原核表达及抗体的制备汇编.docx
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原核表达及抗体的制备汇编.docx
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原核表达及抗体的制备汇编
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
其原理是:
在0℃下的CaCl2低渗溶液中,细菌细胞膨胀成球形。
转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物,此复合物粘附于细菌细胞表面。
42℃短时间热处理(热休克),可以促进细胞吸收DNA复合物。
将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性)得到表达。
然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上,37℃培养过夜,这样即可得到转化菌落。
感受态细胞的制备
1.从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mLLB培养液的试管中,37℃振荡培养过夜。
2.取50UL菌液转接到一个含有5mLLB培养液锥形瓶中,37℃振荡培养2小时。
以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行:
3.用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中,冰上放置3分钟后,加入0.5mL预冷的SolutionSS。
在冰上小心地用1mL枪头将细胞悬浮起来。
注意:
1mL的取液器设定在500mL。
悬浮细胞要轻,防止细胞进入枪内。
4.将上述细胞分装于1.5mL离心管(离心管要在放在冰上预冷)中,每管0.1mL。
细胞可以立即使用或储存。
5.将感受态细胞迅速转移到-20℃或更低的低温冰中。
注意:
在转移过程中要防止温度升高,解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块,将细胞迅速转移到塑料里,将整个塑料袋放到低温冰箱内。
转化:
1.新鲜制备的或-20℃下保存的感受态细胞,置于冰上,完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。
2.取200UL的感受态细胞,加入适量的重组子,轻轻混匀.
3.冰浴30min.
4.42℃水浴热激90秒。
5.冰上放置2-5分钟。
6.加400ULLB培养液,37℃振荡培养45分钟。
7.将适量的菌液涂布在Amp/LB(Amp50ug/ml)琼脂平板上。
9.平皿在37℃下正向放置1小时,待接种的液体吸收进琼脂后,将平皿倒置,培养过夜。
[实验结果]经37℃培养过夜的、在氨苄青霉素/LB琼脂平板上出现的菌落即为pUC19质粒转化的大肠杆菌。
计数菌落总数,计算制备的感受态菌的转化效率,以每mg质粒DNA转化的菌落数表示。
实验二质粒DNA的提取
[实验原理]
碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内,线状的DNA双螺旋结构解开变性,在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂,但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性,而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,不能迅速而准确地复性,它们缠绕形成网状结构。
通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来,而质粒DNA却留在上清液中。
实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳
[实验原理]
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。
由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动。
在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型,具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样,迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。
凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA,也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。
一般提取的质粒有3种构型:
超螺旋的共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircularDNA,简称cccDNA),开环DNA,即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂,(opencircularDNA,简称ocDNA),线状质粒DNA,即质粒DNA在同一处两条链都发生断裂(linearDNA,简称LDNA)。
由于这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同,因此通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带,其中超螺旋质粒DNA泳动最快,其次为线状DNA,最慢的为开环质粒DNA。
注意事项:
1.通常DNA凝胶电泳使用浓度为1%的胶,即0.25g琼脂糖加25mlATE缓冲液,在微波炉中以低中火加热2min即可。
2.电泳时,取用5ul的样品,加入1ul的6×LodingBuffer(溴酚蓝)充分混匀。
溴酚蓝充当电泳指示剂和上样缓冲剂。
当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1—2cm处,停止电泳。
3.电泳缓冲剂至电泳槽中,加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米。
4.DNA的迁移速度与电场强度成正比,一般电场强度不要超过5V/cm。
一般用100-120V即可。
5.电泳好后放入EB(溴化乙锭)溶液中染色20-30min即可,染色时间不可过长,时间过长会导致DNA分解,产生弥散。
实验四DNA重组
[实验原理]
DNA重组是将外源DNA与载体分子连接,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。
DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法。
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶,它不但能使粘性末端的DNA分子连在一起,而且能使平末端的双链DNA分子连接起来,但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
如果是单酶切,为了防止载体本身的自身连接,可以用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)处理,去掉酶切后5'端的磷酸。
这样做能有效防止质粒的自身环化,降低转化的背景,大大提高重组子的筛出效率。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性,但是在这样的温度下,粘性末端的氢键结合是不稳定的。
一般的连接条件是在12-16℃,反应12-16小时(过夜),这样既可最大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到粘性末端短暂配对结构的稳定。
连接产物转化宿主细胞后,还须对转化菌落进行筛选鉴定,挑选出所需的重组质粒。
[仪器、材料与试剂]
(一)仪器1.恒温摇床2.恒温水浴3.恒温培养箱4.小型高速离心机
(二)材料1.氨苄青霉素2.BamHI3.HindIII4.T4DNA连接酶5.pQE-31和pUC18-CAT质粒6.培养皿7.接种针8.金属涂棒9.1.5mL离心管10.酒精灯11.镊子、灭菌牙签等(三)试剂DNA琼脂糖胶纯化试剂盒(3SSpinDNAAgaroseGelPurificationKit,申能博彩公司)
[实验步骤]
制备重组DNA1.
