免疫共沉淀详细步骤.docx

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免疫共沉淀详细步骤

免疫共沉淀详细步骤（总8页）

免疫共沉淀详细步骤

实验原理

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。

如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的proreinA就能吸附抗原达到精制的目的。

这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为：

（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；

（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

缺点为：

（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；

（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

实验试剂

1.RIPABuffer配制：

基础成分：

Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性）

NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集）

NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液）

去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存）

注意：

准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200mM的储存液，室温保存）

EDTA（钙螯合剂；用H2O配制成100mM的储存液，PH7.4）

亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）

抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）

胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）

RIPA磷酸（酯）酶抑制剂

激活的Na3VO4（用H2O配制成200mM的储存液，见SodiumOrthovanadateActivationProtoco）

NaF（200mM的储存液，室温保存）

注意：

在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂

2.工作液配制：

配制100ml的modifiedRIPAbuffer：

  1）称取790mg的Tris-Base，加到75ml去离子水中，加入900mg的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4

  2）加10ml10%的NP-40

  3）加2.5ml10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清

  4）加1ml100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存

  5）理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂各100μl；PMSF，Na3VO4，NaF各500μl），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。

各种成分在工作液中的终浓度：

   Tris-HCl：

50mM，pH7.4

   NP-40：

1%

   去氧胆酸钠：

0.25%

   NaCl：

150mM

   EDTA：

1mM

   PMSF：

1mM

   抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂：

各1μg/ml

   Na3VO4：

1mM

    NaF：

1mM

实验步骤

准备工作：

预冷PBS，RIPABuffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机

1.用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；

2.加入预冷的RIPABuffer（1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶）；

3.用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）；

4.4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中；

5.准备ProteinAagarose，用PBS洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠；

6.每1ml总蛋白中加入100μlProteinA琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景；

7.4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除ProteinA珠子；

8.（Bradford法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：

10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）；

9.用PBS将总蛋白稀释到约1μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10μg/μl）；

10.加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异；

11.4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2h室温孵育；

12.加入100μlProteinA琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃

缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）；

13.14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPAbuffer洗3遍，800μl/遍，RIPAbuffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS；

14.用60μl2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60μl足够上三道）；

15.将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。

实验流程为：

1.转染后24-48h可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min，细胞裂解液于4°C，最大转速离心30min后取上清；

2.取少量裂解液以备Westernblot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；

3.取10μlproteinA琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3，000rpm离心3min；

4.将预处理过的10μlproteinA琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与proteinA琼脂糖珠偶连；

5.免疫沉淀反应后，在4°C以3，000rpm速度离心3min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟；

6.SDS-PAGE，Westernblotting或质谱仪分析。

通过免疫共沉淀确定结合蛋白

  1）用磷酸盐缓冲液洗30块10cm培养板上的适宜细胞。

刮去每块板上的细胞到1ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。

  2）将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃以最大速度离心15min。

  3）收集上清（约30ml）并加入30μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1h。

  4）加入0.9ml的蛋白质A-Sepharose悬液，4℃摇动免疫沉淀物30min。

  5）用含900mmol/LNaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。

最后，用NETN洗一次。

  6）吸出混合物的液体部分。

加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4min。

  7）将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10mA的恒定电流下电泳过夜。

  8）通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

  9）从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml50%乙腈洗两次，每次3min。

  10）用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。

  11）通过窄孔高效液相色谱分离肽。

将收集的肽在ABI477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

注意事项

1.细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或TritonX-100）。

每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。

不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS），细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。

2.使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用

3.使用对照抗体：

单克隆抗体：

正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体：

正常兔IgG

4.在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意以下几点：

  1）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；

  2）要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；

  3）确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。