宠物食品中黄曲霉毒素B1的测定精.docx
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宠物食品中黄曲霉毒素B1的测定精
宠物食品中黄曲霉毒素B1的测定(精)
宠物食品中黄曲霉毒素B1的测定
1 主题内容与适用范围
本标准规定了粮食、花生及其制品、薯类、豆类、发酵食品及酒类等各种食品中黄曲霉毒素B1的测定方法。
本标准适用于粮食、花生及其制品、薯类、豆类、发酵食品及酒类等各种食品中黄曲霉毒素B1的测定。
本标准分为两法。
在第一法中,薄层板上黄曲霉毒素B1的最低检出量为0.0004µg,最低检出浓度为5µg/kg。
第二法对黄曲霉毒素B1的最低检出浓度为0.01µg/kg。
第一篇 第一法
2 原理
样品中黄曲霉毒素B1经提取、浓缩、薄层分离后,在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光,根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。
3 试剂
3.1 三氯甲烷。
3.2 正己烷或石油醚(沸程30~60℃或60~90℃)。
3.3 甲醇。
3.4 苯。
3.5 乙腈。
3.6 无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水。
3.7 丙酮。
以上试剂在试验时先进行一次试剂空白试验,如不干扰测定即可使用,否则需逐一进行重蒸。
3.8 硅胶G:
薄层色谱用。
3.9 三氟乙酸。
3.10 无水硫酸钠。
3.11 氯化钠。
3.12 苯-乙腈混合液:
量取98mL苯,加2mL乙腈,混匀。
3.13 甲醇水溶液:
55∶45。
3.14 黄曲霉毒素B1标准溶液。
2Cr2O7)=0.0004mol/L。
再吸取25mL此稀释液于50mL容量瓶中,加硫酸(0.5+1000)稀释至刻度,相当于0.0002mol/L溶液。
再吸取25mL此稀释液于50mL容量瓶中,加硫酸(0.5+1000)稀释至刻度,相当于0.0001mol/L溶液。
用1cm石英杯,在最大吸收峰的波长(接近350nm处)用硫酸(0.5+1000)作空白,测得以上三种不同浓度的摩尔溶液的吸光度,并按式
(1)计算出以上三种浓度的摩尔消光系数的平均值。
式中:
E1——重铬酸钾溶液的摩尔消光系数;
A——测得重铬酸钾溶液的吸光度;
c——重铬酸钾溶液的摩尔浓度。
再以此平均值与重铬酸钾的摩尔消光系数值3160比较,即求出使用仪器的校正因素。
式中:
f——使用仪器的校正因素;
E——测得的重铬酸钾摩尔消光系数平均值。
式中:
X1——黄曲霉毒素B1标准溶液的浓度,µg/mL;
A——测得的吸光度值;
f——使用仪器的校正因素;
M——黄曲霉毒素B1的分子量312;
E2——黄曲霉毒素B1在苯-乙腈混合液中的摩尔消光系数,19800。
根据计算,用苯-乙腈混合液调到标准溶液浓度恰为10.0µg/mL,并用分光光度计核对其浓度。
3.15 黄曲霉毒素B1标准使用液:
准确吸取1mL标准溶液(10µg/mL)于10mL容量瓶中,加苯-乙腈混合液至刻度,混匀。
此溶液每毫升相当于1.0µg黄曲霉毒素B1。
吸取1.0mL此稀释液,置于5mL容量瓶中,加苯-乙腈混合液稀释至刻度,此溶液每毫升相当于0.2µg黄曲霉毒素B1。
再吸取黄曲霉毒素B1标准溶液(0.2µg/mL)1.0mL置于5mL容量瓶中,加苯-乙腈混合液稀释至刻度。
此溶液每毫升相当于0.04µg黄曲霉毒素B1。
3.16 次氯酸钠溶液(消毒用):
取100g漂白粉,加入500mL水,搅拌均匀。
另将80g工业用碳酸钠(Na2CO3·10H2O)溶于500mL温水中,再将两液混合、搅拌,澄清后过滤。
此滤液含次氯酸浓度约为25g/L。
若用漂粉精制备,则碳酸钠的量可以加倍。
所得溶液的浓度约为50g/L。
污染的玻璃仪器用10g/L次氯酸钠溶液浸泡半天或用50g/L次氯酸钠溶液浸泡片刻后,即可达到去毒效果。
4 仪器
4.1 小型粉碎机。
4.2 样筛。
4.3 电动振荡器。
4.4 全玻璃浓缩器。
4.5 玻璃板:
5cm×20cm。
