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惠州学院分子生物学剖析
惠州学院分子生物学复习资料。
一、名词解释。
1、染色体:
遗传信息的载体,由DNA、RNA和蛋白质构成的,其形态和数目具有种系的特性。
在细胞间期核中,以染色质丝形式存在。
在细胞分裂时,染色质丝经过螺旋化、折叠、包装成为染色体,为显微镜下可见的具不同形状的小体。
2、染色质:
是指细胞周期间期细胞核内由DNA、组蛋白、非组蛋白和少量RNA组成的复合结构,因其易被碱性染料染色而得名。
3、核小体:
染色质的基本结构亚基,由约200bp的DNA和组蛋白八聚体所组成
4、C值谬误:
生物基因组的大小同生物在进化上所处地位的高低没有绝对的相关性,这种现象称为C值矛盾(C—Valueparadox)。
5、半保留复制:
由亲代DNA生成子代DNA时,每个新形成的子代DNA中,一条链来自亲代DNA,而另一条链则是新合成的,这种复制方式称半保留复制
6、半不连续复制:
DNA复制时其中一条子链的合成是连续的,而另一条子链的合成是不连续的,故称半不连续复制。
7、引发酶:
一种依赖于DNA的RNA聚合酶,其功能是在DNA复制过程中先合成一段RNA引物,在这引物上延伸新合成的DNA片段。
8、转座子:
转座元件中的一种,具有完整转座元件的功能特征并能携带内外源基因组片段(单基因或多基因)。
在基因组内移动或在生命体之间传播并可表达出新的表型。
9、多顺反子:
受同一个控制区调控的一组基因。
它们前后排列,并一起被转录和翻译而得到一组功能相关的蛋白质或酶。
多见于原核生物。
10、启动子:
DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域,在许多情况下,还包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点。
11、增强子:
增强基因启动子工作效率的顺式作用序列,能够在相对于启动子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都发挥作用。
12、全酶:
含有表达全部酶活性和调节活性所需的所有亚基的一种全寡聚酶。
13、核心酶:
仅含有表达其基础酶活力所必需亚基的酶蛋白复合物。
如大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ全酶由10个亚基组成,而其核心酶仅由α、ε、θ三个亚基组成。
14、三元复合物:
开放复合物与最初的两个NTP相结合,并在这两个核苷酸之间形成磷酸二酯键后,转变成包括RNA聚合酶,DNA和新生的RNA的三元复合物。
15、SD序列:
mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。
16、同工tRNA:
能接受和携带相同氨基酸、但分子结构上有差异的转移核糖核酸(tRNA)。
对应一种氨基酸的同工tRNA数目不等,有的可多至5~6种。
17、分子伴侣:
一组从细菌到人广泛存在的蛋白质,非共价地与新生肽链和解折叠的蛋白质肽链结合,并帮助它们折叠和转运,通常不参与靶蛋白的生理功能。
主要有三大类:
伴侣蛋白、热激蛋白70家族和热激蛋白90家族。
18、信号肽:
常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移的N-末端氨基酸序列。
19、核定位序列:
蛋白质的一个结构域,通常为一短的氨基酸序列,它能与入核载体相互作用,使蛋白能被运进细胞核。
20、操纵子:
转录的功能单位。
很多功能上相关的基因前后相连成串,由一个共同的控制区进行转录的控制,包括结构基因以及调节基因的整个DNA序列。
主要见于原核生物的转录调控,如乳糖操纵子、阿拉伯糖操纵子、组氨酸操纵子、色氨酸操纵子等。
21、弱化子:
位于基因内部的不依赖于ρ的转录终止子,可以使转录提前终止而发挥抑制基因表达作用。
22、葡萄糖效应:
又称葡萄糖阻遏或分解代谢产生阻遏作用。
葡萄糖或某些容易利用的碳源,其分解代谢产物阻遏某些诱导酶体系编码的基因转录的现象。
23、安慰性诱导物:
能高效诱导酶的合成,但又不被所诱导的酶分解的分子,称为安慰性诱导物(gratuitousinducer)。
24、顺势作用元件:
位于受调控的DNA编码区段的上、下游,可影响自身基因表达活性的DNA序列。
与基因表达调控有关的顺式作用元件主要有启动子、增强子和沉默子。
25、反式作用因子:
通过直接结合或间接作用于DNA、RNA等核酸分子,对基因表达发挥不同调节作用(激活或抑制)的各类蛋白质因子。
26、基因家族:
基因组中存在的许多来源于同一个祖先,结构和功能相似的一组基因。
同一家族的这些基因的外显子具有相关性,可在基因组内集中或分散分布。
27、断裂基因:
真核生物结构基因,由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成,去除非编码区再连接后,可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质,这些基因称为断裂基因(splitegene)。
二、证明DNA是遗传物质的两个关键性实验是什么?
