kiyik河胡杨内生细菌多样性分析及一株潜在新种的多相分类学鉴定大学学位论文.docx

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kiyik河胡杨内生细菌多样性分析及一株潜在新种的多相分类学鉴定大学学位论文

硕士研究生学位论文

新疆大学

论文题目（中文）：

Kiyik河胡杨内生细菌多样性分析及一株潜在新种的多相分类学鉴定

论文题目（外文）：

DiversityofEndophyticBacteriafromthePopuluseuphraticainkiyikancientriverandtaxonomicidentificationofanovelbacterium

研究生姓名：

布阿依夏姆·阿木提

学科专业：

生物学

研究方向：

微生物学

导师姓名职称：

艾尔肯·热合曼教授

论文答辩日期2013年5月24日

学位授予日期年月日

MagisterialThesis

DiversityofEndophyticBacteriafromthePopuluseuphraticainkiyikancientriverandtaxonomicidentificationofanovelbacterium

MasterDegreeCandidate:

BuayshemHamood

Mentor:

Prof.ErkinRahman

CollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity

摘要

本研究对位于塔里木河中游废弃343年的古河道胡杨林胡杨茎秆液进行可培养内生细菌的多样性分析。

三颗胡杨茎秆液混合之后采用常规培养法分离得到80株纯培养物。

其中25株从LB培养基，21株从NB培养基，16株从KB培养基而18株从MA培养基所分离到的。

有32株杆状，45株短杆状和3株球状，17株革兰氏阳性，63株革兰氏阴性细菌。

表型特征和16SrRNA基因序列系统发育分析结果显示，80株菌归类为厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）等5个类群，16个属，24个种。

其中属于γ-变形菌的细菌为49株，占分离菌株的61.25%（49/80）；属于厚壁菌门的细菌为15株，占分离菌株的18.75%（15/80）；属于α-变形菌纲的细菌为10株，占分离菌株的12.5%（10/80）；属于放线菌门的细菌为7株，占分离菌株的8.75%（7/80）；属于拟杆菌门的细菌为1株，占分离菌株的1.25%（1/80）。

假单胞菌属（Pseudomonas）是占优势属，占分离菌株的43.75%（35/80）。

在80株细菌当中发现与Pseudomonasxinjiangensis、Pseudomonassabulinigri、Pseudomonasazotifigens、Pseudomonaspelagia、Rhizobiumrosettiformans、Microbacteriumhydrocarbonoxydans、Microbacteriumsedminis、Halomonassulfidaeris、Halomonasmeridiana、Halomonasdesiderata、Nesterenkoniaaethiopica、Nesterenkoniasuensis、Nocardioidesalkalitolerans、Planococcusmaritimus、Pontibactersalisaro、Planomicrobiumkoreense和Pantoeabrenneri等模式菌株有着低于98.7%的16SRNA基因序列相似性的59株细菌。

初步认为是14种潜在新分类单元，需对其进行进一步研究。

对潜在新种的详细多相分类学研究结果表明，菌株KBL-4-9是短杆状，无鞭毛，严格好氧，细胞内积累类脂粒（PHB，即poly-β-hydroxybutyricacid聚-β-羟基丁酸）的革兰氏阴性菌株。

生长温度是4-45℃（最适37℃），pH范围是6.0-9.0（最适pH7.0），NaCl浓度范围是0-3%（w/v）（最适是0-1%）。

与PseudomonasxinjiangensisS3-3T有97.24%的16SrRNA基因序列相似性和41.2%的DNA-DNA杂交率。

基因组DNA的G+Cmol%含量是60.4%。

主要脂肪酸组分有C16:

0、SummedFeature8、C17:

0cyclo、C19:

0cyclow8c、C12:

0、SummedFeature3、C12:

03OH和C10:

