双脱甲氧基姜黄素PLGA微球药代动力学研究.docx

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双脱甲氧基姜黄素PLGA微球药代动力学研究

目录

中文摘要1

Abstract2

前言3

1实验材料4

1.1仪器4

1.2动物4

1.3药物与试剂4

2实验方法与结果4

2.1色谱条件4

2.2标准溶液的配制4

2.3生物样品的处理4

2.4专属性考察5

2.5标准曲线的制备及定量下限9

2.6精密度与准确度实验9

2.7回收率实验10

2.8稳定性试验11

2.9BDMC与BDMC-PLGA-MS大鼠体内单剂量给药后药代动力学研究13

2.10BDMC-PLGA-MS大鼠体内单剂量给药后药代动力学研究16

2.11药代动力学参数18

2.12BDMC-PLGA-MS在大鼠体内靶向性初步考察18

3讨论21

4结论22

参考文献23

致谢24

综述25

中文摘要

目的：

研究双脱甲氧基姜黄素聚乳酸-羟基乙酸微球（BDMC-PLGA-MS）在大鼠体内经时过程以及组织分布趋向。

方法：

本研究采用高效液相色谱法，研究注射后的体内药物动力学过程，并研究了该制剂在大鼠体内的组织分布，对其肺靶向性进行了评价。

结果：

静脉注射（i.v.）给药后，BDMC在大鼠体内迅速代谢，在2h后已经几乎检测不出，而BDMC-PLGA-MS持续释放78h，具有较好的缓释效果。

BDMC-PLGA-MS在大鼠体内的组织分布实验结果显示BDMC-PLGA-MS在给药后24h、48h、72h均在肺组织中浓度最高，表明BDMC-PLGA-MS混悬剂趋于聚集在肺组织。

结论：

BDMC-PLGA-MS具有缓释效果和肺靶向性。

关键词：

姜黄素；双脱甲氧基姜黄素；微球；药物代谢动力学；肺靶向

Abstract

Objective:

ThepurposeofthisstudyisinvestigatingthevivoprocessofBDMCloadedPLGAmicrospheres（BDMC-PLGA-MS）andtissuedistributioninrats.Methods:

Pharmacokineticsprocessandtissuedistributionwasstudiedbyusinghighperformanceliquidchromatography.Results:

Afteri.vadministration,BDMCrapidlyeliminatedinratsin2hwhileBDMC-PLGA-MSsustainedreleasefor78h,showingaslow-releaseeffect.Inthetissuedistributionstudy,BDMC-PLGA-MShasthehighestconcentrationsinthelungtissuewhen24h,48hand72hafteradministration,indicatingthatBDMC-PLGA-MSwasmoreconcentratedinlungtissue.Conclusions:

BDMC-PLGA-MSsuspensionwithslow-releaseeffectandlungtargeting

Keywords：

Curcumin；Bisdemethoxycurcumin；microspheres；pharmacokinetics；lungtargeting

双脱甲氧基姜黄素PLGA微球药代动力学研究

前言

肺癌是严重威胁人类生命和健康的恶性肿瘤之一，根据全国肿瘤防治研究办公室调查统计，20世纪70年代中期开展的全国第一次死因回顾调查表明，我国肺癌死亡率为5.47/10万，在癌症死因中，排在胃癌、食管癌、肝癌及宫颈癌之后，居第5位，占全部癌症死亡7.43%。

与同期其它国家的肺癌死亡率水平相比，处于较低水平。

90年代初的全国第二次死因抽样调查结果中，肺癌死亡率为17.27/10万，居癌症死因第3位，仅次于胃癌和食管癌。

21世纪，卫生部开展了第三次死因回顾调查发现，肺癌的死亡率明显升高[1]。

双脱甲氧基姜黄素（bisdemethoxycurcumin，BDMC）是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种酚性色素，近年来人们对于其抗癌活性的研究也有了很大的突破，发现其对乳腺癌SKOV3细胞[2]、人肺腺癌A549细胞[3]等均有一定的抑制作用。

