生物基因工程复习要点考试必备资料.docx
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生物基因工程复习要点考试必备资料
质粒DNA的形态:
超螺旋,开环,线状
质粒的不亲和性:
(1)质粒具有不相容性,即在没有选择压力的条件下,两种不同的质粒不能稳定地共存于同一细胞.
(2)宿主细胞内.相互不相容的质粒属于同一个不相容群;而属于不同的不相容群的质粒可稳定地共存于同一宿主细胞中。
原因:
竞争相同的转录,复制因子.
质粒载体(改造)的基本要求
1.复制原点--能自主复制,宿主专一性;
2.选择标记--便于筛选,;
3.多克隆位点--插入外源基因,不影响本身的复制;
质粒功能分类
1、克隆载体(PUC)
2、表达载体(pET,pGEX,pTXB1等)
区别:
克隆载体有较强复制能力,有利于基因保存和扩增,提供丰富酶切位点。
有较强复制元件,不具备表达元件,被克隆的基因不一定会表达但一定会大量复制。
表达载体是克隆结束后,为特定细胞内表达而构建。
有各种各样的启动子以适应不同种类的细胞,而且有各种各样的表达调控。
是否含有表达系统元件是区别克隆载体和表达载体的标志。
Ⅱ型核酸内切酶基本特征
1、每一种酶都有各自特异的识别序列。
(1)序列不同
(2)长度不同:
4-7bp
(3)但与DNA来源无关
2、识别序列一般具有回文结构。
5’G↓AATTC3’
3’CTTAA↑G5’
3.切割后,产物的特点
(1)5’-pi,3’—OH
(2)平端
粘端--都是5’突出或都是3’突出
(3)粘端可重新通过氢键配对
4.特殊性质Ⅱ型核酸内切酶的特殊性质
1、同位酶:
识别相同序列,但切割位点不一样的酶(如SmaI和XmaI)
2、同尾酶:
识别位点不同,但切割出相同的末端序列(BamHI和BclI);
3、同裂酶:
识别位点和切割位点都相同的酶(HpaI和HincⅡ);
4、甲基化的调节:
MspI(所有)和HpaⅡ(非甲基化)
5、Star活性(星号活性):
在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别序列类似的序列。
在酶的名称右上角加一个星号(*)表示,如EcoRⅠ*。
6、位置效应
酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同(侧翼序列太短无法切)
酶切反应要点
1.温度:
一般37°C,特殊25°C(SmaI)
2.对Na+要求不一样分成3类:
【低盐(0)】【中盐(50mM】【高盐(100mM)】
3.尽量使反应体积最小,但酶的用量不超过总体积的10%(甘油抑制酶活)
4.决不能用水稀释,以免变性失活。
5.先配好其它试剂,最后才加酶;
6.取酶立即放于冰上,用完后立即放入-20°C。
7.使用无菌的新枪头。
双酶切的技巧
1、两种酶buf不一样
(1)选通用buf
(2)先用(低盐buf+E低)反应,后补高盐buf+E高反应;
2.两种酶反应温度不一样:
(1)先(E1+T1)反应,后(E2+T2)反应;
3.E1结果影响E2反应:
(1)先加E2反应,后加E1反应
连接酶(DNAligase)
在E.coli和动植物细胞中都有此酶。
能催化DNA中相邻的3`-OH和5`-P之间形成磷酸二脂键。
T:
多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15℃以下,然而保持连接酶活性的最适温度却是37℃,因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷。
经常采用16℃(4-16℃)。
DNAconcentrations:
外源片段浓度比载体DNA浓度高10-20倍
防止环化:
碱性磷酸酶预先处理质粒载体
平端连接:
加大酶量
Taq酶
耐热DNA聚合酶:
94℃能较长时间保持活性,最适温度72℃;
方向:
5’3’
底物:
模板+引物+dNTP(还需Mg2+)
反应速度:
1kb/min
不同种类的Taq酶功能不同.
