
GeneticEngineeringLaboratory
DisciplineofCropGeneticsandBreeding
FujianagriculturalandForestryUniversity
目录
第一章DNA提取与纯化
第二章引物设计与PCR
第三章感受态细胞制备与转化(E.coli&农杆菌)
第四章电泳技术、琼脂糖凝胶DNA回收
第五章质粒回收
第六章RT-PCR
第七章构建载体
互补实验
过量表达
GFP
GUS
RNAi
第八章水稻组织培养
第九章原位杂交
第十章石蜡切片技术
第十一章扫描电子显微镜
附录:
第一章SDS-DNA微量提取法
1、取新鲜叶片5cm左右于1.5ml离心管中,加入液氮研磨(电钻)。
2、加入700μl预热至65℃的SDS抽提液,迅速搅匀后置于65℃水浴30min。
3、加入200μl5MKAc,颠倒混匀,-20℃冰浴30min后,10,000rpm离心5min,将上清夜倒入另一新的1.5ml离心管中。
注:
若溶液中仍有植物组织,可进行二次离心。
4、加入等体积的异丙醇(700μl),-20℃冰浴30min,11,000rpm离心5min。
5、弃上清,加入70%乙醇清洗液晾干。
6、将风干的DNA溶于100μlTE溶液中,55℃水浴溶解1h,再室温放置1d。
实验准备:
溶液配制:
SDS-抽提液:
1MTris-HCl:
100ml
5MNaCl:
100ml
0.5MEDTA:
100ml
10%SDS:
125ml
TE(pH8.0):
1MTris-HCl(pH8.0):
5ml
0.5MEDTA(pH8.0):
1ml
第二章PCR
PrimeSTARHSDNAPolymerasewithGCBuffer&TaKaRaLATaqwithGCBuffer
PCR体系和程序
第四章琼脂糖凝胶DNA回收
*第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇
1、在长波紫外下,用干净刀片将所需回收的DNA条带切下,尽力切除不含DNA的凝胶,得到凝胶体积越小越好。
2、将切下含有DNA条带凝胶放入1.5ml离心管,称重。
注:
先称一个空1.5ml离心管重量,然后放入凝胶块后再称一次,两次重量相减得到凝胶的重量。
3、加3倍体积溶胶/结合液DB。
如果凝胶重为0.1g,其体积可视为100μl,则加入300μl溶胶液;
如果凝胶浓度大于2%,应加入6倍体积溶胶液,凝胶块最大不能超过400mg,如果超过400mg,请用多个离心柱进行回收。
4、56℃水浴10min(直至完全溶解,每2-3min涡旋震荡一次帮助加速溶解。
)
注:
时间可延长,溶解更彻底。
5、每100mg最初的凝胶重量加入150μl的异丙醇,震荡混匀。
注:
加入异丙醇可以提高回收率,加入后不离心,回收大于4Kb的片段可不加异丙醇,加入有时反而可能降低回收效率。
6、将上一步所得溶液加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中),12,000rpm离心30-60s,倒掉收集管中的废液。
注:
如果总体积超过750μl,可分两次将溶液加入同一个吸附柱AC中。
7、加入700μl漂洗液WB(先检查是否已加无水乙醇),12,000rpm离心1min,弃掉废液。
8、加入500μl漂洗液WB,12,000rpm离心1min,弃掉废液。
9、将吸附柱AC放回空收集管中,12,000rpm离心2min,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
10、取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加入50μl洗脱液缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中加热效果更好),室温放置2min,12,000rpm离心1min,如果需要较多量DNA,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,离心1min。
注:
放置室温时间可延长至5-10min,离心时间可延长至2min。
洗脱液体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于30μl,体积过小会降低DNA洗脱效率,减少产量。
第五章质粒提取
1、取1.5ml菌液放入离心管(1.5ml),菌体少,可重复加入菌液
12,000rpm离心1min室温
2、去上清,倒扣于卫生纸上,用力扣出培养液,尽量去除上清
3、加入120μlSolI(预冷),涡旋悬浮,冰浴3min
SolutionI:
50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris.Cl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0)。
溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15min,储存于4℃冰箱。
4、加入240μlSolⅡ,碱变性时间3-5min,盖紧盖子,柔和颠倒5次,置于冰上1-2min,不宜过长。
SolutionⅡ(2%SDS:
0.4MNaOH=1:
1现配现用(预冷))
5、加入180μl预冷的SolⅢ,温和颠倒5次(10s),5min
SolutionⅢ:
5mol/LKAc60ml,冰醋酸11.5ml,H2O28.5ml,定容至100ml,并高压灭菌。
溶液终浓度为:
K+3mol/L,Ac-5mol/L。
12,000rpm离心5min
6、将上清移入新管
7、加等量(500μl)的Tris平衡酚:
氯仿(1:
