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分子生物学复习提纲
三、DNA转录、逆转录及其转录后加工
1.掌握以大肠杆菌为代表的原核细胞RNA聚合酶全酶的结构以及各亚基在功能上的分工。
答案:
αsubunit由rpoA基因编码,是核心酶中的两个相同的亚单位,与核心酶的组装有关,参与RNA聚合酶和部分调节因子的相互作用
β&β’subunitβ和β’分别由rpoB和rpoC基因编码,由β和β’亚基组成了聚合酶的催化中心,它们在序列上与真核生物RNA聚合酶的两个大亚基有同源性,β亚基能与模板DNA、新生RNA链及核苷酸底物相结合
ω亚基是核心酶
σfactor与σ因子的结合使RNA聚合酶从核心酶转变为聚合酶全酶,负责模板链的选择和转录的起始,是启动子识别的关键的酶,不仅增加聚合酶对启动子的亲和力(提高103倍),还可降低它对非专一位点的亲和力(降低104倍),使酶底复合物的半衰期小于1s,在细胞中对σ因子量的需求少于聚合酶中其它亚单位。
2.掌握σ因子的结合如何影响原核细胞RNA聚合酶与启动子之间的亲和性。
σ因子是酶的别构效应物,使酶专一性识别模板上的启动子,极大提高RNA聚合酶对启动子DNA序列的亲和力,酶底结合常数可以提高10^3倍,酶底复合物的半衰期可达几小时甚至十几个小时,同时还可以使RNA聚合酶和DNA上非特异性结合位点降低10^4倍,使非特异性点的酶底复合物的半衰期小于1S。
3.了解强启动子和弱启动子之间的差别;能够预测启动子发生的突变对转录效率的影响。
启动子:
是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列,能够活化RNA聚合酶,使之与模板DNA准确结合并具有转录起始的特异性。
根据启动效率的不同,可将启动子分为强启动子和弱启动子,在原核生物中,-35区和-10区的之间的距离大约是16-19bp,小于15bp或者大于20bp都会降低启动子的活性。
可能碱基对的过多或者过少,酶与这个区域的DNA保持正确的取向需要增加结合自由能,从而降低基因的表达水平。
如果把Pribnow区从TATAAT变成AATAAT就会使该启动子发生下降突变(downmutation);
如果增加Pribnow区的共同序列,将乳糖操纵子的启动子中的TATGTT变成TATATT,就会提高启动子的效率,称为上升突变(upmutation)。
4了解终止子是如何终止转录的以及原核细胞依赖于ρ因子和不依赖于ρ因子的两种终止机制的差别。
根据RNA聚合酶是否需要辅助因子终止RNA链的延伸将终止子分为依赖ρ因子终止子和不依赖ρ因子终止子两种。
不依赖ρ因子的终止机制基因中含有内在终止子,由模板链转录出的mRNA可形成茎环结构,可阻止RNApol的前进。
依赖ρ因子终止的机制需要ρ因子作为辅助因子,催化NTP的水解促使新生RNA链从三元转录复合物中解离。
内在的差别:
不依赖ρ因子终止的模板DNA有存在终止转录的特殊信号—内在终止子,它转录出来的mRNA能够形成发夹结构,终止转录,而依赖ρ因子的终止需要ρ因子作为辅助因子,取代暂停在终止位点上得RNA聚合酶,利用自身的RNA-DNA解螺旋活性使转录产物RNA从模板DNA上释放,随后转录复合物解体,完成转录过程。
5.掌握原核转录系统和真核转录系统的主要差别;掌握转录因子在真核转录系统中的功能。
1RNA聚合酶不同:
原核细胞中,RNA聚合酶由5种subunits组成聚合酶全酶(holoenzyme),包括2α,1β,1β’,1ω以及1σsubunits。
在真核细胞中,有3类RNA聚合酶;结构比大肠杆菌RNA聚合酶复杂;在细胞核中的位置不同;负责转录的基因不同,对α-鹅膏蕈碱的敏感性也不同;聚合酶中有两个相对分子质量超过1×105的大亚基;同种生物3类聚合酶有“共享”小亚基的倾向,即有几个小亚基是其中3类或2类聚合酶所共有的;真核生物RNA聚合酶一般有8-16个亚基所组成,相对分子质量超过5×105。