用途:
(1)PCR
(2)sequence
(3)TAclone
Klenow酶
特点:
(1)DNA聚合酶Ⅰ的C-端大片段(被枯草杆菌蛋白酶切割)
(2)MW=76kD
(3)5`→3`聚合酶活性(合成)
(4)3`→5`外切酶活性(矫正)
用途:
(1)DNA探针的标记
(2)平端化:
补平3’凹端或切除3’凸端
核酸酶S1(nucleaseS1)
1、是单链(ssDNA,ssRNA)特异性核酸酶。
2、产物5’-pi
3.pH4.5,Zn2+
用途:
(1)分析RNA·DNA杂合结构(内含子);
(2)除去DNA的单链末端,生成平端;
(3)切断双链DNA的发夹结构。
反转录酶(需要引物,1/500出错率)
主要特点:
(1)RNADNA(√)
(2)DNADNA
(3)外切RNA
(4)不具有纠错功能
用途:
(1)mRNA转录成cDNA
(2)以ssDNA或RNA为模板合成杂交探针
T4多核苷酸激酶(Kinase)
作用原理:
催化ATP的γ-Pi转移到DNA或RNA的5’-OH,使之磷酸化。
用途:
放射性标记DNA链的5’末端,探针标记
碱性磷酸化酶
作用原理:
切除DNA、RNA、rNTP和dNTP上的5’磷酸基团,变成5’OH。
用途:
(1)从DNA片段上除去5’磷酸以防自身连接。
(2)在放射性标记DNA5’末端前,除去磷酸。
琼脂糖凝胶电泳的原理
1.DNA电泳迁移:
电荷效应+分子筛效益
(1)DNA带负电,电场中,向正极移动;
(2)决定移动速度三因素:
DNA大小,电荷数,构型;
(3)线性DNA分子移动速度与其分子质量的对数成反比;(分子量越大,跑得越慢)
2、检测原理:
(1)溴化乙锭(EB)可插入双链DNA分子中,在紫外光照射下,发射荧光。
琼脂糖凝胶电泳用途
1.DNA分子量测定(距离->分子量)
2.基因,克隆的鉴定(通过1完成)
3、不同长度的基因片断的分离
4、DNA浓度的测定(荧光的强度与DNA含量成正比)
*也可用于蛋白的分离鉴定
加标准分子量DNAMarker,测定分子量
加标准浓度的DNA,测定浓度
琼脂糖凝胶电泳技术要点
1.不同浓度凝胶分辨DNA片段能力不一样
(1)低:
不利于小片段的分辨(扩散)
(2)高:
不利于大片段的分辨(迁移不动)
(3)一般选1.0%
2.凝胶要用缓冲液配(TBE或TAE)
3.EB强致癌,带手套操作;
4.agarose(琼脂糖)---电泳
agar(含琼脂糖和琼脂胶)---平板培养基
SDS-PAGE电泳原理
1.SDS(带负电)和还原剂破坏蛋白的高级结构,同时SDS与蛋白定量结合,消除蛋白之间的电荷差异,使得蛋白的迁移率主要依赖分子量(分子小跑得快).
2.不连续电泳:
上层为浓缩胶,可将样品压缩到同一起跑线,下层为分离胶;可获得更高的分辨率.
3.考马斯亮蓝进行染色.
SDS-PAGE电泳用途
1.蛋白分子量的测定
2.蛋白浓度的测定
3.蛋白的鉴定(通过1来实现)
SDS-PAGE技术要点
1.浓缩胶一般用5%,
分离胶:
次高分子(10万-20万)用7%,
低分子(1.4万-10万)用12%
2.PAGE配制时带手套,(Acr-Bis液体有积累性神经毒,聚合后无毒)
3.SDS-PAGE测定的是单体蛋白分子量;(多亚基不行)
4.SDS-PAGE不适于:
(1)电荷异常蛋白:
组蛋白(+电多)
(2)构象异常的蛋白
(3)带有较大辅基的蛋白--糖蛋白,脂蛋白。
PCR技术原理
循环过程(32次左右)
1.解链:
94℃,30s
2.引物结合:
?
℃(Tm-5),30sTm,解链温度,55~58最佳
3.延伸:
72℃,?
Min
特点
1.引物两条,以2n指数扩增(前20-25次),后面扩增效率降低,30次以后,基本进入平台期。
2.引物结合温度?
℃,一般为50-55℃,需要调整;
3.延伸时间?
Min需要调整,一般1kb/min.
PCR技术操作要点
1.灵敏度高,防止污染,出现假阳性(带手套,设立阴性,阳性对照);
2.特异性----A.引物的设计;
B.退火温度;
3.PCR扩增程序的设计;
4.平台期,
5.dimer的形成.
