关于重组人血白蛋白的系统性表述.docx

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关于重组人血白蛋白的系统性表述

关于重组人血白蛋白的系统性表述

人血白蛋白（HSA）作为一种重要的临床急救药物及重要的药物辅料，在医药，科研及化妆品生产等领域应用广泛。

随着国内医疗水平及居民收入水平的提升和对血液制品认知度的提高，血液制品的临床使用量不断增加，市场容量不断增长，行业快速发展。

根据国家医药管理局的报告，2010年全国16城市医院血液系统用药金额约62亿元，其中白蛋白类药物占据了血液制品的主要份额（大于50%）。

但作为一种血液制品，HSA同时也面临原料短缺及病毒污染等缺陷的影响。

用基因工程重组人血清白蛋白（rHSA）替代HSA是国际上公认的最有前途的高新技术途径。

一．什么是重组人血白蛋白

1.定义

通过基因重组的技术将目的蛋白的基因克隆后，将该基因插入到某种生物（如细菌、酵母、植物，哺乳动物细胞等）中进行复制，然后收集的白蛋白称为重组人血白蛋白。

2.rHSA的等级分类

按不同的质量标准分为了培养基级、药用辅料级和药用注射级（药用级）三类，三类级别的重组人血白蛋白生产工艺相同，但最终控制参数不同，药用级白蛋白质量标准最高。

3.rHSA的表达系统分类

白蛋白（HumanSerumAlbumin,HSA）是一组复杂的大分子蛋白质，必须经过正确的折叠、组装和翻译后修饰，才能赋予其特定的结构和功能，表达系统是重组人血白蛋白生产过程中极其重要的环节。

（1）原核表达系统

HSA基因最早就是在原核生物大肠杆菌（E.coli）中表达成功的，Lawn等于1981年首次报道了rHSA的cDNA序列并首次构建了第一个表达rHSA的表达载体pHSA，然后在E.coli中表达成功，表达量为细胞总蛋白的7%，但E.coli表达系统体外很难正确折叠和组装结构复杂的HAS，缺乏翻译后的修饰和加工，表达的蛋白多形成包涵体，且纯化较难，所以未能得到有生物功能的蛋白，细菌细胞壁脂多糖还会造成热反应。

因为HSA在原核生物中表达量不高且分泌效果不够理想，所以研究的重点转向其在真核生物细胞中的表达。

（2）酵母表达系统

酵母作为单细胞真核生物，既具有原核生物的容易培养、生长繁殖快、相对易于进行基因工程操作等优点，还具有原核生物缺少的其他优点，如蛋白质翻译后修饰和加工以获得有生物活性的重组蛋白，表达量和分泌量较大，易于产业化培养，非常适合白蛋白及其他非糖基化血浆蛋白的大规模制备。

研究者们用到的酵母表达系统有毕赤酵母（Pichiapastoris）、酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、汉逊酵母（Hansenulapolymorpha）、克鲁维氏酵母（Kluyveromyceslactis）等。

在酿酒酵母中，Okabayashi等通过构建在染色体LEU2和HIS4位点上整合的质粒获得能连续分泌rHSA的稳定转化株，每升培养基达到85mgrHSA。

毕赤酵母表达量和分泌量高且稳定，自身分泌蛋白量小，作为基因表达系统研究和使用的最多，已基本掌握其生长规律及大规模高密度发酵技术，被认为是最有发展前景的蛋白质生产工具之一。

毕赤酵母非常适合人血白蛋白等非糖基化血浆蛋白的大规模制备，成为目前rHSA的主要表达系统。

（3）其他表达系统

作为“生物反应器”的转基因动物自1987年以来就引起学者们广泛的关注。

就生产rHSA来说，最理想的表达场所是乳腺，因为乳腺是外分泌器官从而不会影响转基因动物本身的生理，表达的蛋白能经过充分的翻译后修饰加工，组织细胞密度高从而分泌水平高，目标蛋白纯化相对容易。

