引物设计软件oligo应用图解.docx
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引物设计软件oligo应用图解
引物设计软件oligo应用图解
在专门的引物设计软件中,“Oligo”是最著名的。
它的使用并不十分复杂,但初学者容易被其复杂的图表吓倒。
Oligo5.0的初始界面是两个图:
Tm图和ΔG图;Oligo6.0的界面更复杂,出现三个图,加了个Frq图。
“Oligo”的功能比“Premier”还要单一,就是引物设计。
但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。
oligo的下载和安装我就不多说了,打开oligo相信也无需多讲。
打开oligo的页面如下:
单击file菜单再点open或点击“打开”快捷图标或者用快捷键“CTrl+O”可打开下面的窗口:
在打开的OPEN窗口内选择FreqSeq再点“打开”:
选择drosfr或者其它一个文件点击“打开”:
出现以下窗口,点击“window”再点击“Tile”:
出现以下窗口,图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq,其中Frq是6.0版本的新功能,为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。
该频率高则可增加错误引发的可能性。
因为分析要涉及多个指标,起动窗口的cascade排列方式不太方便,可从windows菜单改为tile方式。
如果觉得太拥挤,可去掉一个指标,如Frq,这样界面的结构同于Oligo5.0,只是显示更清楚了:
∆G值反映了序列与模板的结合强度,最好引物的∆G值在5'端和中间值比较高,而在3'端相对低(如图)。
Tm值曲线以选取72℃附近为佳,5'到3'的下降形状也有利于引物引发聚合反应。
Frq曲线为“Oligo6”新引进的一个指标,揭示了序列片段存在的重复机率大小。
选取引物时,宜选用3'端Frq值相对较低的片段:
再点击Search再点“Fo'rPrimersandprobes”或使用快捷键F3:
出现以下窗口,点“OK”就OK了。
当然你也可以点击“Prameters”和“SearchRange”选择你要的参数和你上下游引物的位置及你扩增产物的长度:
出现SearchStatus窗口,点“OK”:
出现Primerpairs窗口,#代表引物对的编号,依次为引物对所处的位置、产物的长度、最适合的退火温度、和GC的百分含量:
点击任一行出现“PCR”窗口,告知你扩增片断的位置,最合适的退火温度等等信息:
关掉“PCR窗口”和“primerPairs窗口”回到原来的窗口你就能看到你引物的序列和位置,图中手型鼠标所指即为引物序列:
至此引物设计已经完成,你可以用“Analyse”菜单分析你的引物:
有无引物二聚体、发卡结构等等:
当上下游引物全选好以后,需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。
首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。
需要注意的是,引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成,也有可能是在上下游引物之间形成(crossdimer)。
二聚体形成的能值越高,越不符合要求。
一般的检测(非克隆)性PCR,对引物位置、产物大小要求较低,因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。
第二项检查是发夹结构(hairpin);与二聚体相同,发夹结构的能值越低越好。
一般来说,这两项结构的能值以不超过4.5为好。
当然,在设计克隆目的的PCR引物时,引物两端一般都添加酶切位点,必然存在发夹结构,而且能值不会太低。
这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果,对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。
第三项检查为GC含量,以45-55%为宜。
有一些模板本身的GC含量偏低或偏高,导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内,这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近,以有利于退火温度的选择。
好了,oligo使用的简单介绍到此结束。
在引物设计完之后可以使用软件自带的分析功能,操作如下:
点击“File”菜单中的“NewSequence”命令;
在窗口中输入上游引物;
如果该引物的首位置不是1的话,可以在“Edit”窗口中输入新的5’端位置数字,如20;
点击Accept/Discard菜单的Accept命令;
如果引物序列长度不同于当前的引物的话,可以从“Change”菜单中改变当前的引物长度;
选取当前序列为上游引物(点击“upper”按钮);
从Edit菜单中选取“LowerPrimer”命令,在EditLower窗口中输入下游引物的序列;
在Edit窗口的上角处,输入相应的5’位置;
选取“AcceptandQuit”命令;如果想让程序给出最佳退火温度,在此时的对话框中输入PCR产物的长度以及GC含量所占百分比,一般哺乳动物的cDNA序列中GC大约占44%。
点击OK就可以在“Analyze”菜单中完成各种分析了。
关于引物的评价有几点:
duplexformation:
这是评价引物二聚体形成的,包括自身形成二聚体和引物间二聚体,主要是看引物3‘端有无配对碱基(最好没有)。
其中的currentoligo是当你对引物进行了编辑(如加入酶切位点)时,对原始引物进行的分析。
(下同)形成的二聚体要看能值G(得它不会输入啊!
),能值越低越好,最好不要超过4.5(下同)。
hairpinformation:
这是看引物自身能否形成发夹结构,主要也是看3’端不要形成发夹结构。
还要看形成发夹结构的能值,不超过4.5。
如果引物中加入酶切位点,可能会有发夹结构且能值不会太低,这就需要灵活控制退火温度了。
compositionandTm:
分析上下游引物的碱基组成,GC比和Tm值,原则我就不多说了。
falseprimingsite:
如果模板不是基因组DNA,而是一个特定模板序列,需要进行错配的分析,看你的引物(尤其3‘端)是否与特定模板的其他位点结合。
一般错配的引发效率以不超过100为好,但并不绝对,如果正确结合位点的引发效率为450以上,而有一个错配的引发效率是120左右的,这个引物也是可以接受的!
PCR:
总结性的显示引物位置,产物大小,Tm值等参数,你可以横向比较一下,尤其是给了一个optimalannealingtem还是可以参照一下地。
也给了简单的评价供参考。
引物主要的评价功能也就这些了,应付一些基本的引物分析足够了。
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