03OH。

基于表型特征，化学分类特征和遗传学特征分析结果，提议将菌株KBL-4-9归类为假单胞菌属的一个新物种，并命名为PseudomonasTograkense。

关键词：

Kiyik古河道；胡杨；内生细菌；多样性；16SrRNA；多相分类学

Abstract

TheaimofthisstudywastoidentifytheculturableendophyticbacteriaisolatedfromstorageliquidofsixPopulusEuphraticastandsattheancientKiyikRiverwhichdriedup343yearsbefore.Throughconventionaldilution-platingmethod,weisolated80purecultivablestrains.Amongthem,25strainswereisolatedonLBplates,21wereisolatedonNBplates,16wereisolatedonKBplatesand18strainswereisolatedonMAplates.Gramstainingandsimplestainingtestresultsoftheisolatesshowsthat17strainsweregram-positive,63strainsweregram-negative,and3strainswerecoccus,32strainswererod-shapedand45strainswereshortrod-shaped.Thephenotypicproperties,biophysicalcharacterization,16SrRNAgenesequenceanalysisandphylogeneticanalysesshowedthat80strainscouldbeplacedintofivephylogeneticgroups（γ-Proteobacteria,α-proteobacteria,Actinobacteria,FirmicutesandBacteroidetes）,16genera,and24species.Amomgthem,49isolatesbelongtoγ-Proteobacteria,occupy61.25%（49/80）oftotalisolates;15isolatesbelongtoFirmicutes,occupy18.75%（15/80）oftotalisolates;10isolatesbelongtoα-proteobacteria,occupy12.5%（10/80）oftotalisolates;7isolatesbelongtoActinobacteria,occupy8.75%（7/80）oftotalisolatesand1isolatesbelongtoBacteroidetes,occupy1.61.25%（1/80）oftotalisolates.Pseudomonaswasthepredominantgenera,occupy43.75%（35/80）oftotalisolates.

The16SrRNAgenesequencesof59isolateshaveshowedsimilarityoflowerthan98.7%toPseudomonasxinjiangensis,Pseudomonassabulinigri,Pseudomonasazotifigens,Pseudomonaspelagia,Rhizobiumrosettiformans,Microbacteriumhydrocarbonoxydans,Microbacteriumsedminis,Halomonasmeridiana,Halomonasmeridiana,Halomonasdesiderata,Nesterenkoniaaethiopica,Nesterenkoniasuensis,Nocardioidesalkalitolerans,Planococcusmaritimus,Pontibactersalisaro,PlanomicrobiumkoreenseandPantoeabrennerirespectively,arepresumedtobepotentiallynovelspecies.

PolyphasicapproachusingtoKBL-4-9showedthat,strainKBL-4-9cellsareGram-staining-negative,short-rodshaped,havenoflagella,strictlyaerobic,accumulatePHBincell.Growthoccursbetween4and45℃;Theoptimumtemperatureforgrowthis37℃.ThepHrangeforgrowthis6.0-9.0,withanoptimumpH7.0.Growthoccursinthepresenceof0-3%（w/v）NaCl.OptimumNaCl1%.KBL-4-9nearestrelativeofthestrainPseudomonasxinjiangensisS3-3Twith97.2%,16SrRNAgenesequencesimilarity,41.2%DNA–DNArelatedness.TheG+CcontentofthegenomicDNAwas60.4%.ThemajorfattyacidswereC16:

0,SummedFeature8,C17:

0cyclo,C19:

0cyclow8c,C12:

0,SummedFeature3,C12:

03OHandC10:

03OH.ThepredominantisoprenoidquinonewasQ-10.Onthebasisofphenotypicpropertiesandphylogeneticinference,strainKBL-4-9TrepresentsanovelspeciesofthegenusPseudomonas,forwhichthenamePseudomonasTograkenseisproposed.ThetypestrainisKBL-4-9T.

Keywords:

ancientKiyikriver;PopulusEuphratica;endophyticbacteria;Diversity;16SrRNA;Polyphasicapproach