1.在灭菌的1.5mL离心管中,加入pQE-31质粒10mL(2mg/mL),2mL酶切缓冲液,1mLBamHI和HindIII酶的混合液(各含10个单位),无菌双蒸水7mL,至反应混合物总体积为20mL,离心混匀,37℃反应过夜。
2.在另一无菌1.5mL离心管中,加pUC18-CAT质粒20mL,加入3mL酶切反应液,lmLBamHI和HindIII酶的混合液,无菌双蒸水补到30mL,37℃反应过夜。
3.反应完毕后取5mLpQE-31质粒的酶切液做电泳分析,检验酶切是否完全。
酶切完全,进行下一步。
4.将酶切处理的后pQE-31和pUC18-CAT质粒,分别上样跑琼脂糖凝胶电泳(注意加DNA分子量标准)。
电泳结束后用DNA琼脂糖胶纯化试剂盒按照试剂盒说明书的方法回收DNA片段。
前者回收的片段为3.5kb,后者为650bp。
5.将回收的pQE-31载体质粒均分为两份,其中一份与酶切后回收的CAT片段混合,做连接;另一份不加CAT片段,做对照。
操作如下:
在10mLDNA样品中,加T4DNA连接酶缓冲液1mL,T4DNA连接酶1mL,14℃(室温)过夜,然后做大肠杆菌的转化。
转化感受态细胞
Agarose胶中回收DNA:
1.用Agarose胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开,然后用干净的手术刀割下要回收DNA的琼脂块,放入1.5m1离心管中。
判定DNA片段的位置时,要尽可能使用长波长UV,在UV下照射的时间应尽可能短。
2.按每100mgAgarose胶加入400mlSolutionSN,置于55-65℃水浴中5分钟,中途混匀,至胶完全融化。
胶融化后每400mlSolutionSN加入100mlSo1utionB,混匀。
注意;高浓度的胶(1.5-2%),每100mg胶加入500mlSolutionSN,加热融胶的时间延长到15分钟,以保证胶全部融化,胶融化后加入100mlSolutionB,混匀。
3.将3S柱放入2m1收集管中,将融化的胶溶液转移到3S柱中,让盖子开着,室温放置2分钟。
盖上离心管盖(盖子也可以不盖,但是如果您同时有很多样品,担心混淆或弄翻溶液,建议您盖上盖子),室温离心(10,000rpm)1分钟。
4.取下3S柱,倒掉收集管中的废液,将3S柱放入同一个收集管中,加入600mlWashSolution,室温离心(10,000rpm)1分钟。
5.重复步骤4一次。
6.取下3S柱,倒掉收集管中的废液,将3S柱放入同一个收集管中,室温高速离心(10000rpm)2分钟。
7.将3S柱放入一根新的1.5m1离心管中,在3S柱子膜中央加入30mlTE或水,室温放置2分钟。
注意:
提高洗脱温度有利于提高DNA的洗脱效率。
也可以用预热的TE或水洗脱。
8.盖上离心管盖(盖子也可以不盖,但是如果您同时有很多样品,担心混淆或弄翻溶液,建议您盖上盖子),10,000rpm高速离心1分钟,离心管中的液体即为回收的DNA片段,可立即使用或保存于-20℃备用。
实验五转化后细菌菌落的快速裂解及质粒大小的检查
一般情况下,可以根据质粒的大小来确定它是否带有插入片段。
以下方法足以产生在琼脂糖凝胶的单个泳道上加样所需的DNA量。
操作方法如下:
1.使转化得到的细菌在含有氨卞青霉素的琼脂培养基(LB)上生长至菌落直径达1mm左右。
2.用灭菌的牙签挑取单菌落的一小部分,在含氨卞青霉素的LB琼脂平板上划线。
至少挑选20个左右的菌落照此划线,平板于37℃培养过夜,然后保存于4℃,直到相应菌落的回收。