2启动子不同:
原核生物启动子的共同的特点
结构典型,都含有识别(R),结合(B)和起始(I)三个位点;序列保守,如-35序列,-10序列结构都十分保守;位置和距离都比较恒定;直接和多聚酶相结合;常和操纵子相邻;都在其控制基因的5′端;决定转录的启动和方向。
真核生物的启动子特点
有多种元件:
TATA框,GC框,CATT框,OCT等;结构不恒定。
有的有多种框盒,如组蛋白H2B;有的只有TATA框和GC框,如SV40早期转录蛋白;它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同;有的有远距离的调控元件存在,如增强子;这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作用;不直接和RNApol结合。
转录时先和其它转录激活因子相结合,再和聚合酶结合。
3mRNA不同:
原核生物mRNA的特征:
1、半衰期短2、许多原核生物mRNA以多顺反子的形式存在。
3、原核生物mRNA的5’端无帽子结构,3’端没有或只有较短的多聚(A)结构。
4.原核生物常以AUG(有时GUG,甚至UUG)作为起始密码子;5mRNA的转录和翻译发生在同一个细胞空间,这两个过程几乎是同步进行的。
真核生物mRNA的特征:
1单顺反子形式存在。
2、5’端存在“帽子”结构,真核生物基因转录一般从嘌呤起始,其5’端大都经过修饰。
3、绝大多数具有多聚(A)尾巴4真核细胞mRNA的合成和功能表达发生在不同的空间和时间范畴内。
5mRNA以较大分子量的前体RNA出现在核内,只有成熟的、相对分子质量明显变小并经化学修饰的mRNA才能进入细胞质,参与蛋白质的合成。
4内含子:
真核基因大多是断裂的:
一个基因可由多个内含子(Introns)和外显子(Exons)间隔排列而成。
所以真核基因表达往往伴随着RNA的剪接过程。
原核细胞很少有这情形。
6.能够区分顺式作用元件和反式作用因子。
顺式作用元件是存在于基因旁侧序列中能够影响基因表达的序列,包括启动子,增强子,调控序列和可诱导元件等。
反式作用因子指能够直接或者间接识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质。
7.了解真核生物mRNA前体后加工的主要方式(加帽、加尾、剪接、内部甲基化和编辑)及其功能。
5’端存在“帽子”结构。
真核生物基因转录一般从嘌呤起始,其5’端大都经过修饰。
(但注意原核生物中没有5’帽子结
帽子结构的功能:
(1)有助于mRNA越过核膜,进入胞质;
(2)保护5′不被核酶降解;(3)翻译时供IFⅢ(起始因子)和核糖体识别,是翻译所必需的。
加尾:
真核生物mRNA的3’末端都有多聚(A)序列,其长度因mRNA种类不同而变化,一般为40-200个左右。
多聚(A)的功能是mRNA由细胞核进入细胞质所必需的形式;它大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性。
mRNA刚从细胞核进入细胞质时,其多聚(A)尾巴一般比较长,随着mRNA在细胞质内逗留时间延长,多聚(A)逐渐变短消失,mRNA进入降解过程。
它可促进核糖体的有效循环。
内部甲基化:
mRNA的帽子结构常常被甲基化,由于内部甲基化形成三类帽子。
功能和帽子一样。
编辑(editing)是指转录后的RNA在编码区发生碱基的加入,丢失或转换等现象。
校正作用;调控翻译;通过编辑可以构建或去除起始密码子和终止密码子;扩充遗传信息;除了RNA的编辑之外,有些RNA,特别是前体rRNA和tRNA,还可能有位点特异性的化学修饰。
8原核生物启动子和真核生物启动子的异同?