4.6 薄层板涂布器。
4.7 展开槽:
内长25cm、宽6cm、高4cm。
4.8 紫外光灯:
100~125W,带有波长365nm滤光片。
4.9 微量注射器或血色素吸管。
5 分析步骤
5.1 取样
样品中污染黄曲霉毒素高的霉粒一粒可以左右测定结果,而且有毒霉粒的比例小,同时分布不均匀。
为避免取样带来的误差,必须大量取样,并将该大量样品粉碎,混合均匀,才有可能得到确能代表一批样品的相对可靠的结果,因此采样必须注意以下几点。
5.2 提取
“用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合”起,依法操作。
“振摇2min,静置分层”起,依法操作,最后加入2.5mL苯-乙腈混合液,此溶液每毫升相当于4g样品。
“振摇2min,静置分层”起,依法操作。
最后加入2mL苯-乙腈混合液。
此溶液每毫升相当于4g样品。
5.3 测定
第一点:
10µL黄曲霉毒素B1标准使用液(0.04µg/mL)。
第二点:
20µL样液。
第三点:
20µL样液+10?
L0.04µg/mL黄曲霉毒素B1标准使用液。
第四点:
20µL样液+10?
L0.2µg/mL黄曲霉毒素B1标准使用液。
;如为阳性,则起定性作用。
薄层板上的第四点中黄曲霉毒素B1为0.002µg,主要起定位作用。
第一点:
10µL0.04µg/mL黄曲霉毒素B1标准使用液。
第二点:
20µL样液。
于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上,反应5min后,用吹风机吹热风2min后,使热风吹到薄层板上的温度不高于40℃。
再于薄层板上滴加以下两个点。
第三点:
10µL0.04µg/mL黄曲霉毒素B1标准使用液。
第四点:
20µL样液。
第一点:
10µL黄曲霉毒素B1标准使用液(0.04µg/mL)。
第二点:
根据情况滴加10µL样液。
第三点:
根据情况滴加15µL样液。
第四点:
根据情况滴加20µL样液。
式中:
X2——样品中黄曲霉毒素B1的含量,µg/kg;
V1——加入苯-乙腈混合液的体积,mL;
V2——出现最低荧光时滴加样液的体积,mL;
D——样液的总稀释倍数;
m1——加入苯-乙腈混合液溶解时相当样品的质量,g;
0.0004——黄曲霉毒素B1的最低检出量,µg。
结果的表述:
报告测定值的整数位。
如用单向展开法展开后,薄层色谱由于杂质干扰掩盖了黄曲霉毒素B1的荧光强度,需采用双向展开法。
薄层板先用无水乙醚作横向展开,将干扰的杂质展至样液点的一边而黄曲霉毒素B1不动,然后再用丙酮-三氯甲烷(8+92)作纵向展开,样品在黄曲霉毒素B1相应处的杂质底色大量减少,因而提高了方法灵敏度。
如用双向展开中滴加两点法展开仍有杂质干扰时,则可改用滴加一点法。
µL黄曲霉毒素B1标准使用液(0.04µg/mL),在距左边缘2.8~3cm处各滴加20µL样液,然后在第二块板的样液点上加滴10µL黄曲霉毒素B1标准使用液(0.04µg/mL),在第三块板的样液点上加滴10µL0.2µg/mL黄曲霉毒素B1标准使用液。
;
第二篇 第二法
6 原理
样品中的黄曲霉毒素B1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应,多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合,加入酶标记物和底物后显色,与标准比较来测定含量。
7 试剂
7.1 抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体,由卫生部食品卫生监督检验所进行质量控制。
7.2 人工抗原:
AFB1-牛血清白蛋白结合物。
7.3 黄曲霉毒素B1标准溶液。
式中:
X——该溶液中黄曲霉毒素B1的浓度,µg/mL;
A——测得的光密度值;
M——黄曲霉毒素B1的分子量312;
E——摩尔消光系数,21800;
f——使用仪器的校正因素。
根据计算将该溶液配制成10µg/mL标准溶液,检测时,用甲醇-BS溶液将该标准溶液稀释至所需浓度。
7.4 三氯甲烷。
