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HPLC法检测匹可硫酸钠的有关物质
摘要
目的:
确保匹可硫酸钠有关物质检测方法准确、重现并耐用,为建立检验操作程序提供依据。
方法:
采用高效液相色谱法(HPLC)测定匹克硫酸钠有关物质,以BostonC18柱(250mm×4.6mm,5μm)作为分析色谱柱,以乙腈为流动相A,以0.067mol·L-1磷酸盐溶液(用NaOH调PH值至7.0)为流动相B;流速为1.0mL·min-1,进样量20μL,检测波长为263nm,柱温30℃;结果:
该方法重复性较好,精密度高,匹可硫酸钠有关物质4,4-(2-吡啶亚甲基)双酚浓度在0.03588μg·mL-1~294μg·mL-1范围内线性良好(r=0.9995);结论:
本文所建立的高效液相色谱法检测匹可硫酸钠有关物质,方法简捷、省时,结果准确可靠,可成为匹可硫酸钠更科学的的质量控制依据。
关键字匹可硫酸钠;高效液相色谱法;有关物质;4,4‘-(2-吡啶亚甲基)双酚钠
AHPLCmethodfordeterminationoftherelatedsubstancesinsodiumpicosulfate
Abstract:
Objective:
toensurethatthemethodfordeterminationoftherelatedsubstancesinsodiumpicosulfateaccurate,reproduceanddurable,thethesisprovidesthebasisfortheestablishmentoftheinspectionprocedure.Methods:
HPLCmethodwasadoptedfordeterminationoftherelatedsubstancesinsodiumpicosulfate,usingAgilentC18columm(250mm×4.6mm,5μm)astheanalyticalcolumn,themobilephaseAwasacetonitrile,andthemobilephaseBwasphosphatesolution(thesolutionwasadjustedbysodiumhydroxidesolutiontoPH7.0),theflowratewas1.0ml·min-1,thevolumeofinjectionwas20μL,thedetectionwavelengthwas263nm.,andthetemperatureofthecolumnwas30℃.Results:
Thecalibrationcurveoftherelatedsubstancenamed4,4‘-[(Pyridin-2-yl)methylene]bisphenolinsodiumpicosulfatewaslinearintherangeof0.03588~294μg·mL-1(r=0.9995),Themethodhasagoodrepeatabilityandhighprecision,RSD%=0.500%(n=6).Conclusion:
Themethodfordeterminationoftherelatedsubstancesinsodiumpicosulfatewassimple,quickandaccurate.
Keywords:
sodiumpicosulfate,HPLC,therelatedsubstances,4,4‘-[(Pyridin-2-yl)methylene]bisphenol
引言
匹可硫酸钠中文又名吡苯氧磺钠;4,4’-(2-吡啶亚甲基)双酚双磺酸酯二钠一水合物;匹克硫酸钠。
分子式:
C18H13NNa2O8S2.H2O,分子量:
481.41,分子式:
。
匹可硫酸钠属于刺激性泻药类的,由意大利DeAngeli公司开发,并于1966年上市销售。
2012年7月16日,匹可硫酸钠获得FDA批准,用于成人行结肠镜检查前的结肠清洁。
匹可硫酸钠导泻作用温和,不仅适用于各种形态的便秘,还可免除因痔疮或肛裂等引起的排便疼痛,亦用于排便困难,具有较好的疗效。
因此,匹克硫酸钠的研发对改善人民的健康水平具有的重要影响,定能创造可观的社会效益。
匹可硫酸钠【4,4’-(2-吡啶亚甲基)双酚双磺酸酯二钠一水合物】是具有独特作用方式的特殊缓泻剂,通常,在胃以及小肠内,由于缺乏相应的酶,口服以后不易被分解,然而在大肠中,菌丛里的芳基硫酸脂酶可将其水解为活性形式的二酚化合物,此外,二酚化合物还可以由匹可硫酸钠中的硫酸钠基团水解反应产生所得。