答:
Avery肺炎链球菌转化实验
Hershey和Chase的噬菌体DNA侵染细菌实验
三、什么是DNA重组技术?
答:
用人工手段对DNA进行改造和重新组合的技术。
包括对DNA分子的精细切割、部分序列的去除、新序列的加入和连接、DNA分子扩增、转入细胞的复制繁殖、筛选、克隆、鉴定和序列测定等等,是基因工程技术的核心。
这种操作可把特定的基因组合到载体上,并使之在受体细胞中增殖和表达。
因此它不受亲缘关系限制,为遗传育种和分子遗传学研究开辟了崭新的途径。
四、比较原核生物和真核生物基因组DNA的特点。
答:
1、原核生物基因组结构特点
(1)基因组小
(2)结构简练
(3)存在含多顺反子的转录单元
(4)有重叠基因(Sanger发现)
2、真核生物基因组结构特点
(1)含有大量重复序列
(2)功能DNA序列大多被非功能DNA所隔开(外显子和内含子)。
(3)存在C值矛盾
五、原核、真核生物DNA聚合酶的特性。
答:
1、原核生物中的DNA聚合酶(大肠杆菌)
性质
聚合酶Ⅰ
聚合酶Ⅱ
聚合酶Ⅲ
3'5'外切活性
+
+
+
5'3'外切活性
+
-
-
5'3'聚合活性
+中
+很低
+很高
新生链合成
-
-
+
作用
主要是对DNA损伤的修复;以及在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙。
修复紫外光引起的DNA损伤
DNA复制的主要聚合酶,还具有3’-5’外切酶的校对功能,提高DNA复制的保真性
2、真核生物中DNA聚合酶的特性:
α
β
γ
δ
ε
3’-5’外切酶活性
无
无
有
有
有
定位
细胞核
细胞核
线粒体
细胞核
细胞核
功能
引物合成
修复作用
线粒体DNA的复制
核DNA的复制
RNA引物的去除和缺口的补充
六、细胞通过哪几种修复系统对DNA损伤进行修复?
简述DNA错配修复的过程。
答:
DNA修复系统
功能
错配修复
恢复错配
切除修复(碱基、核甘酸)
切除突变的碱基和核甘酸片断
重组修复
复制后的修复,重新启动停滞的复制叉
DNA直接修复
SOS系统
修复嘧啶二体或甲基化DNA
DNA的修复,导致变异
过程:
1、Dam甲基化酶使母链位于5’GATC序列中腺甘酸A甲基化
2、甲基化紧随在DNA复制之后进行
3、根据复制叉上DNA甲基化程度,切除尚未甲基化的子链上的错配碱基
七、比较原核生物和真核生物mRNA的特点。
答:
原核生物mRNA的特征:
1、半衰期短
2、多以多顺反子的形式存在
3、5’端无“帽子”结构,3’端没有或只有较短的poly(A)结构。
4、原核生物常以AUG(有时GUG,甚至UUG)作为起始密码子,而真核生物几乎永远以AUG作为起始密码子。
真核生物mRNA的特征
1、5’端存在“帽子”结构
2、多数mRNA3’端具有poly(A)尾巴(组蛋白除外)
3、以单顺反子的形式存在
八、真核生物的原始转录产物需要经过哪些加工才能成为成熟的mRNA?
答:
5’端加帽+3’端加尾+RNA的剪接+RNA的编辑+再编码+化学修饰
九、原核启动子和真核启动子的构成
答:
原核生物启动子结构:
1、TATA区(-10区):
酶的紧密结合位点
2、TTGACA区(-35区):
提供了RNA聚合酶全酶识别的信号
真核生物启动子结构:
1、启动子Ⅱ最为复杂,它和原核的启动子有很多不同
2、核心启动子(corepromoter)选择正确的转录起始位点,保证精确起始
3、上游启动子元件(upstreampromoterelement,UPE)控制转录起始频率。
十、遗传密码有哪些特性?