可影响肿瘤发生、发展的各个阶段（始发、促进和演进），并可通过抑制血管生成达到抗肿瘤侵袭和转移的目的。

但双脱甲氧基姜黄素水溶性差，性质不稳定，体内代谢迅速，生物利用度低，体内难以达到有效浓度，严重制约了其开发成有效的抗癌药。

可降解微粒载药系统可以延长药物在体内的滞留时间，通过特定的靶向作用提高病灶局部的药物浓度，从而增强治疗效果，减小毒性反应。

PLGA，即聚乳酸-羟基乙酸[poly（1actic-co-glycolicacid）是聚乳酸（PLA）、聚羟基乙酸（PGA）两者的共聚物，具有优良的生物可降解性和生物相容性，且降解速度可控，是理想的载体材料[4-5]。

药物动力学是应用动力学原理研究药物在机体内吸收、分布、代谢、排泄的经时过程，揭示机体对药物处置规律，以及这些处置对药物疗效和毒性的影响，对指导临床安全、合理用药非常重要，同时对新药的设计、开发和研制也具有重要的意义。

在本研究中建立了生物样本中双脱甲氧基姜黄素的高灵敏度分析方法，并对该方法进行专属性、精密度、准确度、回收率、稳定性等指标的考察，得出该方法完全符合生物样本测定要求后，将其应用于BDMC药代动力学研究中。

本实验通过对体内BDMC的测定考察BDMC-PLGA-MS的静脉给物代谢动力学。

1实验材料

1.1仪器

LC-15CHPLC仪（紫外检测仪：

SPD-15C；流动泵：

LC-15C；数据处理软件：

LCsolution15C）：

日本岛津公司；AB-135型分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；AnkeTGL-16GB高速离心机：

上海安亭科学仪器厂；LC-4016低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；XW-80A微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；KQ-300B型超声波清洗器：

昆山市超声仪器有限公司。

1.2动物

SPF级SD大鼠，体重200-250g，由安徽医科大学实验动物中心提供。

1.3药物与试剂

BDMC、Cur标准品（纯度：

HPLC≥99%、HPLC≥98%）：

上海锐谷生物科技有限公司；BDMC-PLGA-MS：

由安徽中医学院临床药学实验室自制;甲醇、乙腈（色谱纯）：

上海星可生化有限公司。

2实验方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：

COSMOSILC18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：

乙腈-4%冰醋酸（48:

52）；流速：

1.0ml/min；检测波长：

430nm；柱温：

30℃；进样量20μL。

理论板数应不低于4000。

2.2标准溶液的配制

BDMC标准品的配制：

精密称取BDMC标准品5.04mg，用甲醇溶解定容为10mL，配制为504μg/mL的贮备液，用甲醇稀释成浓度为50.40、25.20、12.60、6.30、3.15、1.575、0.788、0.394、0.197、0.098μg/mL的标准溶液。

内标液：

精密称取BDMC5.13mg，用甲醇溶解后，稀释到5.13μg/mL备用。

2.3生物样品的处理

2.3.1血浆样品的处理

取大鼠血浆100μL，加入甲醇溶液300μL及内标溶液（5.13μg/mL姜黄素标准液）20μL，混匀后，涡旋震荡5min，3000r.p.m离心15min；取上清液过滤后进样，用样品与内标峰面积比进行定量分析。

2.3.2组织样品的处理

精密称取大鼠相应组织0.3g，加1.0mL生理盐水将组织制成匀浆液，移取组织匀浆液100μL，加入甲醇溶液300μL及内标溶液（5.13μg/mL姜黄素标准液）20μL，混匀后，涡旋震荡5min，3000r.p.m离心15min；取上清液过滤后进样，用样品与内标峰面积比进行定量分析。