二酚化合物对大肠粘膜能产生较强刺激反应,使大肠蠕动增强,水分吸收快速减弱,排泄减慢,从而达到缓泻的效果。
在匹克硫酸钠原料药的生产、制备、储存中,其有关物质的控制尤为重要,有关物质4,4‘-(2-吡啶亚甲基)双酚钠对匹可硫酸钠的纯度和稳定性有重要影响。
因此,有关物质4,4‘-(2-吡啶亚甲基)双酚钠的研究是匹克硫酸钠药品质量研究中关键性的项目之一。
而高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography),随着其设备不断改进优化,自动化水平提高,目前已广泛应用于化学、生物的分离分析,发展成为一门系统、全面、重要的科学技术。
HPLC采用高压输液系统、高效固定相、高速流动相和高灵敏度检测器,分离效率远远高于其他分离技术如蒸馏、萃取、离心等方法。
样品用量少。
用极少的样品就可以完成一次分离和测定。
因而具有高速、高效、高灵敏度、操作自动化等优点。
除此之外,HPLC中制备样品简单,回收样品也比较容易。
因此,采用HPLC法检测匹可硫酸钠的有关物质。
1.仪器与试剂
1.1仪器
日本岛津液相色谱仪,包括LC-10ATvp输液泵,LC-10ATvp检测器,手动进样器,岛津工作站LC-solution;岛津万分之一电子分析天平(型号:
AUX-120);KQ5200B型超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司。
1.2试剂
匹可硫酸钠;乙腈(色谱纯,美国Burdick&Jackson公司);超纯水;磷酸二氢钾(分析纯,重庆市北碚化学试剂厂);磷酸二氢钠(分析纯,广东市化学厂有限公司);氢氧化钠(分析纯,成都市科龙化工试剂厂);匹可硫酸钠(,含量:
99.5%),
2.检测方法
2.1色谱条件
色谱柱:
BostonGreenODSC18柱长×内径:
250×4.6mm填料粒度:
5μm
流动相A:
乙睛
流动相B:
0.067mol/L磷酸二氢钾39ml与0.067mol/L磷酸二氢钠61ml混匀,用NaOH溶液调PH=7.0。
溶剂:
流动相A:
流动相B=22:
78
时间(min)
溶液A(%)
溶液B(%)
0
20
80
10
20
80
15
30
70
25
30
70
30
40
60
50
40
60
检测波长:
263nm流速:
1mL/min
进样量:
20μL柱温:
30℃
2.2测定方法
2.2.1供试品溶液配制
精密称取匹可硫酸钠25mg,置25mL容量瓶内,加溶剂溶解后,稀释至刻度线,若未溶解完全则超声震荡至完全溶解,再摇匀,即得供试品溶液。
2.2.2样品的测定
待仪器基线平稳后,精密量取供试品溶液20μL,注入液相色谱仪,记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。
所得结果按峰面积以面积归一法计算,即得供试品及杂质4,4-(2-吡啶亚甲基)双酚的纯度。
2.3实验结果
依据上述色谱条件、测定方法和步骤分别对三批样品(批号如下)进样并进行分析,其结果如下(表1):
表1HPLC法测定样品纯度的结果
批号
匹可硫酸钠纯度(%)
(8.8min)
4,4-(2-吡啶亚甲基)双酚纯度(%)
(27.6min)
01
99.75
0.12
02
99.73
0.10
03
99.77
0.11
3.方法学验证
方法学验证是对测定方法的评价,是建立新方法的研究内容和依据。
3.1方法专属性
3.1.1目的
确定该方法可以完全分离所有的已知杂质和潜在杂质,且匹可硫酸钠主峰中不含干扰杂质。
3.1.2操作方法
(1)配制空白溶液,进样,证明空白溶液对样品测试无干扰。
(2)称取匹可硫酸钠样品50mg置50ml容量瓶中,用匹可硫酸钠溶剂溶解并稀释至刻度线,混匀,进样,确定保留时间,证明该条件是否可以真正分离并测试匹可硫酸钠样品。
(3)称取4,4‘-(2-吡啶亚甲基)双酚20mg置100ml容量瓶中,用匹可硫酸钠溶剂溶解并稀释至刻度线,混匀,进样,确定保留时间。
(4)将3.1.2.2和3.1.2.3配制的样品混合,进样并计算分离度,以确认匹可硫酸钠能与4,4‘-(2-吡啶亚甲基)双酚很好的分离。
3.1.3可接受标准
(1)稀释剂空白对样品测试应无影响。
(2)混合样品中,4,4‘-(2-吡啶亚甲基)双酚和匹可硫酸钠分离度均应大于1.5。
3.1.4方法专属性测试结果
名称
匹可硫酸钠
4,4‘-(2-吡啶亚甲基)双酚
单独进样
保留时间
8.903min