理解掌握其摆动性
答:
1、连续性、简并性、通用性与特殊性、摆动性
2、摆动性:
转运氨基酸的tRNA上的反密码子需要通过碱基互补与mRNA上的遗传密码子反向配对结合,在密码子与反密码子的配对中,前两对严格遵守碱基配对原则,第三对碱基有一定的自由度,可以“摆动”,这种现象称为密码子的摆动性。
十一、tRNA中起作用的重要两个臂是什么臂?
答:
1、3’端CCA:
接受氨基酸,形成氨酰-tRNA。
2、与mRNA结合部位—反密码子部位
十二、肽链延伸由许多循环组成,每加一个氨基酸就是一个循环,每个循环包括哪些步骤
答:
包括:
(1)AA-tRNA与核糖体A位点的结合:
需要消耗GTP,并需EF-Tu、EF-Ts两种延伸因子
(2)肽键形成:
是由转肽酶/肽基转移酶催化
(3)移位:
核糖体向mRNA3’端方向移动一个密码子.需要消耗GTP,并需EF-G延伸因子
十三、真核生物和原核生物在翻译的起始过程有哪些区别?
答:
原核生物中30S小亚基首先与mRNA模板相结合,再与fMet-tRNAfMet结合,最后与50S大亚基结合。
而在真核生物中,40S小亚基首先与Met-tRNAMet相结合,再与模板mRNA结合,最后与60S大亚基结合生成80S·mRNA·Met-tRNAMet起始复合物
十四、比较PCR扩增和细胞内DNA复制的异同。
答:
PCR技术
DNA生物复制
环境
体外复制,加热,90摄氏度左右
体内,温和的环境
模板
DNA单链
DNA单链
原料
4种脱氧核糖核苷酸
4种脱氧核糖核苷酸
酶
主要是DNA聚合酶
DNA解旋酶,DNA聚合,DNA连接酶等各种酶
引物
需要人工合成的引物
自己合成引物成分
步骤
变性--退火--延伸
解旋-起始-延伸-结束
原则
碱基互补配对原则
碱基互补配对原则
十五、设计一个典型的PCR扩增程序和PCR反应体系。
答:
PCR技术的原理:
首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子,DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。
PCR反应的模板DNA若是基因组上的某个片段,就称为genomicPCR,若是mRNA反转录产生的cDNA,就称为RT-PCR。
过程:
(1)DNA解链(变性)
(2)引物与模板DNA相结合(退火)
(3)DNA合成(链的延伸)三步。
经不断重复循环之后,反应混合物中所含有的双链DNA分子数,即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数,理论上的最高值应是2n,实得1.8n
PCR扩增程序:
(1)将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温(>94℃)环境下加热1分钟,使双链DNA变性,形成单链模板DNA。
(2)降低反应温度(退火,约50℃),约1分钟,使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。
(3)将反应混合物的温度上升到72℃左右保温1--数分钟,在DNA聚合酶的作用下,从引物的3'-端加入脱氧核苷三磷酸,并沿着模板分子按5'→3'方向延伸,合成新生DNA互补链。
PCR反应体系:
10×扩增缓冲液10μl
4种dNTP混合物各200μmol/L
引物10~100pmol
模板DNA0.1~2μg
TaqDNA聚合酶2.5u
(Mg2+)1.5mmol/L
加双或三蒸水至100ul
十六、在基因操作实践中检测核酸相对分子量的最常用方法是什么?
其原理是什么?
答:
最常用的方法:
核酸凝胶电泳,如琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳
核酸凝胶电泳的基本原理:
1、核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团,呈负离子化状态;核酸分子在一定的电场强度的电场中,它们会向正电极方向迁移;
2、由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质,电泳迁移率(或迁移速度)与分子的摩擦系数成反比。
而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数;
因此,可在同一凝胶中、一定电肠强度下、在凝胶上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分子。
十七、如何克隆一个新基因(cDNA的中间片段)?