目录

摘要3

Abstract5

第一章文献综述9

1胡杨概况9

1.2胡杨9

1.3胡杨林分布状况9

1.4Kiyik河胡杨林9

2植物内生菌概况10

2.1植物内生菌概念10

2.2内生菌与宿主植物的关系10

2.3植物内生菌代谢产物种类及其功能多样性11

2.4植物内生菌多样性研究进展11

2.5植物内生菌多样性研究方法12

3细菌多相分类研究方法14

3.1表型特征分析法14

3.2遗传学特征分析法15

3.3化学特征分析法15

4胡杨内生细菌研究进展15

5研究目的与意义15

6研究内容与技术路16

6.1研究内容16

6.2技术路线16

第二章Kiyik河胡杨内生细菌的分离鉴定及多样性分析17

1、实验材料与方法17

1.1样品来源17

1.2培养基：

17

1.3生化试剂18

1.4试验仪器18

1.5引物18

2、试验方法19

2.1样品的预处理19

2.2细菌的分离与CFU值的计算19

2.3细菌的纯化19

2.4细菌的染色与观察19

2.5细菌基因组DNA的提取20

2.616SrRNA基因扩增20

2.7系统发育分析21

2.8培养基优势度的计算21

2.9菌种库的构建21

3、结果22

3.1细菌的分离与纯化22

3.2不同培养基上生长情况26

3.3基于16SrRNA基因序列基础上的系统发育分析26

3.4基于不同培养基上的系统发育分析34

4、讨论36

第三章一株假单胞菌新种PseudomonasTograkenseKBL-4-9的多相分类学鉴定38

1、试验材料38

1.1样品来源38

1.2模式菌株38

1.3试剂38

1.4仪器38

1.5引物38

2、试验方法39

2.1表型特征分析39

2.2生理生化特征分析40

2.3脂肪酸组分分析41

2.4DNA-DNA同源性测定42

2.5DNA的G+Cmol%含量测定43

3、结果43

3.1表型特征43

3.2生理生化特征分析44

3.3脂肪酸组分分析46

3.4基于16SrRNA基因序列的系统发育分析47

3.5基因组DNA-DNA杂交率49

3.6基因组G+C%含量的测定49

4、讨论50

缩写表54

参考文献56

作者简介63

第一章文献综述

1胡杨概况

1.2胡杨

胡杨（Populuseuphraticu）是隶属于杨柳科杨属一种古老、原始的荒漠特有树种，远在1.35亿年前就已出现，被称为“第三纪活化石”。

树高一般15-30米，异形叶，雌雄异株，是干旱荒漠区生长的植物，从生物学特征上表现为表皮角质层较厚，叶面积相对较小，以此减少蒸腾作用带走的水分；根系发达，以获得足够的水分供应其本身的生长和蒸腾耗水[1]。

胡杨树干内存液是胡杨对干旱高温环境条件适应性的产物，是植物应对高蒸发量的蓄水储备，是胡杨树利用它发达的根系吸收地下水，通过微管组织输送到树干、树枝及其末端的体内的蓄水[2]。

胡杨对极端环境有很强的抗逆性，在干旱沙漠地区唯一能生存的乔木，有“生而一千年不死，死而一千年不倒，倒而一千年不朽”的强大生命力。

胡杨繁殖力高，生长慢、抗逆性强，对于改善生态环境，遏制沙漠化，保护生物多样性等诸多方面具有重要作用，是下游绿色走廊的一道生态屏障[3]。

1.3胡杨林分布状况

胡杨广泛分布于阿尔及利亚，中国，埃及，印度，伊朗，伊拉克，以色列，利比亚，巴基斯坦，阿拉伯叙利亚共和国，土耳其，土库曼斯坦等的近20个欧、亚、非洲国家。

中国仍是当今世界上胡杨分布范围最广、数量最多的国家。

新疆分布着目前全世界上最大的天然胡杨林。

其面积近30万公顷，约占全国胡杨林总面积的90％和全世界胡杨林总面积的55％以上，是极其珍贵的自然资源[4]。

1.4Kiyik河胡杨林

在塔河中游（沙雅县至尉犁县）主河道的南面，塔克拉玛干沙漠的北部边缘荒漠区，遗留着历史上由于塔河改道而干枯的6条较大的废弃古河道遗迹。

其中之一的Kiyik河流域没有人类建造的房屋，牲畜的圈棚和水井的遗迹，是未受人类活动影响的净土；古河道沿岸，不同程度的分布着依靠地下水维系生命的衰败状胡杨林。

Kiyik河道是塔河中游的废弃343年的废弃古河道，由于Kiyik河和尉犁县卡尔区尕乡之间分布着直线距离29Km以上的沙丘荒漠（没有行车的道路），断流年代比较久远，脱离了塔河水系，因此分布在Kiyik河流域的胡杨林形成了在时间和空间上相对隔离封闭的生态体系。

与塔河主河道相比kiyik河胡杨的长势较弯曲茎部分支多，表皮更粗糙，明显表达出了胡杨适应恶劣环境的形态特征。

2植物内生菌概况

2.1植物内生菌概念

植物内生菌一词由希腊语中的《endo》（在…之内）和《phyton》（植物）组成。

内生菌概念最早是由DeBary在1866年提出，他认为生活在植物组织内的微生物为内生菌[5]，用以区分生活在植物表面的表生菌（Epiphyte）。

1986年Carroll[6]将内生菌定义为：

是生活在活的植物组织内而对植物不引起明显病害症状的真菌，强调了内生菌与植物的互惠共生的关系。

在1992年，Petrini[7]进一步扩大了内生菌的概念范畴，将内生菌定义为在其生活史中某一段时期生活在植物组织内，并对寄主不引起明显病害症状。

其后，在1997年Hallmann等人指出[8]，植物内生菌是指从表面消毒的植物组织中分离而得到或从植物内部获得的，但它们的存在并未使植物的表型特征和功能有任何改变的细菌和真菌。

目前被广泛接受的定义是，能直接在植物组织内观察到或是从严格表面消毒的植物组织中分离得到，抑或是送植物组织中直接扩增到其核酸DNA的，不会使宿主植物表现出至少暂时不会表现明显的病状的微生物[9]。