2.4专属性考察

取大鼠空白组织样品，按上述相应方法进行处理，并与给药后生物样品以及标准品对照，所得的色谱图见下图。

双脱甲氧基姜黄素的保留时间约为7.5min，内标姜黄素保留时间约为9min，由图可见，血浆中内源性物质不干扰双脱甲氧基姜黄素色谱峰和内标峰。

图1-1肾与心组织液液相色谱图：

A1：

空白肾组织液A2:

空白肾组织液+3.15μg/mLCur标准品A3：

大鼠i.v.10mg/kgBDMC-PLGA-MS后的样品色谱图；B1：

心组织液B2:

空白心组织液+3.15μg/mL标准品B3：

大鼠i.v.10mg/kgBDMC-PLGA-MS后的样品色谱图

Fig.1-1HPLCchromatogramsofA1）Blankkidney;A2）Blankkidneyspikewith3.15μg/mLBDMC;A3）Ratkidneysampleafterasinglei.v.Administrationof10mg/kg；B1）Blankheart;B2）Blankheartspikewith3.15μg/mLBDMC;B3）Ratheartsampleafterasinglei.v.Administrationof10mg/kg.

图1-2肝与脾组织液液相色谱图：

C1空白肝组织液C2:

空白肝组织液+3.15μg/mLCur标准品C3：

大鼠i.v.10mg/kgBDMC-PLGA-MS后的样品色谱图；D1：

脾组织液D2:

空白脾组织液+3.15μg/mL标准品D3：

大鼠i.v.10mg/kgBDMC-PLGA-MS后的样品色谱图

Fig.1-2HPLCchromatogramsofC1）Blankliver;C2）Blankliverspikewith3.15μg/mLBDMC;C3）Ratliversampleafterasinglei.v.Administrationof10mg/kg；D1）Blankspleen;D2）Blankspleenspikewith3.15μg/mLBDMC;D3）Ratspleensampleafterasinglei.v.Administrationof10mg/kg.

图1-3肺组织液与血浆液相色谱图：

E1：

空白肺组织液E2:

空白肺组织液+3.15μg/mLCur标准品E3：

大鼠i.v.10mg/kgBDMC-PLGA-MS后的样品色谱图；F1：

空白血浆F2:

空白血浆+3.15μg/mL标准品F3：

大鼠i.v.10mg/kgBDMC-PLGA-MS后的样品色谱图

Fig.1-3HPLCchromatogramsofE1）Blanklung;E2）Blanklungspikewith3.15μg/mLBDMC;E3）Ratlungsampleafterasinglei.v.Administrationof10mg/kg；F1）Blankplasma;F2）Blankplasmaspikewith3.15μg/mLBDMC;F3）Ratplasmasampleafterasinglei.v.Administrationof10mg/kg.

2.5标准曲线的制备及定量下限

取空白血浆100μL，加入BDMC系列标准溶液，配制成相当于双脱甲氧基姜黄素浓度为6.30、3.15、1.575、0.788、0.394、0.197、0.098、0.0098μg/mL的血浆样品，按“2.3.1血浆样品处理”项下处理后，取20μL进样，以待测浓度（C）为横坐标，利用待测物与内标物的峰面积比值Ri为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，求得的直线回归方程即为标准曲线（如图所示）。

获得的标准曲线线性相关系数R2值的范围是0.9994~0.9998，线性范围为0.098~50.4μg/mL，血浆中定量下限为0.0098μg/mL，结果见图1-4。

图1-4双脱甲氧基姜黄素在大鼠血浆中的标准曲线

Fig.1-4AverageoneofcalibrationcurvesofBDMCinratplasma

2.6精密度与准确度实验

取大鼠空白血浆100μL，按“2.5标准曲线的制备”项下方法配制双脱甲氧基姜黄素高、中、低3个浓度（分别为3.15、1.575、0.394μg/mL）的质控样品，3样本，按“2.3.1血浆样品处理”项下处理后，取20μL进样，用样品峰面积与内标峰面积比Ri代入同一条工作曲线，计算得到的相应浓度，考察日内和日间精密度，连续测定3天，求得的相对标准偏差均小于5%，结果见表1-1与表1-2。