答:
cDNA的合成包括第一链和第二链的合成
v第一链的合成是以mRNA为模板,反转录成cDNA,由反转录酶催化,该酶合成是需要引物引导,常用的引物是OligodT。
OligodT引物一般包含12—20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸,后面加一个连接引物以便于克隆构建。
v第二链的合成是以第一链为模板,由DNA聚合酶催化。
常用RNaseH切割mRNA–CDNA杂合链中的mRNA序列所产生的小片段为引物合成第二条cDNA的片段,再通过DNA连接酶的作用连成完整的DNA链。
十八、SNP技术
答:
SNP(singlenucleotidepolymorphism)单核苷酸多态性,指基因组DNA序列由于单个核苷酸(A,T,C和G)的突变而引起的多态性。
一个SNP表示在基因组某个位点上一个核苷酸的变化,这种变化可能是转换,也可能是颠换。
SNP技术即SNP检测技术,因为只有进行了DNA序列分析才能确认所发现的SNP,所以目前国际上最常见的仍然是通过DNA测序法获得新的SNP。
基因分型是其中最常的,它是指利用数据库中已有的SNP进行特定人群的序列和发生频率的研究,主要包括基因芯片技术、Taqman技术、分子信标技术和焦磷酸测序法等。
基因敲除技术的基本原理。
十九、基因敲除技术的基本原理:
答:
1、基因敲除(geneknock-out)又称基因打靶,通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组,进行精确的定点修饰和基因改造,具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点
2、基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除(又称不完全基因敲除)两种。
完全基因敲除:
是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性
条件型基因敲除:
是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除
二十、RNAi技术的基本原理。
RNAi技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达,使细胞出现靶基因缺失的表型
二十一、乳糖操纵子的调控模型。
答:
①Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码
②这个mRNA分子的启动子紧接着O区,而位于I与O之间的启动子区(P),不能单独起动合成β-半乳糖苷酶和透过酶的生理过程。
③操纵基因是DNA上的一小段序列(仅为26bp),是阻遏物的结合位点。
④当阻遏物与操纵基因结合时,lacmRNA的转录起始受到抑制。
⑤诱导物通过与阻遏物结合,改变它的三维构象,使之不能与操纵基因结合,从而激发lacmRNA的合成。
当有诱导物存在时,操纵基因区没有被阻遏物占据,所以启动子能够顺利起始mRNA的合成
二十二、色氨酸操纵子的负控阻遏系统和弱化调控机制。
答:
色氨酸操纵子(负控阻遏系统):
效应物分子——色氨酸
①高色氨酸时:
色氨酸结合辅阻遏蛋白,并使之结合操纵区O,仅合成一段前导RNA
②低色氨酸时:
辅阻遏蛋白不具备活性,trp操纵子去阻遏,合成完整的一段mRNA。
弱化作用:
(弱化子trpa)细微调控转录过程,独立于trp操纵子
①低浓度色氨酸,tRNA^(Trp)的浓度就低,通过相邻Trp密码子的速度慢,4区转录完成时,核糖体(翻译)进行至1区,前导区结构为2-3配对形式,转录可继续进行。
②高浓度色氨酸,tRNA^(Trp)的浓度就高,通过相邻Trp密码子的速度快,4区转录之前,核糖体已到达2区,只能形成3-4茎-环状终止子结构,转录停止,结构基因关闭,不再合成色氨酸。
二十三、为什么半乳糖操纵子需要双启动子?
答:
这与半乳糖在细胞代谢中的双重功能有关。
半乳糖不仅可以作为唯一糖源供细胞生长,而且与之相关的物质----尿苷二磷酸半乳糖是大肠杆菌细胞壁合成的前体。
设想只有S1一个启动子,那么由于这个启动子的活性依赖于cAMP-CRP,当培养基中有葡萄糖存在时就不能合成异构酶,假如唯一的启动子是S2,那么即使在有葡萄糖存在的情况下,半乳糖也将使操纵子处于充分诱导状态,这无疑是一种浪费。
所以无论从必要性还是从经济性考虑,都需要一个不依赖于cAMP-CRP的启动子(S2)进行本底水平的永久型合成,以及一个依赖于cAMP-CRP的启动子(S1)对高水平合成进行调节。
二十四、习题:
1、关于管家基因叙述错误的是D
(A)在生物个体的几乎各生长阶段持续表达
(B)在生物个体的几乎所有细胞中持续表达