2000年黄淑帧等通过乳腺表达载体构建、显微注射、卵母细胞体外成熟和受精以及整合胚移植等技术成功将HSA基因整合入牛体内，转基因牛研制的总有效率为12.5%。

rHSA在老鼠的乳腺中也得到了成功表达且分泌量较高，达到11.9g/L。

但该表达系统存在病毒及朊病毒污染的风险，在产业化之前还有很多困难需要克服。

国内外也有转基因植物生产rHSA，但是该系统要实现产业化，需要克服植物合成的非人类糖可能导致免疫原性、田野或温室等标准操作规范等问题。

（4）各种系统表达重组人血白蛋白的比较

表达系统

总成本

产品周期

规模化生产的能力

产品性能

污染风险

存储成本

细菌

低

短

高

低

内毒素

中

酵母

中

中

高

极高

低

低

转基因动物

高

极长

低

极高

朊病毒和致癌病毒

高

转基因植物

中

长

高

高

低

低

4.与HSA相比的相对优势

目前该技术主要以酵母做为蛋白表达式生产，具有以下显著特征：

一是，rHSA与HSA的结构一致，临床疗效也相同。

二是，rHSA是利用现代生物发酵技术生产的白蛋白产品，不仅可提高产品的纯度，而且其质量明显优于血源提取物。

三是，采用基因重组方法生产白蛋白可实现大规模工业化生产，产量不受资源限制，从而降低白蛋白的生产成本。

四是，无动物源，可以有效避免人血白蛋白携带病毒等风险。

5.rHSA的技术难点

rHSA的纯化不同于pHSA等血浆蛋白及其它的重组蛋白，主要在于：

1）纯化体系复杂。

rHSA是通过酵母发酵生产的，由于发酵液中含有大量的酵母细胞组分和分泌物，如蛋白酶，杂蛋白，脂肪酸，核酸，多糖，色素，热原物质等。

如果不及时去除发酵液中的蛋白酶，rHSA就会被降解终；产物中如果含有酵母细胞组分，哪怕只有很少很少的含量，输入人体内转化为抗原，对于这种不同物种之间的相互作用，会对人体产生很大的危害。

2）纯度要求非常之高。

对于像疫苗这样需要微量输入的重组蛋白质来说，99.999%的纯度已经足够，但对于rHSA达到这样的纯度程度还是不够的，即使有很微量的有害杂质将可能产生致命的危险。

rHSA的纯度要大于>99.999999%。

3）要想在市场上立足，rHSA的成本必须低于pHSA才行。

其中rHSA的纯化成本占生产总成本的大部分。

所以要实现大规模生产，降低纯化成本是根本。

由此可见，rHSA走向工业化并商业化的两大难点--成本和质量（即纯度）将是对rHSA纯化技术需解决的问题。

二、主要应用领域

（1）作为临床急救药物，白蛋白在危急情况下能够使血液体积得到扩充，在慢性肝疾病患者、烧伤病人、急性细菌性腹膜炎、急性出血性休克病人中输注白蛋白溶液都取得了很好的疗效。

另外，白蛋白在癌症病人的治疗中、地震、战争中抢救伤员具有重要的价值，特别针对老年免疫力低下患者具有重要作用。

是国家战略储备物资之一。

（2）白蛋白能够作为药物制剂的辅料，如疫苗佐剂、保护剂、稳定剂、赋形剂等，如狂犬疫苗、乙肝疫苗、白介素、激素、生长因子等重组蛋白质类药品。

美国FDA批准Idelvion［凝血因子IX（重组体）、白蛋白融合蛋白］用于儿童及成年血友病B患者。

Idelvion是获得批准的首款凝血因子-白蛋白融合蛋白产品，也是为在血液中持续更长时间而在美国获得批准的第二款改进型因子IX融合蛋白产品。

Idelvion被用于替代因子IX，因子IX是一种自然产生凝血因子，血友病B（也称先天性凝血因子IX缺乏或克雷司马斯病）患者这种凝血因子缺失（功能性缺陷）或有缺陷。

Idelvion由重组体DNA技术将因子IX与白蛋白连接而成，白蛋白是血液中发现的一种蛋白，当静脉注射使用时，白蛋白可使该产品持续更久。

注释：

药用辅料（pharmaceuticadjuvant）是指生产药品和调配处方时所用的赋形剂和附加剂，包含在药物制剂中的物质，是除原料药以外药物制剂不可缺少的组成部分。