原核生物启动子的共同的特点结构典型,都含有识别(R),结合(B)和起始(I)三个位点序列保守,如-35序列,-10序列结构都十分保守;位置和距离都比较恒定;直接和多聚酶相结合;常和操纵子相邻;都在其控制基因的5′端;决定转录的启动和方向。
真核生物的启动子特点有多种元件:
TATA框,GC框,CATT框,OCT等;结构不恒定。
有的有多种框盒,如组蛋白H2B;有的只有TATA框和GC框,如SV40早期转录蛋白;它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同;有的有远距离的调控元件存在,如增强子;这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作用;不直接和RNApol结合。
转录时先和其它转录激活因子相结合,再和聚合酶结合。
9多顺反子(原核生物)
10基因的概念
基因的分子生物学定义是:
产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列!
四、翻译及其后加工
1.掌握原核生物和真核生物在核糖体组成和大小上的差别。
核糖体是由几十种蛋白质和多种核糖体RNA(ribosomalRNA,rRNA)所组成的亚细胞颗粒。
它像一个沿着mRNA模板移动的工厂,执行着蛋白质合成的功能。
核糖体是一个致密的核糖核蛋白颗粒,可解离为两个亚基,每个亚基都含有一个相对分子质量较大的rRNA和许多不同的蛋白质分子,原核生物核糖体由约2/3的RNA及1/3的蛋白质组成,真核生物核糖体中RNA占3/5,蛋白质占2/5。
原核生物如大肠杆菌的核糖体小亚基含有16s的rRNA,含有21种蛋白质,大亚基中含有23s和5s的rRNA,含有36种蛋白质,沉降系数在70s左右,真核生物中小亚基含有16-18s的rRNA,含有33种蛋白质,大亚基含有25s或者28s和5s的rRNA,和49种蛋白质,真核生物的沉降系数大约在80s左右。
2.掌握原核生物mRNA和真核生物mRNA在一级结构上的差别。
1、许多原核生物mRNA以多顺反子的形式存在2、原核生物mRNA的5’端无帽子结构,3’端没有或只有较短的多聚(A)结构。
3原核生物常以AUG(有时GUG,甚至UUG)作为起始密码子
1单顺反子形式存在。
2、5’端存在“帽子”结构mRNA的帽子结构常常被甲基化3、绝大多数具有多聚(A)尾巴
3.掌握原核生物和真核生物参与翻译的起始因子、延伸因子和终止释放因子的结构与功能。
起始因子:
细菌中3个翻译起始因子,IF-1,IF-2,IF-3
30S小亚基与翻译起始因子IF-1,IF-3结合,通过SD序列与mRNA模板相结合。
fMet-tRNAfMet在IF-2的协同下进入小亚基的P位,tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对。
真核生物起始因子
延伸因子
EFTu该氨酰-tRNA首先与EFTu·GTP形成复合物,进入核糖体的A位
EF-Ts在EF-Ts的作用下使复合物释放GDP并使EF-Tu结合另一分子GTP,进入新一轮循环
EF-G核糖体通过EF-G介导的GTP水解所提供的能量向mRNA模板3’末端移动一个密码子
终止释放因子
RF释放因子RF具有GTP酶活性,它催化GTP水解,使肽链与核糖体解离。
细菌细胞:
RF1(I类)能识别UAG和UAA,RF2(I类)识别UGA和UAA。
一旦RF与终止密码相结合,它们就能诱导肽基转移酶把一个水分子而不是氨基酸加到延伸中的肽链上。
RF3(II类)与核糖体的解体有关。
真核细胞:
eRF1(I类)能识别三个终止密码子,eRF3(II类)
4.了解原核生物通过SD序列识别起始密码子的机制。
SD序列是mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。
SD序列在细菌mRNA起始密码子AUG上游10个碱基左右处,有一段富含嘌呤的碱基序列,能与16srRNA3’端识别,帮助从起始AUG处开始翻译。
30S亚基具有专一性的识别和选择mRNA起始位点的性质,IF3协助该亚基完成这种选择。