1)(现配现用,有毒,戴手套),振荡混匀
注:
吸取Tris平衡酚溶液时,要吸下层黄色液体。
4℃,12,000rpm离心3min
8、用移液器吸取上清液(最上一层)400μl-500μl(450μl)
9、加2倍体积(900μl)无水乙醇(-20℃预冷),振荡混合,室温放置30min以上,越久越好(40min-60min)
10、倒出上清,倒扣于纸上(须除尽液滴,否则影响酶切)
11、用1ml70%EtOH,漂洗
12,000rpm4℃,离心3min
12、去上清,超净工作台上风干0/N
13、加入15μl(RNase+ddH2O)MIX(含RNase20μg/ml),37℃水浴溶解30min
质粒提取实验准备
质粒抽提试剂
RNaseA:
10mg/ml溶于TE中,在沸水中煮10-30分钟之后分成小份储存于-20℃
pMD-18T载体连接体系
SolutionI:
5μl
T-vectorSample:
1μl
PCR产物:
4μl
Total:
10μl
注:
若扩大体系,solutionI的比例不变,T-vectorSample减少,PCR产物增加
例:
15μl体系
SolutionI:
7.5μl
T-vectorSample:
1μl
PCR产物:
6.5μl
Total:
15μl
注释:
平末端产物加A
体系60μl
ExBuffer:
6μl
dATP:
5μl
Ex:
1μl
PCR产物:
30μl
ddH2O:
18μl
程序:
72℃30min
注释:
双酶切体系
参考体系50T1302
DNA30μl→40→30
BglⅡ1μl→1.5→1.5
SpeI1μl→1.5→1.5
10×Buffer5μl→4.7→3.7
ddH2O13μl→0→0
37℃反应6h,产物于1.0%琼脂糖凝胶检测回收DNA
注释:
表达载体与目的基因连接
10×T4DNALigaseBuffer:
2.5μl
DNA片段:
约0.3pmol
载体DNA:
约0.03pmol
T4DNALigase:
1μl
dH2Oupto25μl
16℃过夜反应→加入2.5μl(1/10量)的3MCH3COONa(pH5.2)→加入62.5μl
注释:
DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3-10倍,平滑末端的载体与DNA片段进行连接时,应首先将载体进行去磷酸化处理,以防止其自身环化。
第三章感受态细胞制备与转化(E.coli&农杆菌)
CaCl2制备感受态细胞(DH5α、DH10B、TOP10)
1、前夜挑单菌落E.coli于20mlLB液体培养基中,37℃,150-160rpm振荡培养过夜
2、取0.3ml过夜培养的菌液接种于30ml液体LB培养基中,37℃,150-160rpm振荡培养2.5-3h
3、将0.1MCaCl2溶液置于冰上预冷,以上步骤在超净工作台和冰上操作
4、吸取1.4ml培养菌液至1.5ml离心管中,在冰上冷却15min
5、4℃,5,000rpm离心10min
6、弃上清,加入100μl预冷的CaCl2溶液,用移液器轻轻上下吸打悬浮,然后冰上放置30min
7、4℃,5,000rpm离心10min
8、弃上清,加入100μl预冷的CaCl2溶液(含15%-20%甘油),用移液器轻轻上下吸打悬浮
9、-70℃冰箱保存备用
转化E.coli
预备实验:
开紫外(20min)、水浴锅(42℃)、将800μlLB分装于1.5ml离心管(37℃预热)
实验步骤:
1、从-70℃冰箱中取出一管感受态细胞,用体温融化,冰浴10min
2、取100μl感受态细胞+5μl连接产物,轻弹
冰浴20min→42℃热击60—90s→冰浴1-2min
3、全部移入37℃温浴的800μlLB中,摇菌160-170rpm,70min
4、将摇好的菌离心(11,000rpm,1min),倒出上清液,留约100μl上清液,用移液器打匀后进行涂布于LB平板(含100μg/mlAMP),37℃,O/N
5、摇菌:
挑2-3个阳性克隆,接于20-30mlLB培养基+20-30μlAMP(100mg/ml),150-250rpm振荡培养8-10h
6、收集菌体,分装保存
7、菌液PCR检测阳性克隆+阳性对照(含目的序列的模板)+阴性对照(用水替代菌液)
实验准备:
0.1mol/LCaCl2溶液:
称取0.54gCaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
含15%甘油的0.1mol/LCaCl2:
称取0.54gCaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。
Amp(100mg/ml):
1gAmp溶于4ml去离子灭菌双蒸水中,定容至5ml,-20℃保存
LB液体培养基
LB平板和LB+AMP平板
农杆菌感受态制备
1、挑取单菌落接种于5ml含rif的YEB液体培养基中,28℃,振荡摇菌培养O/N
2、取2ml(2-5ml)以上种子液转入50mlYEB液体培养基中(含rif),继续培养5-6h
3、转入无菌离心管,冰浴30min
4、4℃,5,000rpm离心5min,弃上清
5、加入200-300μl20mMCaCl2溶液悬浮,并用移液器吸打混匀
6、4℃,5,000rpm离心5min,弃上清
7、加入200μl20mMCaCl2溶液悬浮,可4℃保存过夜后使用或添加冷冻保护剂-70℃贮存备用。
转化农杆菌
1、取5μl(2μl)纯化的重组质粒DNA(连接号的产物)与制备的感受态细胞(100μl)混合
2、冰浴20min,转入液氮冷冻(1-5min)或-70℃(5-10min)后,迅速置于3
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