IVM小鼠脑组织神经活动配体受体相互作用通路基因表达改变可导致父源性子二代基因表达异常生殖内分泌专业.docx
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IVM小鼠脑组织神经活动配体受体相互作用通路基因表达改变可导致父源性子二代基因表达异常生殖内分泌专业
IVM小鼠脑组织神经活动配体-受体相互作用通路基因表达改变可导致父源性子二代基因表达异常-生殖内分泌专业毕业论文
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浙江大学硕士学位论文正文实验方法
选取primerl作为本实验引物,如表11
表11BSP引物序列
GenesPrimersequence(5'-3’)
Glral
ForwardGAAAGAAAGAAAAGAAGAAAA眦ATTTAT
Reverse.biotinATTACAACCAAACAACTAAAATACC
注:
而采用焦磷酸测序时,上下游引物其中一条需要用生物素标记,合成方
式则用HPLC纯化。
(2)降落PCR反应体系
表12降落PCR反应体系
成分体积(91)
l0宰PCRBuffer)
dNTPMix(各2.5mM)4
模板DNA2
上游引物(10gM)1
下游引物(10州)1
ExTaq热启动酶(5IU/91)0.25
灭菌蒸馏水upto50
(3)反应条件:
降落PCR:
预变性94。
C5min
94P30s’、
60℃.50℃45sI
(每个循环降o.5℃)>
20cycleS
72℃45sJ
94℃30S
]
50。
C45s30cyclesl
>
72。
C45sf
72。
C10rain.)
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浙江大学硕士学位论文正文实验方法
(4)PCR扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶(含溴化乙啶0.5ug/m1)中,100V,20rain
电泳检测。
2.5.4BSP产物的焦磷酸测序验证(Q24)
(1)在PCR板中,准备微珠预混液配制(每管)
Beads:
2m+BindingBuffer:
40山+模版:
10山+ddH20:
281al;混匀后震荡20min。
(2)焦磷酸测序样品准备
1)清洗探头2-3次,最后一次将探头竖直举起,抽出残余水分,将70%乙醇、变性液NaOH、洗液Washingbuffer倒入相应的位置
2)加入碱基和酶、底物,将试剂仓放入仪器(如图3)
EAS
TC
G
图3Brand(Q24)加样示意图(E:
酶;S:
底物;ATCG代表相应的碱基)3)在酶标版中,准备预混液(每管):
AnealBuffer:
24¨1,测序引物(10M):
1肛1。
根据目的测序序列经PyroMarkAssayDesign设计测序引物(表13):
表13测序引物序列
4)探头吸附微珠预混液:
将探头分别顺次放置于70%乙醇5s,变性液NaOH5s,WashingbufferlOs,看到液体从管中出来,探头竖直举起直至水抽干;将探头对准酶标板,关闭真空,停留3S后,探头置入酶标板,轻轻晃动探头;将酶标板放置于80。
C2min,室温直至手感不热,放入仪器。
5)打开焦磷酸测序仪的甲基化分析软件,设置相应的分组及对应名称,运行软件。
,n
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浙江大学硕士学位论文正文实验方法
2.6IVM对ARTF2代在10W脑组织中Glral蛋白表达的影响
2.6.1组织蛋白质的提取
采用总蛋白提取试剂盒(含ProteaseInhibitorCocktail)进行6个样品总蛋白的提取,然后采用BCA定量试剂盒进行总蛋白定量。
2.6.2SDS.PAGE电泳分析
配制10%分离胶和5%浓缩胶,每个孔60ug总蛋白进行上样,每孔10.15ul,
浓缩胶60V,分离胶80V进行电泳511r左右。
(1)10%SDS—PAGE凝胶的制备:
安装玻璃板,灌注分离胶至梳齿下1cm。
在胶溶液上方覆盖无水乙醇,.防止氧气扩散进入凝胶抑制聚合反应。