27.598min
混合
进样
保留时间
8.825min
27.534min
分离度
―――
29.574
3.1.5样品图谱如下
(图1)空白溶剂
(图2)4,4‘-(2-吡啶亚甲基)双酚
(图3)匹可硫酸钠
(图4)匹可硫酸钠和4,4‘-(2-吡啶亚甲基)双酚
3.2系统适应性实验
色谱系统适用性试验通常包括四个重要指标:
理论塔板数、分离度、重复性和拖尾因子。
按相关标准对色谱系统进行适用性试验,即用规定的对照品对色谱系统进行试验,应符合要求。
如达不到标准,可对色谱分离条件作适当的调整。
3.2.1目的
确认用该仪器系统运行相关物质测试方法的验证是否符合要求。
色谱柱的理论板数(n):
理论塔板数是色谱中塔板理论里评价色谱柱优劣的一个参数,也是我们选择是否合理的一个参数。
用于评价色谱柱的分离效能。
分离度:
无论是定性鉴别还是定量分析,均要求待测峰与其它峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。
分离度是用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度,是衡量色谱系统效能的关键指标。
3.2.2操作方法
(1)配制空白溶液,进样。
(2)称取匹可硫酸钠25mg置25ml容量瓶中,用匹可硫酸钠溶剂溶液溶解并稀释至刻度线,混匀,进样计算匹可硫酸钠峰的理论塔板数和与相邻峰的分离度。
3.2.3可接受标准
匹可硫酸钠峰的理论塔板数不低于2000.,与相邻峰的分离度不小于1.5。
3.2.4实验结果
理论塔板数计算公式:
n=5.54(tR/Wh/2)2分离度计算公式:
批号:
150201
名称
未知杂质
匹可硫酸钠
未知杂质
4,4-(2-吡啶亚甲基)双酚
保留时间
7.459min
8.903min
15.928min
27.546min
理论塔板数
7119
4655
7507
29755
分离度
——
3.049
11.429
16.912
3.3检测限测试
检测限(LOD)是被测物给出可测定响应信号的最小值,它是限度检验效能指标,无需定量测定,只要指出高于或低于该规定浓度即可。
检测限往往取决于信噪比的大小,信噪比法:
用于能显示基线噪音的分析方法(仪器分析方法),是把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较,算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。
3.3.1目的
确定在该色谱条件下,被测物可以被检出的最低量。
3.3.2操作方法
准确配制4,4‘-(2-吡啶亚甲基)双酚溶液以及匹可硫酸钠溶液,逐级稀释至一定浓度后进样1次。
计算其峰高与噪声的比值(信噪比),其信噪比(S/N=3±1)的样品浓度即为最小检测限浓度。
3.3.3可接受标准
应满足信噪比S/N=3±1。
3.3.4实验结果
物质名称
浓度
(ppm)
保留时间(min)
样品信号值
噪音值
S/N
检测限(ppm)
4,4‘-(2-吡啶亚甲基)双酚
0.010586
27.699
33.72
10.45
3.22
0.010586
匹可硫酸钠
0.05794
9.023
39.84
14.79
2.69
0.05794
3.4最小定量限测试
最小定量限测试亦称定量限(LOQ),指样品中被测物能被定量测定的最低量。
3.4.1目的
确定在该色谱条件下,被测物可以被准确定量的最低限度。
3.4.2操作方法
准确配制4,4‘-(2-吡啶亚甲基)双酚溶液以及匹可硫酸钠溶液,逐级稀释至一定浓度后进样1次。
计算其峰高与噪声的比值(信噪比),其信噪比(S/N=10±1)的样品浓度即为定量限浓度。
3.4.3可接受标准
应满足信噪比S/N=10±1。
3.4.4实验结果
物质名称
浓度
(ppm)
保留时间(min)
样品信号值
噪音值
S/N
检测限(ppm)
4,4‘-(2-吡啶亚甲基)双酚
0.03504
27.769
110.37
10.45
10.56
0.03504
匹可硫酸钠
0.19584
8.999
151.60
16.62
9.12
0.19584
3.5线性
线性系指在设计的范围内,测定响应值与试样中被测物浓度呈比例关系的程度。
3.5.1目的
考察该检测方法,4,4‘-(2-吡啶亚甲基)双酚和匹可硫酸钠在定量限到杂质标准150%的范围内,浓度与峰响应线性关系是否良好。
3.5.2操作方法
(1)称取4,4‘-(2-吡啶亚甲基)双酚样品,在验证范围内选择合适间隔的6个浓度点(包括标准点、定量限点及最高点),配制相应的溶液。