3.在划线培养的同时,将每一菌落的剩余部分用牙签一一转移并洗脱到事先加有50uL灭菌的10mmo1/LEDTA(pH8.0)的1.5mL离心管中。
4.每管加50uL配制的0.2mo1/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液,振荡30秒。
5.于70℃温育5分钟,然后冷却到室温。
6.加3uL2mol/LKCl、0.2%溴酚蓝的溶液,振荡30秒。
7.冰浴5分钟。
8.用微量离心机于4℃以12000g离心3分钟,使细菌碎片的沉淀。
9.制备1%的琼脂糖凝胶(5mm厚),将50mL上清液加入样品槽内(5×2.5mm,长×宽)。
10.染料迁移到凝胶全长的2/3—3/4时,于室温将凝胶放入溴化乙锭溶液(0.5ug/mL水溶液)中,浸泡20—30分钟。
11.紫外灯下观察、拍照。
通过与同时点样的载体质粒的比较,不难发现重组子:
比载体质粒迁移慢的很可能是含有插入片段的重组DNA。
可从保存于4℃的重新划线的平板上挑出相应的菌落,接种于2mL含抗菌素的LB培养液中培养过夜,然后提取质粒,用做重组时相同的限制酶做酶切鉴定。
重组子应该可以切下预期大小的插入片段。
实验六GFP在大肠杆菌中的诱导表达和细菌蛋白的超声破碎抽提
(绿色萤光蛋白在蓝色波长范围的光线激发下,会发出绿色萤光)
[实验原理]
把含有外源基因的表达载体转化的大肠杆菌在有相应抗菌素和诱导物的条件下培养,可以诱导外源蛋白在大肠杆菌中表达。
利用溶菌酶、反复冻融或超声波破碎的方法将诱导培养的细菌的细胞壁破碎后,可使那些可溶性的外源蛋白释放出来,再利用硫酸铵沉淀、蛋白质层析技术和制备电泳等方法能够将外源蛋白分离纯化出来,供进一步的研究使用。
有些过量表达的外源蛋白往往在细菌中形成不溶性的包涵体,细胞破碎、离心后这些包涵体出现在沉淀中,这样的蛋白需要用高浓度的尿素或SDS变性处理后才能溶解。
超声破碎时要产生大量的热,会引起蛋白的变性。
为了避免产生高温,超声时一般使用间隔的脉冲处理,而且应在冰浴中进行。
本实验使用超声波破碎法抽提蛋白,因为表达的外源蛋白GFP(绿色荧光蛋白)比较耐高温,故省去了冰浴。
[实验操作]
1、大肠杆菌的诱导培养:
从Amp+/LB琼脂板上培养的pGLO转化的大肠杆菌中挑取2-3个菌落,接种于Amp+(终浓度为50微克/mL)的5mLLB的玻璃试管中,培养两管,放恒温摇床中,37℃培养过夜。
将其中一管保存于4℃,另一管所有5mL的培养物加到装有150mL的LB培养液的三角瓶中,加入L-阿拉伯糖干粉150毫克和氨卞青霉素(终浓度为50微克/mL),恒温摇床上37℃振荡培养过夜。
2、超声破碎抽提:
将诱导培养的大肠杆菌培养物转移到数只5mL离心管中,8000转/分离心5分钟,倾去上清液后,在沉淀上面再加培养物,继续离心,将所有的培养物都收集在一起。
每管中加入1.5mL的细菌蛋白抽提液(100mmol/LNaCl,10mmol/LEDTA,pH8.0),用枪吹打,使沉淀悬浮。
将离心管放在小试管架上,将超声波破碎仪的金属头插到离心管中,调整好试管的位置后关上超声破碎仪的门,打开仪器的电源,对每只离心管中的菌体进行超声破碎。
条件:
功率80瓦,工作2秒,间隔2秒,每一次处理5个循环。
4次处理后,8000转/分离心5分钟。
取出离心管,在紫光灯下观察离心管底的沉淀,如果大量沉淀仍然为绿色,则说明破碎不够,继续按前面方法再超声处理2次,然后再离心。
如果仅有很少的绿色沉淀或根本看不到,说明破碎完全。
小心吸出上清液,集中放到干净的5mL离心管中,体积不要超过4mL,逐步地加入少量硫酸铵干粉,使达到饱和,8000转/分离心5分钟。