1.30s小亚基与翻译起始因子 IF-1,IF-3结合,30s小亚基中16rRNA3'端能与mRNA中5'端起始密码子上游的SD序列互补结合,2fMet-tRNAfMet在IF-2的协同下进入小亚基的P位,tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对。
3.带有tRNA、mRNA、三个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合,释放翻译起始因子。
但在真核生物中,真核生物核糖体从mRNA的5’端(帽子)向包括AUG起始密码子的核糖体结合位点滑动,40s小亚基然后在起始密码子处停止,称为Kozak的“扫描模型”。
5.掌握真核生物和原核生物在翻译上的主要差别。
1原核生物的mRNA没有内含子和外显子之分,不需要经过剪接等步骤,真核生物mRNA有内含子和外显子之分,需要先通过剪接,编辑等操作成为成熟的mRNA
2原核生物翻译和转录可以同时进行,但真核生物转录和翻译不能在同一时间进行
3原核生物中和真核生物的核糖体在结构和组成上都有差异,原核生物核糖体由约2/3的RNA及1/3的蛋白质组成,真核生物核糖体中RNA占3/5,蛋白质占2/5。
4真核生物起始tRNA携带甲硫氨酸(Met),原核生物起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸(fMet),在翻译起始时,原核生物:
30S小亚基首先与mRNA模板相结合,再与fMet-tRNAfMet结合,最后与50S大亚基结合。
真核生物:
40S小亚基首先与Met-tRNAMet相结合,再与模板mRNA结合,最后与60S大亚基结合生成80S·mRNA·Met-tRNAMet起始复合物,以及翻译起始的机制不同原核生物主要是识别结合SD序列,真核是Kozak的“扫描模型”
6.了解“信号”学说的主要内容,能够使用“信号”学说解释蛋白质是如何进入各种细胞器的。
蛋白质定位信息存在于自身结构中,并通过与膜上特殊受体的相互作用得以表达,即蛋白质通过其信号序列与膜或其它任何结构结合---信号肽假说的基础。
蛋白质跨膜运转信号也是由mRNA编码的。
翻译-运转同步机制(即蛋白质进入内质网):
1首先合成信号肽2SRP与信号肽结合,翻译停止3SRP和SRP受体结合,核糖体和膜结合,翻译重新开始。
4信号肽进入膜结构5蛋白质过膜,信号肽被切附,翻译重新开始6蛋白质完全过膜,核糖体解离。
翻译后运转机制:
(即蛋白质进入叶绿体,线粒体,或者细胞核)
7
遗传密码:
mRNA上每3个核苷酸翻译成多肽链上的一个氨基酸,这3个核苷酸就称为一个密码子(三联子密码)。
8遗传密码的性质
1密码的连续性(commaless)2.密码的简并性(degeneracy)3.密码的普遍性(universality)与特殊性(specificity)4.密码子与反密码子的相互作用
第五章基因的表达调控
1能够正确区分正调控和负调控,阻遏蛋白和激活蛋白
原核生物的基因的调控主要发生在转录水平上,根据调控机制的不同可分为正转录调控和负转录调控。
正转录调控:
如果在没有调节蛋白存在的情况下,基因的表达是关闭的,在调节蛋白存在的情况下,基因的表达活性被开启,则此调控被称为正调控。
负转录调控:
如果在没有调节蛋白存在的情况下,基因的表达式开启的,在有调节蛋白存在的情况下,基因的表达活性被关闭,则此调控被称为负调控。
阻遏蛋白:
在负转录调控中,调节基因的产物是阻遏蛋白,起着阻止结构基因转录的作用。
激活蛋白:
在正转录调控中,调节基因的产物是激活蛋白,起着开启结构基因转录的作用。
2知道乳糖操纵子的结构,成分及其运行机制,和乳糖操纵子的操纵基因的结构及其启动子在空间上的关系。
结构:
结构基因,调控元件和调控基因
成分:
启动子、操纵基因、调节基因、阻遏蛋白、结构基因、诱导物体
乳糖操纵子的运行机制:
加入乳糖后,在单个透过酶分子的作用下,少量的乳糖进入细胞,又在单个β-半乳糖苷酶的分子的作用下转变为异构乳糖,某个异构乳糖与结合在操纵区域的阻遏蛋白相结合并使后者失去活性而离开操纵区,开始了lacmMRA的生物合成,这些mRNA分子编码大量的β-半乳糖苷酶和乳糖透过酶,结果导致乳糖大量涌入细胞,尽管多数的乳糖被降解为葡糖糖和半乳糖,但还有许多乳糖被转变为异构乳糖,然后与细胞内的阻遏物结合,阻遏物的失去活性使mRNA高速合成,进一步提高了β-半乳糖苷酶和乳糖透过酶的浓度。
空间关系:
乳糖操纵子空间上得结构依次是:
lacIpolaczlacYlacA
3.能够正确预测各种突变(操纵基因、启动子或阻遏蛋白的突变)对乳糖操纵子三个结构基因表达的影响;了解一个操纵子的激活、阻遏以及去阻遏这三种状态之间的关系。
操纵基因和阻遏蛋白的突变利于结构基因的高效表达,启动子的突变可能不利于RNA聚合酶结合到启动子上,从而不利于结构基因的表达。
操纵子的激活属于正调控机制,是lacmRNA合成所必须的,决定着能否形成开放的启动子-RNA聚合酶结构,而阻遏和去阻遏属于负转录调控机制,影响着RNA聚合酶能否在DNA链上移动,发生在操纵子激活之后。
去阻遏能使结构基因高效表达,阻遏不利于结构基因的表达。
4.能够区分大肠杆菌乳糖操纵子和色氨酸操纵子的结构与功能。
大肠杆菌乳糖操纵子(lactoseoperon)包括3个结构基因:
Z、Y和A,以及启动子P、控制子O和阻遏子lacI等。
转录的调控是在启动区和操纵区进行的。
3个结构基因各决定一种酶:
Z编码-半乳糖苷酶:
β-半乳糖苷酶是一种β-半乳糖苷键的专一性酶,除能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外,还能水解其他β-半乳糖苷(如苯基半乳糖苷)。
Y编码-半乳糖苷透过酶:
β-半乳糖苷透过酶的作用是使外界的β-半乳糖苷透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。
A编码-半乳糖苷乙酰基转移酶:
β-半乳糖苷乙酰基转移酶的作用是把乙酰辅酶A上的乙酰基转移到-半乳糖苷上,形成乙酰半乳糖。
5.掌握大肠杆菌乳糖操纵子为什么还需要正调控以及正调控的机制;掌握cAMP-CAP激活操纵子的机制。
cAMP-CRP复合物与启动子区的结合是lacmRNA合成起始所必需的,因为这个复合物结合于启动子上游,能使DNA双螺旋发生弯曲,有利于形成稳定的开放型启动子-RNA聚合酶结构。
阻遏物则是一个抗解链蛋白,阻止形成开放结构,从而抑制RNA聚合酶的功能。
机制;
在不含有糖酵解途径的碳源中,AIP在腺苷酸环化酶的作用下转化为cAMP,与Crp基因编码的cAMP形成复合物,然后结合在启动子区域上,使转录开始。
细菌对此复合物的需要是独立的,与阻遏体系无关,所以cAMP-CAP是一个不同于阻遏物的正调控因子,
6.了解弱化子模型的调控机制。
在trpmRNA5’端有一个长162bp的mRNA片段被称为前导区,其中123~150位碱基序列如果缺失,trp基因表达可提高6-10倍。
mRNA合成起始以后,除非培养基中完全没有色氨酸,转录总是在这个区域终止,产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子,终止trp基因转录。
这个区域被称为弱化子
细菌通过弱化作用弥补阻遏作用的不足,因为阻遏作用只能使转录不起始,对于已经起始的转录,只能通过弱化作用使之中途停下来。
阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少;弱化作用的信号则是细胞内载有色氨酸的tRNA的多少。
它通过前导肽的翻译来控制转录的进行,在细菌细胞内这两种作用相辅相成,体现着生物体内周密的调控作用。
7.了解转录因子上与DNA结合的结构域(锌指结构、螺旋-转角-螺旋、螺旋-环-螺旋、碱性拉链)和调节基因表达结构域上的各种模体结构。
第六章基因工程及现在生物技术
1.掌握第二类限制性酶、DNA连接酶和DNA聚合酶等工具酶的性质和在重组DNA技术中的应用。
限制性酶:
能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。
DNA连接酶:
通过磷酸二酯键将两个或者多个DNA片段连接成一个DNA分子。
DNA聚合酶:
按5‘到3’方向加入新的核苷酸,补平DNA双链中的缺口。
2.掌握质粒的结构及其应用。
质粒:
存在于细菌细胞质中,具有自我复制能力,环形闭合的双股DNA分子。
最简单的质粒载体必须包括三部分:
一个复制子,一个选择性标记,一个克隆位点
质粒按复制形式可分为严紧型和松弛型复制按基因转移性可分为传递性质粒和非传递性质粒等
在基因工程中常被用作基因的载体。
3.掌握筛选阳性克隆的主要方法,能区分正选择和负选择。