2.2内生菌与宿主植物的关系

地球上有约30万种植物，它们分布的环境各也各有差异，这些多种多样的植物为微生物提供了多元化的、极为复杂多样的栖息地。

内生菌可以提高宿主植物的一些机制，包括形成的根外菌丝营养吸收，刺激根系生长，促进植物的新陈代谢，促进氮，磷的吸收，固氮，可以改善土壤或根系分泌物[10]。

一些内生菌只将一种植物作为宿主，而另一些则有多种宿主植物。

Petrini[11]表明，某些内生菌在寄主科水平上有专一性。

也有研究中发现，寄主种的水平上有专一性的一些内生真菌。

Carroll等人[12]发现分布在法国和瑞士的7种针叶树不同组织中存在不同物种的内生菌，并提出了组织专一性假说。

2.3植物内生菌代谢产物种类及其功能多样性

植物内生菌代谢产物种类繁多，结构多样并具有各种生物学活性，主要有萜类、生物碱、皂苷类、芳香类、多肽类等[13]。

这些代谢产物不仅能促进植物生长、固氮、抗疾病、抗害虫和提高宿主植物抗逆境能力，而且还有些物质有着抗肿瘤、抗病毒和抗菌作用[13,14]。

2.4植物内生菌多样性研究进展

自20世纪30年代发现造成畜牧业重大损失的牲畜中毒是由于食用感染内生菌的牧草后，内生菌的研究才得以广泛地开展起来[15]。

植物内生菌几乎存在于所有目前已研究过的植物中，分布广，种类多。

研究表明，感染内生菌的植物宿主往往具有生长快速、抗逆境、抗病害、抗动物危害等优势，比未感染植株更具生存竞争力。

大量研究表明，植物内生菌的种类、分布、定植都因植物种类不同而异。

目前研究的关于微生态的植物已达上百种[16]。

涉及藻类、针叶树、灌木和草本等多个类群，其中研究较多的植物有牧草、棉花（Gossypiumhirsutum）、小麦（Triticumaestivum）、高粱（Sorghumbicolor）、水稻（Oryzasativa）、玉米（Zeamays）、马铃薯（Solanumtuberosum）、甘蔗（Saccharumofficinarum）、甜菜（Betavulgaris）等。

国际上已有许多从不同植物中分离可培养内生细菌的报道。

FionaPorteousMoorea,TanjaBaracb等人从生长在BTEX（Benzene,Toluene,Ethylbenzene,Xylene）污染的杨树的根，茎，叶部分取样而分离了具有不同表型的121株内生细菌，用16SrDNA序列鉴定，BOX-PCR基因组DNA指纹技术来确定分离菌株的进化地位，所有分离菌株隶属于21个属，测定了分离菌株对目标污染物，重金属，抗生素的耐性，揭示了杨树内生细菌在提高植物修复过程的潜在特性[17]。

RodrigoMendes,AlineA,Pizzirani-Kleiner等人从甘蔗的根际，根内和茎部取样而分离了154株可培养内生细菌并鉴定16SrDNA序列，结果发现所有的分离菌株隶属于4个属，其中伯克霍德菌属（Burkholderia）占优势[18]。

PiousThomas.GanigaK.Swarna等人通过16SrDNA序列鉴定分离于香蕉茎尖培养物的可培养和免培养内生细菌，这些细菌隶属于5个门和20个不同的属[19]。

AnastasiaVenieraki,MariaDimou等人从希腊不同地区的小麦根际中分离了17株可培养固氮菌，隶属于3个属，并且研究促进植物生长的菌株的特性[20]。

在国内河北大学生科院的JigangHan等人把毛竹根际，根表面和根内组织作为样品使用2种培养基分离了182株菌株，鉴定了属于22个属的56个不同的分类单元的16SrDNA序列[21]。

首都师范大学生科院的LeiSun,FubinQiu等人把河北省农业试验站的水稻作为样品分离了可培养内生细菌，克隆192株菌株的16SrDNA基因，并鉴定了52个分类单元的基因序列[22]。

近年来，从植物内生细菌中分离新的次生代谢活性物质和利用内生菌对植物病原菌进行生物防治成为了国内外研究的热点。

截至到2008年在各种植物中发现的可培养植物内生细菌已超过129种，分别属于54个属[23],其中分离到的新种也相当可观。

2.5植物内生菌多样性研究方法[24]

2.5.1以生化技术为基础的研究方法

1）平板计数和形态分析

通过人工配制的简单营养基质对土壤中的微生物进行定时定温培养，然后对生长的菌落进行计数、并通过形态构造和生理生化特性来鉴定种属。

该方法直观快捷，而且可以提供具有代谢活性、异养类型等种群信息。

然而，微生物在实际土壤生境中的生长与温度、pH值、养分和种间的相互作用有很大关系，简单的人工模拟环境是无法满足其生长要求的。

因此，这种方法仅能培养出极少数（少于1%）的微生物。

2）群落水平生理学指纹（CLPP）或单一碳源利用模式法（SSCU）

是基于某一微生物群落所含有的酶可催化利用特定的碳源基质，然后通过测定其利用能力和模式来评价微生物种群多样性。

Garlan和Mills[25]于1991年首次提出该技术，经BIOLOG公司商业化后