将离心管取出,放紫光灯下观察,沉淀中应该能看到明亮的绿色荧光。
将上清液倾去,蛋白沉淀物4℃保存,或冷冻于-20℃。
实验七免疫双扩散检测抗GFP血清抗体
[实验原理]
在溶液中的可溶性多价抗原与血清抗体相遇,当两者的比例适当时可以形成一种网状的不溶性的大分子复合物,这叫作免疫沉淀反应。
当这样的抗原和相应的抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相对扩散时,在抗原与抗体的比例适当处会形成可见的沉淀线,这叫免疫双扩散实验,是免疫沉淀反应的一种。
免疫双扩散常用于动物免疫效果的检测和血清抗体效价的测定。
本实验使用的粗抗原是大肠杆菌表达的GFP的抽提物,抗体是GFP免疫兔子后得到的抗血清。
1、1.5%琼脂的配制:
pH7.4的PBS100mL中加1.5克琼脂,微波炉中小功率加热,使琼脂完全溶化。
2、取干净的载玻片,平放于实验台(台面要水平),将融化的琼脂趁热加在载玻片上(约加4mL),使琼脂铺满整个玻片的表面(注意勿使琼脂流出玻片之外)。
令其在室温下冷却凝固。
3、将载玻片放在画好的打孔式样的样板上,用自制打孔器(内径2-3毫米)在琼脂上照样板打孔,做两朵“花”。
用针头小心地将打好的孔中的琼脂挑出,当心不要碰伤了孔周围的琼脂。
打好孔后,把凝胶的右下角切掉一小块,作为标记。
4、GFP抗原的稀释:
用上次实验得到的GFP粗提物的饱和硫酸铵沉淀,加100mL的PBS使溶解,此为抗原的原液。
取出原液15mL,在一小块封口膜上用PBS做系列的倍比稀释,直到稀释为1:
16。
5、在左边一朵花的中央孔中加约15mL的免疫后兔血清,周围孔加不同稀释度的GFP粗提物。
右边的一朵花除中央孔中加免疫前的兔血清外其余的与左边的相同。
加样时将每孔加满即可,注意不要使溢出孔外。
6、在小塑料盒中铺一块滤纸,加少量水将滤纸浸湿,上面放两根牙签,将加好样的载玻片放在牙签上,盖好盒盖,放37℃温箱中过夜。
[实验结果的观察]
将载玻片从塑料盒中取出,在散射光的背景下(载玻片后方约15厘米处用手或深色物挡住)观察,或在特殊的装置上观察,在左侧的抗体孔与适当稀释的抗原孔之间可见白色的沉淀线,而右侧的对照则无。
如果将载玻片放在紫光灯下观察,沉淀线会发出绿色荧光,这说明抗原-抗体复合物中含有GFP。
实验八SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测外源蛋白的表达
[实验原理]
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)是蛋白分析中最经常使用的一种方法。
它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS)以及巯基乙醇一起加热,使蛋白变性,多肽链内部的和肽链之间的二硫键被还原,肽链被打开。
打开的肽链靠疏水作用与SDS结合而带负电荷,电泳时在电场作用下,肽链在凝胶中向正极迁移。
不同的大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同,在迁移过程中逐渐分开,其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。
1.装配做胶用的玻璃板:
做1.0mm厚的胶。
2.配置蛋白胶(分离胶+浓缩胶)
配制浓度为12%的分离胶(凝胶浓度应根据被分离蛋白的分子量进行选择),总体积10mL(刚好灌制两块胶)混匀后加入两玻璃夹缝中,并小心在胶面上加入1cm蒸馏水(在胶面上加蒸馏水称水封,目的是保持胶面平整,并防止胶与空气接触,影响胶的聚合),室温放置,等胶自然凝聚后(此时在胶面与水封之间可见清晰的界限),将水封倾去。