待分离胶聚合完全后(约30min),制备5%PAGE浓缩胶,倾出分离胶上面的水分,灌注浓缩胶,插上梳子。
待浓缩胶聚合完全(约30min)后,移出梳子,用去离子水冲洗加样孔及凝胶底部,去除未聚合的丙烯酰胺。
将凝胶固定在电泳装置上,上、下槽均加入lxTriS甘氨酸电泳缓冲液,排除凝胶底部两玻璃板之间的气泡。
(2)上样:
微量加样器顺序加样,每板胶均设预染蛋白质Marker同时上样。
因样品蛋白均已稀释成同一浓度,故60“g蛋白所需要的体积数恒定,即每孔上样的体积相同。
(3)电泳:
以100V电泳约1rain,电泳至嗅酚蓝到达分离胶底部。
(4)蛋白质转膜:
PVDF膜甲醇中浸泡20sec,然后转移到Tris.Glycine转移
缓冲液(15%甲醇)中平衡至少5rain;SDS.PAGE胶在Tris—Glycine转移缓冲液平衡至少30min;在冷却条件下以100v恒压转膜2hr。
(5)转印膜封闭:
转膜结束后,放到T-TBS(含5%脱脂奶粉)室温封闭1hr,
然后T-TBS漂洗,5minx3。
(6)一抗杂交:
一抗都以一定的比例溶于T-TBS(溶入3%脱脂奶粉),4℃孵育过夜;然后T-TBS漂洗5minx4;内参GAPDH以1:
2000溶于T-TBS中。
本实验中一抗具体稀释倍数如下:
anti.Glralantibody(MILLIPOREABl5012)
f1:
1000);
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浙江大学硕士学位论文正文实验方法
(7)二抗杂交:
二抗以1:
5000溶于T-TBS(溶入2%脱脂奶粉),室温摇床缓慢震荡1hr,;然后T-TBS漂洗5minx5;内参GAPDH同样;
(8)信号检测:
制备约lmlECL工作液,室温孵育转印膜lmin,然后去除多余ECL试剂,保鲜膜密封,采用SuperSignal⑧WestDuraExtendedDurationSubstrate仪器,暗盒中放上X—rayfilm曝光5—10min后进行显影和定影。
(9)数据分析:
采用QuantityOne4.6.2软件分析条带的光密度值,目的蛋白相对表达量=目的蛋白(光密度值)/内参GAPDH(光密度值)进行表示,结果以平均数士标准差表示。
2.7统计学分析
运用统计软件SPSSl6.0,进行one.wayanova检验,P<0.05为差异有显著性。
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浙江大学硕士学位论文正文结果
3结果
3.1IVM及各组间小鼠水迷宫实验未见明显差异(课题组先前研究已完成,数据尚未发表)
3.2IVlVI对F2代小鼠脑组织各基因表达的影响
10周IVM、VVM及NC各组F2代小鼠脑组织各基因表达分析
10周时,与VVM及NC组小鼠相比(图4A),IVM小鼠脑组织Glral表达水平显著降低(表达量为VVM组o.86倍,P<0.05;)。
其中以单一父源性因素影响最为显著(图4B),MN组Glral表达量较IN组降低明显(0.66倍,P<0.001)。
而各组F2代小鼠问其他相关基因表达水平的差异没有统计学意义。
(图4C)。
图4一A
图4。
B
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浙江大学硕士学位论文正文结果
图4.C
图4ⅣM、VVM及NC各组小鼠脑组织神经活动配体.受体相互作用基因表达舢10周各组F2代小鼠中除Glral外各基因表达未见明显差异。
B)10周F2代小鼠IVM大组中Glral基因表达显著降低,差异具有统计学意义。
C)10周F2代小鼠各小组间Glral基因荧光定量PCR分析结果。
其中以MN组与IN组之间表达差异最为显著,差异具有统计学意义。
:
l:
:
I:
术:
P<0.001:
木木:
P<0.01:
串:
P<0.05
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浙江大学硕士学位论文正文结果
以下是各基因real-timePCR溶解曲线:
bC
黔~“。
啪搿“‘㈨栅
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“"~v”玳∞'~x"蚺融州”-’‘”‘“‘’“3一’!