含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子,如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组子
蓝白斑筛选核酸筛选法PCR筛选法免疫筛选法
在基因打靶载体中克隆上两个选择标记基因。
其中neo基因叫做正选择标记基因,它编码的新霉素磷酸转移酸可抑制抗菌素G418的活性。
因此,获得了neo基因的转化细胞,能够在含有G418抗菌素的选择培养基中生长、存活。
HSV-tk基因叫做负选择标记基因,它编码的单纯疟疾病毒胸苷激酶,可以把核苷类似物,转变成为毒性的核苷酸,造成细胞中毒死亡。
因此,选择培养基中的GCV能够持异性地杀死表达HSV-tk基因的转化细胞。
4.了解文库构建和筛选的方法,区分cDNA文库和基因组文库。
把某种生物的基因组DNA切成适当大小,分别与载体组合,导入微生物细胞,形成克隆。
汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆(理论上每个序列至少有一个代表),这样的克隆片段的总汇,称为基因组DNA文库。
cDNA文库:
以mRNA为模板,经反转录酶催化下,在体外反转录成cDNA,与适当大载体(常用噬菌体和质粒载体)连接后转化受体菌,则每个细菌里含有一段cDNA,并能繁殖扩增,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆组织集合称为cDNA文库。
基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。
筛选的方法有很多种,如核酸杂交法,PCR筛选法和免疫筛选法等。
5.了解PCR方法的原理、基本操作步骤和在基因克隆中的应用。
首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子,DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸和实验中提供的引物序列合成新生的DNA互补链。
DNA解链(变性)
引物与模板DNA相结合(退火)
DNA合成(链的延伸)三步。
经不断重复循环之后,反应混合物中所含有的双链DNA分子数,即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数,理论上的最高值应是2n,实得1.8n。
基本操作步骤
将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温(>94℃)环境下加热1分钟,使双链DNA变性,形成单链模板DNA。
降低反应温度(退火,约50℃),约1分钟,使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。
将反应混合物的温度上升到72℃左右保温1-数分钟,在DNA聚合酶的作用下,从引物的3'-端加入脱氧核苷三磷酸,并沿着模板分子按5'→3'方向延伸,合成新生DNA互补链。
6.了解基因敲除的基本原理。
基因敲除(geneknock-out)又称基因打靶,通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组,进行精确的定点修饰和基因改造,具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。
基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除(又称不完全基因敲除)两种。
7.了解几种定点突变技术的基本原理和应用。
通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列,用于研究某个(些)氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响,也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。
目前,主要采用两种PCR方法,重叠延伸技术(左图)和大引物诱变法(右图),在基因序列中进行定点突变。
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