这时可以开始配制4%的浓缩胶,总体积3.0mL(够做两块板的浓缩胶)混匀后加入到玻璃板的夹缝中,然后在把1mm的梳子插进浓缩胶中,注意在梳子和浓缩胶之间不要留有气泡。
如果发现有较大的气泡,一定要想法去掉(可以插拔梳子或指弹气泡处的玻璃等),否则会影响电泳结果。
待浓缩胶凝固后。
如果发现拔出梳子后形成的加样孔之间的间隔发生扭曲,用注射器的针头小心加以整理,使之齐整。
3.细菌培养物SDS-PAGE样品的制作
同时做L-阿拉伯糖诱导的和未加L-阿拉伯糖的两个大肠杆菌样。
取细菌培养物1.5mL加到1.5mL小离心管中,12000r/m离心3分钟,去上清。
在离心沉淀中加约等体积的蒸馏水,用枪头小心地吹打,使细菌充分悬浮,直到没有明显的小团块,然后加入等体积的2×样品缓冲液,在100℃沸水浴(或干式培养器)中保温5min。
此时如用枪头吸取样品,会发现非常粘稠,呈鼻涕状,这是因为有样品中含有大量DNA的结果。
要用胰岛素注射器将样品从极细的针头中打出,反复多次才能将DNA分子打断,使样品变得不再粘稠为止。
将样品14000r/m离心5分钟,使不溶物沉淀下来,小心吸取上清加样。
电泳样品的处理直接关系到电泳结果的好坏,一定要认真做样,否则跑不出好胶来。
4.电泳槽组装
固定好后,将整个部件放到电泳槽的外壳中,然后加电极缓冲液。
内槽液的液面要高出玻璃板“三明治”的凹玻璃至少5mm,以保证能够导电,且电场均匀,此时可以拔出梳子。
5.加样
按事先设计好的顺序与加样量依次加样。
在样品的浓度未知的情况下,同一样品可加一梯度,即每一泳道的加样量依次减半。
这样,在做第二次电泳时可以其作为参考,正确加样。
蛋白分子量标准可以加在靠中间的加样孔中,也可加在离边的第2道处(最靠边的一道样品往往会明显跑斜)。
6.电泳
将电泳槽的盖子盖上,把电泳槽的两个电极接到电泳仪上(注意电极不要接错),然后接通电源。
先将电压调到80V,当样品进入分离胶时,调节电压使恒定在150V。
当溴酚蓝移动到离底部约0.5cm时,关掉电源,停止电泳。
将玻璃板从电泳槽中取出,小心地用旧的电话卡撬开两玻璃板,暴露出胶面。
将浓缩胶部分去掉不要,分离胶放到塑料盒中染色。
7.染色和脱色
凝胶在考马斯亮蓝染色液中染色20分钟(摇床上缓慢振荡),然后倾去染色液(染色液回收,可反复用数十次),用自来水洗几下,去掉凝胶上和塑料盒中的染色残液,加脱色液脱色(摇床上缓慢振荡),1小时后换一次脱色液,振荡脱色过夜。
彻底脱色后的凝胶蛋白条带清晰,背景透明干净。
这时可以将凝胶拍照或用扫描仪进行扫描,作为永久记录。
[实验结果]
染色后的聚丙烯酰胺凝胶上可见许多大大小小的条带。
比较两个大肠杆菌样品,经阿拉伯糖诱导的与未加阿拉伯糖诱导的,前者在约25kD处明显多一条带,这就是GFP所在的位置。
实验九GFP的免疫印迹
[实验原理]免疫印迹(Westernblotting或Immunoblotting)一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。
第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。
第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上,用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC膜)和PVDF膜,蛋白转移的方法多用电泳转移(转移电泳),它又有半干法和湿法之分。