辅料在药物制剂中可以充当载体，有利于制剂形态的形成，还具有增加药物稳定性、改变药物在体内的吸收、增加生物利用度、控制药物释放速度及释放部位、增加可接受性等作用。

药用辅料在不同的国家、地区使用情况有很大差别，欧盟有3000种，美国有1500种，我国有543种，在我国符合药用质量标准的辅料只占少数，《中国药典》二部（2010版）仅收载药用辅料132种。

由于药用辅料的用量较大，其质量直接影响和制约终产品的稳定性、安全性及有效性，因此，合理应用及开发研制新型辅料将对提高药物制剂的质量具有重要意义。

人血白蛋白是一种亲水性的物质，化学性能稳定，无免疫原性，生物兼容性好，在体内，分子链中的肽键可被酶降解为小分子而被吸收，因而是一种非常理想的药物载体，可作为抗肿瘤药物的载体而显著提高肿瘤细胞中药物的分布，提高药物靶向性。

此外，白蛋白还具有其他作用：

与肽类药物融合可延长肽类药物的半衰期，减少用药剂量和药物副作用，减少患者用药次数；用于滴眼液治疗干眼症，能提高黏蛋白的分泌量；与胶原蛋白结合制成止血材料，不仅能结合、运输药物，还使止血材料增加了修复组织功能的作用；与聚乙二醇制成水凝胶，可用于外科手术中；与粒细胞集落刺激因子形成融合蛋白，可大大延长其半衰期等。

重组人血白蛋白与血源人血白蛋白具有相同的氨基酸组成及结构特征，其作用功能完全一致。

重组人血白蛋白的替代试验表明，在细胞培养、药用辅料及临床应用等方面与血源人血白蛋白完全相同，由于其比血源人血白蛋白纯度高，质量稳定，在安全性方面还优于血源人血白蛋白。

重组人血白蛋白替代血源人血白蛋白用于药物的研发和生产，尤其是用于药用辅料，不仅有助于彻底摆脱血液制品安全风险高、供应紧张的局面，更方便药政部门的监管；而其利用基因工程技术生产，工艺稳定，参数可控，批间均一稳定，也便于生产企业控制工艺条件，提升产品质量及市场竞争力。

（3）白蛋白能够结合脂肪酸、半胱氨酸、谷胱苷肽、胆红素、磷酸吡哆醛等，使它们避免被氧化。

同时白蛋白还能与铜离子螯合，阻止它参与氧化反应，所以白蛋白作为细胞培养基的有效成分能够促进细胞的生长，维持细胞膜的稳定性。

注释：

?

目前各大疫苗生产厂商面对市场需求纷纷扩产，将大大增加对培养基级白蛋白的需求量。

还有许多生物药的生产过程和最终产品中都需要白蛋白做保护剂。

作为培养基成分使用的人血白蛋白市场还将进一步扩大，发展潜力十分巨大。

近两年原料血浆供应减少，为保证危重病人用药的前提下，疫苗生产企业白蛋白的来源更加困难，特别是狂犬疫苗生产企业，白蛋白用量较大，前期病毒培养阶段需要用白蛋白，后加入白蛋白作为药用辅料，但是因为白蛋白供应减少，疫苗生产企业也面临生产瓶颈。

据我们此次调研得知，基于重组人血白蛋白的安全性、质量可控性、供货持续稳定性、以及大包装有效减少疫苗生产过程二次污染，下游疫苗企业对于人血白蛋白品种的更换态度积极；另外，由于人血白蛋白目前的供不应求的状态，SFDA一方面严把质量安全关，另一方面也将积极进行下游疫苗生产企业生产工艺变更的审批。