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5。
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一~t篙
3。
def
g
图5F2代小鼠脑组织各基因real.timePCR的溶解曲线
a)GlralcDNA扩增的溶解曲线;b)Agtr2cDNA扩增的溶解曲线;c)Slpr5cDNA扩增的溶解曲线;d)Grid2cDNA扩增的溶解曲线;e)Gria4cDNA扩增的溶解曲线;f)GalrlcDNA扩增的溶解曲线;g)GapdhcDNA扩增的溶解曲线。
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浙江大学硕士学位论文正文结果
3.3IVM对脑组织Glral起始序列甲基化影响
根据图表4B和图表4C显示,相比VVMF2代小鼠,IVM小鼠脑组织Glral基因表达降低明显。
由此本研究选取Glral启动子序列区一个甲基化岛上的6个CpG位点(CpG1。
6)进行甲基化情况分析。
(1)10周各组F2代小鼠脑组织Glral的甲基化状态分析
在10周IVMF2代小鼠脑组织Glral的CpG2位点相比于NC组提示甲基化水平升高(2.64-4-o.94%vs1.4士1.14%),差异具有统计学意义(P<0.05)。
但与VVM小鼠F2代相比虽然甲基化水平升高,但差异无统计学意义。
IVM小鼠脑组织Glral
的CpG6位点甲基化率(4.25士1.17%)相比VVM组(3.62士O.89%)及NC组(3士1.15%)均有显著性升高,差异具有统计学意义(P 而小鼠脑组织Glral其他CpG位点甲基化状态无统计学差异。 (图6.A) 图6.A三大组(IVM、VVM、NC)10WF2代小鼠Glral基因的甲基化情况(图中P1.6分别代表CpG位点1-6) 木术木: P<0.001;木木: P<0.01;木: P (2)单一父源性因素对F2代Glral甲基化的影响分析对上述各组的甲基化情况进行父母源性影响的分析。 单一性父源性因素对F2 万方数据 浙江大学硕士学位论文正文结果 代甲基化率影响最为明显。 在本研究进一步分析单纯ⅣM父源性小鼠所生子代(MN组)中Glral的甲基化状态相比单纯VVM父源性小鼠(IN组)在CpGl(5.5士0.58%VS4.15土1.21%,P (图6.B) 图6.B七小组间10WF2代小鼠Glral基因的甲基化情况图中P1—6分别代表CpG位点1-6以下是焦磷酸测序位点图(图6-C) Assay。 一Ⅲl Sample1D.1()”InnlS Nf’le Analysi‘Jvcl‘n。 ? 0“ 图6-CIVMF2代(MM组)脑组织Glral焦磷酸测序位点图 3.4IVM对脑组织Glral蛋白表达的影响 根据以上荧光定量PCR对ARTF2代小鼠各组脑组织的各个基因mRNA水平的分析结果显示,IVM小鼠的GlralmRNA的降低表达较显著,我们进而对10周 27 万方数据 浙江大学硕士学位论文正文结果 龄的F2代小鼠的Glral蛋白质进行Westernblot分析(图7.c)。 蛋白结果发现(图7),10周龄时,ⅣMF2代小鼠与NCF2代小鼠相比Glral蛋白降低(P 将MN组与IN组进行独立t检验,提示MN较IN表达降低,差异具有统计学意义(P (图7.B) 图7.A三大组(IVM、VVM、NC)10WF2代小鼠Glral蛋白表达情况 木木木: P<0.001;木术: P<0.01;木: P 图7-B七小组间10WF2代小鼠Glral蛋白表达情况 木水母: P<0.001;术冰: P<0.01;宰: P<0.05 Glra1霪蹇鬻震粪霾熬攀蒸戮囊黼鬻蘩 Gapdh黛精囊黼豳麓潮 黼醚麓鬻瓣鹾}l|鞠鞠Ne {V凇VV澈辆e 图7-C10WF2代小鼠Glral蛋白表达的WesternBlot结果图 28 万方数据 浙江大学硕士学位论文正文讨论 4讨论 目前对于ART技术的跨代影响的研究寥寥无几,而关于IVMF2代安全性或是F2代中神经系统疾病的研究几乎空白。 迄今为止有报导发现在ART子代中神经系统相关疾病,如Angelmansyndrome[丝]、Beckwith—Weidemannsyndrome[24]和Silver-Russellsyndrome【毡】发病率有所增高,研究发现这可能与印记中心的表 观修饰异常(DNA甲基化异常)有关。 因为神经系统的早期发育是一个复杂精细的过程,易受到外界影响,故相应神经系统疾病的高发可能和胚胎移植前早期的不良环境有关。 