(2)每个浓度点测定2次,保存并记载色谱图。
(3)以样品平均浓度对相应平均峰面积做回归曲线,计算回归方程及相应的线性回归系数。
3.5.3可接受标准
相关系数应大于0.999。
3.5.4线性数据
(1)4,4‘-(2-吡啶亚甲基)双酚数据及其图表
编号
1
2
3
4
5
6
浓度(mg/mL)
0.00003588
0.095
0.156
0.214
0.248
0.294
峰面积(mAU*s)
593
3156439
5247275
6801847
7992627
9603840
回归方程
y=3.2E+7X+50857
相关系数
0.9995
匹可硫酸钠数据及其图表
编号
1
2
3
4
5
6
浓度(mg/mL)
0.00019734
0.506
0.788
0.988
1.208
1.496
峰面积(mAU*s)
1929
6785778
10552133
12998944
15868216
19627611
回归方程
y=1.3E+7X+94929
相关系数
0.9999
3.6精密度
3.6.1目的
确定对于相同样品多次称样测定结果的重现程度。
3.6.2操作方法
(1)样品溶液:
称取6份匹可硫酸钠样品,每份50mg至50ml容量瓶中,用溶剂溶剂并稀释到刻度。
(2)每个样品进2针,用面积归一法计算个各杂质的含量。
3.6.3可接受标准
杂质含量的RSD%应小于5.0%。
3.6.4方法精密度测试数据
编号
样品浓度
(mg/mL)
杂质1(%)
4,4‘-(2-吡啶亚甲基)双酚(%)
杂质2(%)
杂质3(%)
总杂质(%)
1
1
0.13
0.10
0.12
0.15
0.5
2
1.015
0.12
0.11
0.12
0.15
0.5
3
1.085
0.13
0.10
0.12
0.15
0.5
4
0.98
0.13
0.11
0.11
0.15
0.5
5
1.02
0.14
0.11
0.11
0.14
0.5
6
1.01
0.13
0.11
0.11
0.14
0.5
平均值
——
0.13
0.106
0.115
0.147
——
RSD%
——
4.44
4.84
4.76
3.52
——
数据显示杂质含量的RSD%小于5.0%,结果合格。
4.讨论
4.1检测波长的确定
仪器:
岛津UV-1800紫外可见分光光度计
取匹可硫酸钠外购样品适量,加流动相制成300μg·mL-1溶液,于190-400nm扫描,相关数据可知,匹可硫酸钠在波长263nm处的吸收也较大,故我们选择同一波长263nm作为检测波长。
4.2色谱柱的选择
参考文献,并经多次试验发现,采用一般BostonC18柱可满足测定需要,供试品的主成分与杂质能有效分离,且峰形较好。
这里采用BostonC18柱(250mm×4.6mm,5μm)作为分析用色谱柱。
4.3流动相的选择
参考文献[2],试验了乙腈-磷酸缓冲盐系统以不同体积配比作为流动相,等度洗脱。
结果发现用乙腈-磷酸缓冲盐(22:
78)时,匹可硫酸钠保留时间很小;用乙腈-磷酸缓冲盐(20:
80)时,4,4‘-(2-吡啶亚甲基)双酚保留时间很晚,不便于监测反应液;乙腈-磷酸缓冲盐(20:
80)作为起始浓度,逐渐增加乙腈的浓度,最后调试出上述梯度洗脱方法使得匹可硫酸钠保留时间在9min左右,4,4‘-(2-吡啶亚甲基)双酚保留时间在27min左右,峰形对称,出峰稳定,重现性好。
故选择这种洗脱方法作为检测方法,用于匹可硫酸钠杂质的检测分析。
5.结论
本文摸索了匹可硫酸钠有关物质的测定方法,采用反相HPLC法,建立色谱条件。
进一步进行了方法学验证,同时也对色谱条件进行了优化,最终确立了HPLC法测定条件。
从验证的结果可知,建立的高效液相色谱法测定匹可硫酸钠有关物质高效、简便、快捷、准确、精密度高、专属性强,能很好的将杂质分离开并能准确的测定出来。
根据建立的方法对公司研发项目部自制的样品进行分析,结果证明可以较好的实现对产品的有关物质测定。
参考文献
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[7]朱翔.缓泻剂的使用与选择[J].中国临床医生.2006,34(7).51
[8]朱国锋.HPLC法测定匹可硫酸钠片中匹可硫酸钠的含量[J].中国医药导报. 2011, 08(9).29-30
[9]孙冰洋.Prepopik[J].中国药物化学杂志.2013
(1).76
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