‚研究表明，接种疫苗后出现的过敏反应绝大多数与动物源性明胶相关，发生过敏反应的儿童血清中80%以上均可检测出抗明胶IgE。

水解明胶来源于动物组织，水解后产物为动物源多肽混合物，相对分子质量、等电点等理化性质均不明确，纯度及污染控制等问题难以解决。

另外，来源于牛或猪的动物源性明胶具有携带动物源性病毒的潜在危险性，病毒侵入可能引起人的海绵体脑炎等传染性疾病。

（4）人血清白蛋白作为化妆品原料，其功能是修复皮肤损伤、抗衰老、保湿、增白等功效。

越来越多的化妆品加入人血清白蛋白，特别是基因重组人血清白蛋白。

主要功能如下：

①高效保湿：

白蛋白有维持胶体渗透压的作用，它可以保住皮肤的水分不散失。

在人体中，1g白蛋白可保留18ml水，在皮肤表面使皮肤保持水润。

②重金属解毒：

长期使用化妆品会造成皮肤表面重金属离子含量超标，形成色斑，导致衰老。

白蛋白具有两亲性，疏水的一面使它结合皮质层的阳离子，亲水的一面使它在外力作用下携带离子离开皮脂表面，从而可以解毒。

③预防汞中毒：

化妆品中汞超标非常常见，汞离子非常容易通过皮肤表层和细胞膜表层，对肾脏、中枢神经系统造成损害。

在进行美容医疗时，含活跃自由巯基的白蛋白作为深度清理汞离子的最有效成分，可以在美容医疗上发挥重要作用。

④营养呵护：

皮肤表层组织蛋白与白蛋白能够相互转化，为皮肤提供全方位营养呵护，促进血液循环，减缓皮肤衰老，使得皮肤红润、有弹性。

（总体来说，白蛋白类化妆品在20世纪30年代开始出现，60年代在美国流行，之后出现了一系列针对性的研究，研究结论表明，白蛋白类化妆品可以在很短的时间内抚平皱纹，但是只能在2-6小时内保持效果，并且效果不会随着使用次数的增加而加深，在洗脸后，效果会消失。

普遍认为，白蛋白之所以会有抚平皱纹的效果是由于在干燥过程中蛋白质螺旋结构的展开，使皮肤向外扩张，从而抚平皱纹。

与上世纪30年代的情况一样，在20世纪60年代，白蛋白的皱纹也不像人们希望的那样成功。

除了过敏、稳定性和一些不适的问题外，这些产品没有持久的效果，而且对深层皱纹没有效果，尤其是在女性觉得重要的部位，比如脖子。

很可能很多女性都尝试过这种产品，然后又回到了通常的面霜。

然而，除了20世纪90年代的一个短暂时期，疯牛病（疯牛病）引起了相当多的关注，一些产品被召回，血清白蛋白继续被添加到许多皱纹减少的化妆品中。

现在白蛋白作为化妆品原料不再单独使用，而是通常与其他的起皱成分一起，包括保湿剂，使皮肤丰满，填充剂填充裂缝，以及分散光线并添加软化效果的光学面具。

这些产品中的许多都集中在眼睛上——在那里，皮肤更薄，更容易做出反应——并承诺清除眼袋、浮肿和皱纹。

）

人血白蛋白为什么不能添加进化妆品中？

从血液中分离得到的人血白蛋白，其化妆品用途已被提出但未被广泛应用，是因为如下几个原因：

1.违背伦理道德。

2.产品来源于血液，成分复杂，安全隐患大，含有潜在的病毒。

3.未经处理的人血白蛋白中含有盐类物质，损伤皮肤。

4.产品来源受限，市场供应紧张，假货较多。

重组人血白蛋白（rHSA）与血源人血白蛋白（HSA）相比较的优势

1.HSA是人体内源性物质，rHSA产品结构完全等同于HSA，具有与HSA相同的功效。

2.产品通过现代生物技术生产，原料及生产过程不添加任何动物源组分，无任何病毒残留，安全、可靠。

3.产品经过4次纯化，纯度更高。

4.产品针对美容用途设计，经过去盐处理，对皮肤零损伤。

5.绿色环保，无铅、汞添加。

6.拥有自主知识产权，产品拥有十余项专利

推荐用法

由于rHSA的光滑和湿润活性，适宜掺混在“免洗”产品中，例如水凝胶剂、霜剂、防晒凝胶、晒后和须后制剂以及唇膏等，特别是可以将rHSA掺混在基因水包油或油包水乳液的制剂和成膜制剂中。