表1-1日内精密度结果

Tab.1-1TheprecisionresultofBDMCwithin-day

加入浓度（μg/mL）

0.394

1.575

3.15

测得浓度（μg/mL）

1

0.386

1.526

3.206

2

0.423

1.606

3.157

3

0.399

1.548

3.354

Mean

0.402

1.560

3.239

SD

0.019

0.041

0.103

RSD（%）

4.657

2.631

3.174

表1-2日间精密度结果

Tab.1-2TheprecisionresultofBDMCbetween-day

加入浓度（μg/mL）

1

2

3

0.394

1.575

3.15

0.394

1.575

3.15

0.394

1.575

3.15

测得浓度（μg/mL）

0.386

1.435

3.286

0.406

1.608

3.219

0.419

1.645

3.237

0.422

1.546

3.320

0.392

1.580

3.357

0.397

1.565

3.101

0.419

1560

3.121

0.399

1.660

3.294

0.408

1.648

3.209

Mean

0.409

1.513

3.242

0.399

1.616

3.290

0.408

1.619

3.182

SD

0.020

0.068

0.106

0.007

0.040

0.069

0.011

0.047

0.072

RSD（%）

4.910

4.512

3.277

1.701

2.504

2.101

2.757

2.874

2.263

2.7回收率实验

将20μL不同浓度的BDMC系列标准溶液加入离心管中，加入甲醇溶液200μL及20μL内标溶液（5.13μg/mL姜黄素标准液），混匀后进样，记录样品峰面积与内标峰面积比值Ri，用Ri与稀释后的样品浓度作直线回归，得到标准品的回归方程；

另取离心管加大鼠空白血浆100μL，加入20μL的不同浓度的标准品溶液，使其浓度为3.15、1.575、0.394μg/mL，加入甲醇溶液200μL及20μL内标溶液（5.13μg/mL姜黄素标准液），混匀后，涡旋震荡5min，3000r.p.m离心15min；取上清液过滤后进样，将样品峰面积与内标峰面积比值Ri代入标准品的回归方程，得到相应浓度求得血浆中双脱甲氧基姜黄素的提取回收率。

提取回收率=测得的浓度/加入浓度×100%，重复测定5次，3个浓度的提取回收率分别为98.73%、99.01%、99.19%（n=5），总体平均为98.98%（n=15），结果见表1-3。

表1-3双脱甲氧基姜黄素在大鼠血浆中的提取回收率

Tab.1-3ExtraactionrecoveryofBDMCinratplasma

加入值（μg/mL）

0.394

1.575

3.15

测得值

回收率

测得值

回收率

测得值

回收率

（μg/mL）

（%）

（μg/mL）

（%）

（μg/mL）

（%）

1

0.384

97.46

1.546

98.16

3.124

99.17

2

0.398

101.02

1.581

100.38

3.172

100.70

3

0.383

97.21

1.565

99.37

3.092

98.16

4

0.388

98.48

1.557

98.86

3.099

98.38

5

0.392

99.49

1.548

98.29

3.135

99.52

Mean

0.389

98.73

1.5594

99.01

3.1244

99.19

SD

0.006

1.565

0.014

0.905

0.032

1.013

RSD（%）

1.58

1.58

0.91

0.91

1.02

1.02

2.8稳定性试验

为了考察双脱甲氧基姜黄素在测试过程中的稳定性，以保证所得数据的真实、可靠，进行了血浆样品室温放置实验，血浆样品反复冻融实验，长期冻存实验和血浆样品处理后放置实验。

2.8.1室温放置实验

取离心管加大鼠空白血浆100μL，加入浓度为0.08、1.50、4.00μg/mL的标准品溶液200μL及20μL内标溶液（5.13μg/mLCur标准液），在室温下放置6h，按“血浆样品处理”项下处理后，取20μL进样，并以当日是标准曲线计算浓度，所有样品的相对标准差（RSD），均小于15%，由表可知，样品在室温条件下放置6h，其稳定性良好。