7.5 甲醇。
7.6 石油醚。
7.7 牛血清白蛋白(BSA)。
7.8 邻苯二胺(OPD)。
7.9 辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG。
7.10 碳酸钠。
7.11 碳酸氢钠。
7.12 磷酸二氢钾。
7.13 磷酸氢二钠。
7.14 氯化钠。
7.15 氯化钾。
7.16 过氧化氢(H2O2)。
7.17 硫酸。
7.18 ELISA缓冲液。
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.93g
加蒸馏水至1000mL。
KH2PO4 0.2g
Na2HPO4·12H2O 2.9g
NaCl 8.0g
KCl 0.2g
加蒸馏水至1000mL。
6H8O7·H2O)21.01g,加蒸馏水至1000mL。
2HPO4·12H2O71.6g,加蒸馏水至1000mL。
8 仪器
8.1 小型粉碎机。
8.2 电动振荡器。
8.3 酶标仪,内置490nm滤光片。
8.4 恒温水浴锅。
8.5 恒温培养箱。
8.6 酶标微孔板。
8.7 微量加样器及配套吸头。
9 分析步骤
9.1 取样,同5.1
9.2 提取
科学院营养与食品卫生监督检验所编著,1991年8月,第一版)
样品粉碎后过20目筛,称取20.0g,加入250mL具塞锥形瓶中。
准确加入60mL三氯甲烷,盖塞后滴水封严。
150r/min振荡30min。
静置后,用快速定性滤纸过滤于50mL烧杯中。
立即取12mL滤液(相当4.0g样品)于75mL蒸发皿中,65℃水浴通风挥干。
用2.0mL20%甲醇-PBS分三次(0.8mL、0.7mL、0.5mL)溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物,移至小试管,加盖振荡后静置待测。
此液每毫升相当于2.0g样品。
“65℃水浴通风挥干”起,依法操作。
“65℃水浴通风挥干”起,依法操作。
“65℃水浴通风挥干”起,依法操作。
“将蒸发皿放在通风柜内于65℃水浴上通风挥干”“用2.0mL20%甲醇-PBS分三次”起,依法操作。
9.3 间接竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA)
a.与等量不同浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液用2mL试管混合振荡后,4℃静置。
此液用于制作黄曲霉毒素B1标准抑制曲线。
b.与等量样品提取液用2mL试管混合振荡后,4℃静置。
此液用于测定样品中黄曲霉毒素B1含量。
2O2,100µL/孔,37℃,15min,然后加2mol/LH2SO4,40µL/孔,以终止显色反应,酶标仪490nm测出OD值。
9.4 计算
式中:
C——黄曲霉毒素B1含量,ng,对应标准曲线按数值插入法求得;
V1——样品提取液的体积,mL;
V2——滴加样液的体积,mL;
D——稀释倍数;
m2——样品质量,g。
由于按标准曲线直接求得的黄曲霉毒素B1浓度(C1)的单位为ng/mL,而测孔中加入的样品提取的体积为0.065mL,所以式(6)中C=0.065mL×C1
而V1=2mL,V2=0.065mL,D=2,m2=4g代入式(6),则
黄曲霉毒素B1浓度(ng/g)=0.065×C1×(2/0.065)×2×1/4=C1(ng/g)……(7)
所以,在对样品提取完全按本方法进行时,从标准曲线直接求得的数值C1,即为所测样品中黄曲霉毒素B1的浓度(ng/g)。
附加说明:
本标准由卫生部卫生监督司提出。
本标准第一法由中国预防医学科学院营养及食品卫生研究所、中华人民共和国青岛进出口商品检验局负责起草;第二法由卫生部食品卫生监督检验所、北京市营养源研究所负责起草。
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。
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- 关 键 词:
- 宠物食品 中黄 曲霉 毒素 B1 测定