(C)在生物个体全生命过程的几乎所有细胞中表达
(D)在生物个体的某一生长阶段持续表达
(E)在一个物种的几乎所有个体中持续表达
2、一个操纵子(元)通常含有B
(A)数个启动序列和一个编码基因(B)一个启动序列和数个编码基因
(C)一个启动序列和一个编码基因(D)两个启动序列和数个编码基因
(E)数个启动序列和数个编码基因
3、下列情况不属于基因表达阶段特异性的是,一个基因在A
(A)分化的骨骼肌细胞表达,在未分化的心肌细胞不表达
(B)胚胎发育过程不表达,出生后表达
(C)胚胎发育过程表达,在出生后不表达
(D)分化的骨骼肌细胞表达,在未分化的骨骼肌细胞不表达
(E)分化的骨骼肌细胞不表达,在未分化的骨骼肌细胞表达
4、乳糖操纵子(元)的直接诱导剂是E
(A)葡萄糖(B)乳糖(C)β一半乳糖苷酶(D)透酶(E)异构乳糖
5、Lac阻遏蛋白结合乳糖操纵子(元)的B
(A)CAP结合位点(B)O序列(C)P序列(D)Z基因(E)I基因
6、cAMP与CAP结合、CAP介导正性调节发生在C
(A)葡萄糖及cAMP浓度极高时(B)没有葡萄糖及cAMP较低时
(C)没有葡萄糖及cAMP较高时(D)有葡萄糖及cAMP较低时
(E)有葡萄糖及CAMP较高时
7、Lac阻遏蛋白由D
(A)Z基因编码(B)Y基因编码(C)A基因编码(D)I基因编码(E)以上都不是
8、色氨酸操纵子(元)调节过程涉及E
(A)转录水平调节(B)转录延长调节(C)转录激活调节(D)翻译水平调节
(E)转录/翻译调节
9、与O序列结合 A 10、与P序列结合 B 11、与CAP结合 C
12、与CAP位点结合 D
(A)Lac阻遏蛋白(B)RNA聚合酶(C)环一磷酸腺苷(D)CAP-cAMP(E)异构乳糖
13、乳糖、阿拉伯糖、色氨酸等小分子物质在基因表达调控中作用的共同特点是D
A与启动子结合B与DNA结合影响模板活性
C与RNA聚合酶结合影响其活性D与蛋白质结合影响该蛋白质结合DNA
E与操纵基因结合
14、DNA损伤修复的SOS系统B
A是一种保真性很高的复制过程 BLexA蛋白是一系列操纵子的阻遏物
CRecA蛋白是一系列操纵子的阻遏物D它只能修复嘧啶二聚体
15、以下关于cAMP对原核基因转录的调控作用的叙述错误的是D
AcAMP可与分解代谢基因活化蛋白(CAP)结合成复合物
BcAMP-CAP复合物结合在启动子前方
C葡萄糖充足时,cAMP水平不高
D葡萄糖和乳糖并存时,细菌优先利用乳糖
E葡萄糖和乳糖并存时,细菌优先利用葡萄糖
21、Lac阻遏蛋白由____I____基因编码,结合___O_____序列对Lac操纵子(元)起阻遏作用。
22、Trp操纵子的精细调节包括__阻遏机制_____及_弱化机制________两种机制。
第八章
1、名词解释
顺式作用元件:
影响自身基因表达活性的非编码DNA序列。
如启动子、增强子、沉默子等
反式作用因子:
直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上,参与调控靶基因转录效率的蛋白质。
基因家簇:
真核细胞中许多相关的基因常按功能成套组合,被称为基因家族
断裂基因:
真核基因都是由蛋白质编码序列和非蛋白质编码序列组成的,编码序列称为外显子,非编码序列称为内含子。
在一个结构基因中,编码某一蛋白质不同区域的各个外显子常常被长度不等的内含子所隔离,形成镶嵌排列的断裂方式,所以真核基因有时被称为断裂基因
2、图示简要说明真核生物启动子的结构。
3、说明DNA甲基化对基因转录活性的影响机理。
为什么说甲基化密度与启动子强度之间的平衡决定了该启动子是否具有转录活性(可用图示说明)?
DNA甲基化抑制基因转录的机制:
DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化,从而影响了蛋白质与DNA的相互作用,抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率。
甲基的引入不利于模板与RNA聚合酶的结合,降低了转录活性
甲基化密度与启动子强度之间的平衡决定了该启动子是否具有转录活性。
P294
4、举例说明蛋白质磷酸化如何影响基因表达。
以cAMP介导的蛋白质磷酸化为例说明
许多转录因子都可以通过cAMP介导的蛋白质磷酸化过程而被激活
这类基因5’区有一个或数个cAMP应答元件,基本序列为TGACGTCA
膜上受体与配体结合引起受体构象变化,并与G结合,激活与膜相关的腺苷酸环化酶,导致胞内cAMP水平上升,活化A激酶,释放催化亚基入核内,实施底物磷酸化。
被磷酸化的底物可作为转录激活因子诱发基因转录。
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