结果见表1-4。

表1-4双脱甲氧基姜黄素在大鼠血浆样品中室温放置6h稳定性实验结果

Tab.1-4StabilityofBDMCinratplasmaatroomtemperature6hoursplacedattestresults

加入值（μg/mL）

1

2

3

4

5

Mean

SD

RSD（%）

0.08

0.079

0.080

0.082

0.076

0.076

0.079

0.002

3.148

1.50

1.519

1.483

1.487

1.421

1.433

1.469

0.041

2.783

4.00

4.174

4.220

3.496

3.987

4.135

4.003

0.296

7.403

2.8.2反复冻融实验

取离心管加大鼠空白血浆100μL，加入浓度为0.08、1.50、4.00μg/mL的标准品溶液200μL及20μL内标溶液（5.13μg/mLCur标准液），在-20℃冰箱冷冻24h，取出，室温融化后再放入冰箱中，反复3次后，按“2.3.1血浆样品处理”项下处理，取20μL进样，并以当日是标准曲线计算浓度，所有样品的相对标准差（RSD），均小于15%，双脱甲氧基姜黄素的血浆样品反复冻融仍然比较稳定。

结果见表1-5。

表1-5双脱甲氧基姜黄素在大鼠血浆中反复冻融稳定性实验结果

Tab.1-5StabilityofBDMCinratplasmaafterreduplicatefreezethawing

加入值（μg/mL）

1

2

3

4

5

Mean

SD

RSD（%）

0.08

0.079

0.080

0.082

0.076

0.078

0.079

0.002

2.645

1.50

1.519

1.487

1.654

1.541

1.552

1.551

0.063

4.040

4.00

4.199

4.483

4.220

3.884

3.906

4.138

0.249

6.014

2.8.3长期冻存实验

取离心管加大鼠空白血浆100μL，加入浓度为0.08、1.50、4.00μg/mL的标准品溶液200μL及20μL内标溶液（5.13μg/mLCur标准液），放置-20℃冰箱冷冻两周，37℃水浴解冻后，按“2.3.1血浆样品处理”项下处理，取20μL进样，并以当日是标准曲线计算浓度，所有样品的相对标准差（RSD），均小于15%，结果表明，双脱甲氧基姜黄素血浆样品放置-20℃冰箱中冷冻两周后降解较少，血浆样品依然很稳定。

结果见表1-6。

表1-6双脱甲氧基姜黄素在大鼠血浆中长期冻存稳定性实验结果

Tab.1-6StabilityofBDMCinratplasmalong-termfreeze-storedtestresults

加入值（μg/mL）

1

2

3

4

5

Mean

SD

RSD（%）

0.08

0.079

0.080

0.082

0.076

0.074

0.078

0.004

4.503

1.50

1.519

1.483

1.487

1.653

1.473

1.524

0.086

5.653

4.00

4.199

4.403

4.220

4.184

4.210

4.254

0.100

2.354

2.8.4处理后放置实验

取离心管加大鼠空白血浆100μL，加入浓度为0.08、1.50、4.00μg/mL的标准品溶液200μL及20μL内标溶液（5.13μg/mLCur标准液），按“2.3.1血浆样品处理”项下处理，在处理后0h和24h分别取20μL进样，并以当日是标准曲线计算浓度，所有样品的相对标准差（RSD），均小于15%，血浆样品处理后在室温条件下放置24h内，其稳定性良好，说明每天可以处理大批量的样品。

结果见表1-7。

表1-7双脱甲氧基姜黄素在大鼠血浆中室温放置24h稳定性结果

Tab.1-7StabilityofBDMCinratplasmaaftertreatmentfor24houratroomtemperatureattestresults

加入值（μg/mL）

1

2

3

4

5

Mean

SD

RSD（%）

0.08

0.077

0.081

0.077

0.078

0.078

0.078

0.002

2.377