同时,有研究表明胚胎早期不良暴露相关的疾病常具有传代效应,其发育早期的不良暴露会影响本代远期健康,甚至引起日后子代的健康问题 逝]。 如果表型的改变存在跨代遗传甚至多代遗传效应,则说明这些不良因素对生殖系的配子发生发育过程的甲基化修饰及重编程产生了一定的影响[丝,捌。 本研究首次对IVMF2代小鼠脑组织中神经活动配体.受体相互作用通路相关基因的表达及机制展开探索,意图研究这些在F1代表达异常的基因是否具有传代效应。 依据先前本课题组前期实验结果: 相比VVM组,IVM新生Fl代雄雌小鼠均出现了上述基因不同程度的上调,但到10w成年后大部分表达异常逐步被纠正,仅10wIVM雌性小鼠仍存在Agtr2基因表达的上调;我们对该通路中的F1代存在差异的8个基因在F2代中均进行了real.timePCR的检测,发现在ⅣMF2代中只有Glral出现了低表达差异,其余的7个基因均未见明显差异,包括IVMF1代新生及成年均存在差异表达的Agtr2基因在F2代10周小鼠中也得到了纠正。 其中,IVMF2代中Glral在脑组织中的mRNA表达水平上的下调以单一父源性IVMF2代的表达差异最为明显,意味着ⅣMF2代小鼠中的GIral表达易受父本基因表达异常的影响。 这提示IVM对F1代发育早期引起的相关基因异常表达大部分可以在发育过程中得到纠正,但仍可能存在父系相关的传代效应,影响F2代脑组织的基因表达。 本研究中的IVMF2代Glral的表达趋势与IVMF1代中趋势相反(即F2代为F1代传代效应的代偿型),我们猜测这可能与表观修饰在F2代中的重编程 29 万方数据 浙江大学硕士学位论文正文讨论 相关。 Glral基因为甘氨酸受体a亚单位1相关基因,位于小鼠11号染色体上,是常染色体显性遗传病过度惊跳发作(hyperekr,lexia)的重要致病基因[绷。 Glral基因的表达能够调节神经传递离子门控通道受体活性,抑制神经元放电,对神经冲动 有负向调节作用。 该基因表达下调可导致神经元异常放电,从而扰乱神经冲动传导。 Glral的缺失可导致进行性神经元细胞异常甚至死亡幽]。 虽然在本研究水迷宫实验中在ⅣM、VVM及NC组F2代成年小鼠在学习认知能力表型上无明显差 异,但IVMF2代小鼠的Glral基因的表达下调暗示IVMF2代中存在神经冲动传导异常的风险增高,Glral基因相关神经系统疾病的潜在发病率升高。 尤其是ⅣM父源性F2代中出现神经元异常放电的发生率增高,相关疾病(如惊跳病、帕金森等)的发病风险增大。 我们进一步检测了Glral蛋白表达量,提示在蛋白质水平上也有一定程度的下降,但IVM组和VVM组之间无明显差异,仅在IVM单一父源性的F2代中有明显的下降,这和我们检测到的mRNA水平上的表达变化趋势是一致的。 然而未出现相应表型的变化可能与有相关的代偿蛋白共同参与调节有关。 这样的结果提示在父源性IVMF1代婚配可能对F2代的神经系统发育存在不良影响,增加F2代中神经系统疾病发病的风险。 但我们不知道这些发生在动物模型上的现象是否也会出现在人类身上;而这些IVM出生的子代之间婚配是否也会发生我们建立的动物模型身上的现象,并以这种类似于父系遗传的方式传递。 另外,我们用的动物模型是近交系小鼠,意味着其每个基因位点上都是纯合的,而人类是远交系动物,这些现象是否发生可能只是一个潜在性的问题。 我们猜测,IVM相关的配子、胚胎发育过程中不良因素暴露可能会造成子代发育编程异常,引起表观遗传修饰的改变,导致相关表型特征的传代效应。 目前的研究提示胚胎早期发育编程的变化大多由表观修饰异常所致隆,丑],而这些传代效应的发生多和表观遗传学的修饰的代间传递相关[卫,丝]。 表观突变可以由不良环境因素所诱发,不仅对F1代发育过程及成年后疾病的发生有远期效应[丝】,还可能将这种突变传递至F2甚至之后的子代。 一方面,表观遗传修饰的改变大多发30 万方数据 浙江大学硕士学位论文正文讨论 生在胚胎早期重编程过程中,部分表观修饰能够稳定维持,部分表观修饰在发育过程中可能出现再次重编程,使表观突变纠正或加剧。 故我们猜测本研究中IVMF1代新生小鼠脑组织中神经活动配体.受体相互作用通路异常基因表达随着小鼠的发育大部分得到纠正可能与异常表观修饰的擦除重编程有关。 另一方面,表观遗传修饰本身有能够遗传的特点,使得胚胎源性疾病或生命早期的编程效应能够遗传至子代。 如发生跨代或多代持续遗传的现象,则说明不良环境因素可能对生殖系的配子形成发育过程的表观修饰与重编程产生了影响,使得表观遗传修饰通过配子为媒介在代间遗传[丑]。 