测定的序列靠近引物(起点)20~30bp不准,500bp后的序列也不准。
BLAST:
“局部相似性基本查询工具”(BasicLocalAlignmentSearchTool)的缩写,Blast是NCBI研制的一个生物基因数据库系统的查询工具,功能强大,检索速度快,流行于世界上几乎所有的生物信息中心。
Blastn:
用核酸序列搜索核酸序列数据库
Blastp:
用蛋白质序列搜索蛋白质序列数据库
Blastx;用核酸序列(翻译成蛋白质)搜索蛋白质序列数据库
克隆策略的设计
1、平端克隆;(载体需脱磷;方向可正可反)
2、粘端克隆
(1)TA克隆
(2)单酶切不定向克隆
(3)双酶切定向克隆
TA克隆
1、普通Taq酶扩增的PCR产物3’末端会多加一个A;
2、公司提供的T-vector的5’末端有一个粘性的T;
用途:
(1)PCR产物快速克隆:
(2)基因测序(可正可反);
(3)利用T-vector上的MCS,为下一步克隆调整酶切位点
单酶切不定向克隆
载体需要脱磷(否则,自连效率极高,外源基因无法插入);
基因插入可正可反,需要筛选。
双酶切定向克隆
类型:
(1)粘-粘连接:
最有效、最快捷
(2)粘-平连接:
适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点,可将另一末端补平
特点:
(1)基因和载体都用两种酶切割;
(2)连接效率高;
(3)外源基因插入方向固定,不用鉴定。
注意点:
1.两个同尾酶切出的末端一样,相当于单酶切不定向克隆;
2.载体MCS中的两个酶切位点要远一点,防止一端没切透;(可选用中间插入其它基因片断的载体酶切回收制备)。
引物设计
5’附加酶切位点(定向克隆)
1、不同酶的保护碱基序列不同;NEBcatalog提供相关资料。
2、有些酶的保护碱基包含其它酶切位点,注意双酶切的先后顺序:
Nde1EcoR1
质粒的提取原理-碱裂解法
感受态细胞的制备
1.菌种活化
2.取0.5ml菌液至50mlLB培养液中;
3、37℃,振荡培养2h至对数期;
4、转至50ml无菌塑料管,0℃*10min;
5、5000rpm*10min*4℃
6、取沉淀,加25ml50mMCaCl2【0℃,无菌】
7、5000rpm*10min*4℃
8、取沉淀,加2ml含15%甘油的50mMCaCl2重悬,200ul/tube分装,液氮速冻后至-80℃冰箱保存(半年有效)。
注意:
(1)需要做一个无质粒的对照
(2)并用已知质粒转化,鉴定感受态细胞的转化效率--大约106【1ugPUC质粒,产生克隆106】
基因的制备(*)
连接1、总体积为10ul;
2、16℃连接过夜;
3、基因mol/载体mol≈10;【平端≈15】
转化
1、连接产物5ul加入感受态细胞中;
2、混匀,冰上30min------------------------cell吸附DNA
3、42℃,90s------------------------热击,促进DNA进入cell
4、冰上1~2min-------------------------使细胞复原
5、加1mlLB(无Amp)-------------------外源DNA还未表达
6、37℃培养1h------------------------Amp抗性基因表达
7、6000rpm*30s,浓缩100ul
8、涂板(Amp板)-----------------------抗性筛选
9、37℃培养过夜。
常用的融合表达载体
PGEX系列:
N端融合GST蛋白,用GST柱亲和纯化;谷胱甘肽洗脱,用Xa因子酶切除去亲和Taq。
PTXB(pTYB)系列:
N端(或C端)融合CBD蛋白,用chitin柱亲和纯化;DTT诱导柱上切割纯化。
pET系列:
融合6hisTaq,用镍柱亲和纯化,用Xa因子酶切除去亲和Taq。
。
融合蛋白的功能
1、提高外源基因的表达量
2、帮助外源基因正确折叠(可溶)
3、提供亲和标记,方便纯化;
4、提供亲和标记的还可作为检测靶点,方便检测。
真核基因在原核中表达常见问题
1、要用原核基因的表达载体(P,O,SD)
2、要去除内含子(mRNA制备)
3、密码子的偏好性
4、要注意插入读框正确。
5、表达蛋白的稳定性:
(1)使用蛋白酶缺失的工程菌:
(Ion-蛋白酶缺失的工程菌)
(2)使用融合蛋白
6、防止产生包涵体:
(1)使用融合蛋白,帮助正确折叠;
(2)使用辅助质粒,产生分子伴侣,帮助正确折叠
(3)降低温度,缓慢表达,帮助正确折叠;
(4)减少诱导剂的量,缓慢表达,帮助正确折叠;
(5)使用不同的培养基和金属添加剂。
(6)使用低拷贝的质粒
一、原核表达的优缺点:
1、表达量大,成本低,操作简单。
2、不能进行修饰,可能有些蛋白没有生物活性。
二、真核表达系统优缺点:
1、表达量低,成本高,操作复杂;
2、能进行翻译后修饰,保持蛋白的生物活性。
△分子克隆流程
1、分析基因,载体特点;
2、设计克隆策略;
3、检测基因,载体的正确性;
4、制备感受态细胞,目的基因,载体;
5、连接,转化。
6、筛选克隆
(1)Amp抗性初筛;
(2)PCR筛选(或酶切筛选);
(3)表达筛选(SDS-PAGE和亲和筛选);
(4)测序验证
(5)生物活性筛选。
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