第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。
免疫检测的方法可以是直接的和间接的。
现在多用间接免疫酶标的方法,在用特异性的第一抗体染色后,再用酶标的第二抗体(碱性磷酸酶(Ap)或辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗第一抗体的抗体)染色,再加酶的底物显色,通过膜上的颜色或X光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。
为了使初学者能够在实验过程中观察到所要检测的目的蛋白,本实验使用的是非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳,以保持GFP的天然活性,利用荧光对其进行追踪。
此外,实验中用国产的HRP标记的蛋白A取代第二抗体,以节省费用。
蛋白A是从细菌分离的一种能识别多种动物IgG的蛋白,在许多场合它都可以作为第二抗体的替代物。
同样是为了节省费用,实验中用醋酸纤维素膜(AC膜)代替硝酸纤维素膜(NC膜),这样要便宜得多,而效果却无大差别。
第一部分:
GFP抽提物在非变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳
非变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳,除试剂中不含SDS及蛋白样品不加热处理外,其余的与SDS-PAGE几乎相同。
因为要做免疫印迹,电泳结束后,凝胶不染色,而是做转移电泳。
[实验操作]
1.装配做胶用的玻璃板;:
2.做胶:
3.非变性凝胶电泳蛋白样品的制作
4.电泳槽组装
5.加样
6.电泳
7.剥离凝胶
第二部分:
免疫印迹染色
1.将醋酸纤维素膜(AC膜)事先裁成比需要转移的凝胶块略大的小块。
2.在搪瓷盘中加入转移电泳缓冲液,将AC膜在转移电泳缓冲液中浸泡,使完全浸透。
同时把两块海绵也在转移电泳缓冲液中浸透。
3.将转移夹打开,置搪瓷盘中,在有黑色标记的一半上放上一块已浸透了转移电泳缓冲液的海绵,把贴在滤纸上的凝胶块滤纸面向下放在海绵上,在转移电泳缓冲液中使AC膜紧贴在凝胶上,切勿使AC膜与凝胶间留有气泡。
再把一张滤纸浸透,小心地放在AC膜上,其上再放上另一块海绵。
将转移夹合上,夹紧,做成“三明治”。
4.转移电泳槽中放入转移电泳缓冲液,将“三明治”夹放入,使凝胶块(即黑色的一面)朝向负极,AC膜朝向正极,切勿放错方向,否则蛋白将跑到溶液中,而不是转移到膜上。
5.接通电泳仪电源,使电流达到100-150mA,电泳转移过夜。
6.转移电泳完毕,将转移“三明治”夹从转移电泳槽中取出,将夹子打开,用镊子捏住AC膜的一角,将AC膜有蛋白的一面朝上放在一块干净的滤纸上。
于暗处在紫光灯下,仔细观察发绿色荧光的条带的位置,用铅笔点一些点子,标出它。
7.将AC膜蛋白面朝上置于小塑料盒中,加丽春红染液10-20mL,染色3分钟,用蒸馏水轻轻漂洗数次至背景红色消失。
这时应该可以看到转移到膜上的蛋白条带。
8.倾去漂洗的蒸馏水,在小塑料盒中加入封闭液10mL,室温下于脱色摇床上缓慢振荡1小时。
9.倒出封闭液(弃去),用PBS洗一次,加PBS稀释的一抗溶液5mL,室温下缓慢振动3小时或过夜。
10
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