但这种遗传不同于传统的孟德尔遗传规律,因为在配子形成和胚胎发育早期都存在表观修饰的擦除和重新编程,表观突变在此过程中传递可能会出现不同程度的擦除或有重新编程的错误,所以这些表观遗传相关的传代效应及子代表型会出现多样性;大体可分为原发性表观突变或继发性表观突变所致的表型异常,即子代中出现的表型可能是由于亲代异常表观修饰的直接传递引起的,或是由于再次重编程的错误导致。 故目前大部分的报导都提示存在传代效应的子代表型多与亲代一致,亦有研究报导传代效应的子代为亲代表型的代偿 表型陛]。 这或许能够解释本研究中IVM父源性F2代的Glral的基因表达下调,与F1代新生小鼠中表达趋势相反。 可能正是因为表观突变通过影响雄性生殖系的配子形成过程造成F2早期胚胎表观修饰异常,导致了代偿型的基因异常表达。 这些表观遗传学修饰中以甲基化修饰最为常见,目前DNA甲基化修饰的代间遗传在ART的研究中也越来越受到关注[筻,逝]。 本研究为探究F2代Glral表达改变的相关分子机制,对F2代小鼠脑组织中Glral基因启动子序列区中的CpG岛DNA甲基化水平进行了焦磷酸测序分析。 结果提示在IVMF2代小鼠脑组织Glral的CpG6位点甲基化率相比VVM组及NC组均有显著性升高,差异具有统计学意义。 IVM组中这种相对的高甲基化状态可能是造成其Glral基因相对低表达相关分子机制。 我们对上述各组的甲基化情况进行IVM父母源性影响的分析,其中单一性父源性因素对F2代甲基化率影响最为明显,而母源性因素组间比较甲基化未见明显差异。 故我们推测IVMF2代中Glral的转录翻译水平异常是由于其启动子序列的甲基化的水平改变导致,而这种异常的甲基化修饰可能是由父本的表观突 31 万方数据 浙江大学硕士学位论文正文讨论 变传递所引起。 但因为本实验由于标本的有限及实验设计的纰漏,未留取相对应的ⅣMF1代脑组织及精子标本行其Glral基因的甲基化率测定以明确IVM雄性F1代脑组织及精子的甲基化谱,所以这些F2代甲基化修饰异常是由父本表观突变的直接传递,还是F2代中配子形成或胚胎发育过程中再次的重编程错误所引起尚需进一步研究。 另外,本研究中提示Glral基因的在其启动子区整体甲基化程度相 对较低,故甲基化可能只是其一部分的调节机制,也有存在其他表观调控机制的 可能[幽]。 故综上所述,在本研究中,我们以ART近交系F2代小鼠模型为研究对象,VVM小鼠F2代作为IVMF2代的对照组,并设立了NC组为阴性对照,发现IVMF2代小鼠的脑组织中Glral基因表达及甲基化修饰的显著性改变,提示IVMF1代发育早期神经活动配体.受体相互作用通路基因的表达异常可以影响F2代中Glral基因的表达,这可能与F1代中的表观突变的遗传有关。 万方数据 浙江大学硕士学位论文正文结论 5结论 1.IVM新生F1代父源性小鼠脑组织神经活动配体.受体相互作用通路基因异常表达可导致F2代脑组织中的Glral基因表达异常。 2.IVM新生F1代脑组织中神经活动配体.受体相互作用通路基因的表达异常虽然在其成年后大部分可以纠正,但IVMF2代中Glral的表达仍可出现异常,这可能是由于F1代中异常表观修饰影响其雄性生殖系造成代间遗传导致的。 3.IVMF2代小鼠虽然在表型上未见明显的神经系统及认知能力的发育差异,但存在潜在的神经系统疾病高发风险。 尤其是父’源性IVMF1代婚配可能对F2代的神经系统发育存在不良影响。 万方数据 浙江大学硕士学位论文正文参考文献 参考文献 [1]ChaKYKooJJ,KoJJeta1.Pregnancyafterinvitrofertilizationofhumanfollicularoocytescollectedfromnonstimulatedcycles,theircultureinvitroandtheirtransferinadonoroocyteprogram.Fertilityandsterility1991;55: 109-13. [2]ChianRC,LimJH,TanSL.Stateoftheartinin-vitrooocytematuration.Currentopinioninobstetrics&gynecology2004;16: 211-9. [3]3.DelavalK,FeilR.Epigeneticregulationofmammaliangenomicimprinting. Currentopinioni
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