（5）口服白蛋白利用富含白蛋白的食品为原料，经过水解工艺将其分解成氨基酸和肽类，制成营养保健品，不用分解即可被人体吸收。

对某些消化不良者、年老体弱需要补充蛋白质者，是个不错的营养来源，而且对提高免疫功能有一定的作用。

这种白蛋白充其量只是一种保健品而已，在治疗上是无法与通过静脉途径进入人体的白蛋白相提并论的。

氨基酸是组成蛋白质的基本单元,由许多氨基酸构成一个肽链,而一个蛋白质分子是由一个或几个肽链组成。

（6）在低温贮藏和细胞复苏方面的作用。

生物制品生产过程中及细胞库中广泛利用冷冻技术进行种子细胞的保存。

通过用重组人血白蛋白替代胎牛血清进行低温贮藏和复苏的研究，表明用重组人血白蛋白进行细胞的低温贮藏是可行的。

用重组人血白蛋白作为细胞冻存的培养基组分进行细胞的冻存，其效果类似于胎牛血清，在维持细胞增长和存活方面优于市售的冷冻剂。

使用重组人血白蛋白进行细胞低温贮藏和细胞复苏，冻结的细胞在解冻复苏期间，维持了高水平的细胞增值能力和低水平的中期细胞死亡率，表明无动物组分低温贮藏并没有造成细胞性能下降。

（7）重组人血白蛋白除了在临床上、细胞培养及药物辅料中广泛应用外，医疗器械中也在逐渐扩大应用范围。

其在医疗器械中的应用主要有：

与胶原蛋白结合制作成止血材料、制成医用可吸收纤维材料；与聚乙二醇组成聚合物水凝胶用于外科手术。

重组人血白蛋白与胶原蛋白结合制成止血材料，不仅具有结合、运输药物的功能，同时使止血材料具有了止血功能之外的修复组织功能的作用。

重组人血白蛋白纯度高，多聚体低于1%，使止血材料的有效性能得以提高。

重组人血白蛋白作为原料，用电纺丝技术生产出医用可吸收白蛋白纤维材料，用该材料纺织成纤维缝合线。

该纤维缝合线可用于创口的缝合，植入人体后被酶解，且吸收过程稳定、可靠，同时具有修复组织功能的作用，能加快创口的愈合。

重组人血白蛋白与聚乙二醇组成聚合物水凝胶作为粘合剂，具有机械强度高、快速的愈合能力，而且与需要愈合密封的骨组织或伤口有充分的粘合力，不产生免疫原性。

这项技术让外科医生针对病人肺部切除后造成的胸腔漏气进行有效的治疗。

目前国内外许多公司正在努力的将此技术的应用平台扩展到脊柱、普通外科和妇产科等临床领域。

目前巴德公司使用重组人血白蛋白和聚乙二醇交联组成水凝胶作为外科手术的密封剂，2010年1月14日美国FDA批准上市，是美国批准的唯一一个用于肺切除手术后胸腔漏气的密封剂。

也获得了欧洲CE标识。

三、产品竞争优势

与国内外同类型技术的比较，优势如下：

①系列高产菌株和菌种库：

已经建成原始种子批、主种子批和工作种子批三大体系。

适应不同的白蛋白级别要求而开发出来的不同的菌株类型。

化妆品级、细胞培养基级别的白蛋白采用AOX1启动子和快速、高产表达策略，这样可以大幅度的降低生产成本；辅料级和注射级白蛋白则采用AOX2启动子表达白蛋白。

AOX2启动子属于慢型启动子，表达的外源蛋白质速度较慢，但不会因为表达速度太快而出现目的蛋白质折叠错误而导致三维构象异常等问题。

②系统的研究了甲醇酵母细胞表达基因重组白蛋白的稳定性。

通过99代菌种遗传稳定性研究，结果发现：

甲醇酵母表达基因重组人血清白蛋白的水平没有降低；错误率和工作种子没有任何区别：

蛋白质表达错误率为0，因为通过测序发现，表达白蛋白的碱基序列没有任何突变。

从而保证白蛋白使用的安全性和可靠性。

③基因重组人血清白蛋白功能和活性比较实验。

通过系统比较人血浆来源的白蛋白与酵母细胞来源的基因重组白蛋白比较，其功能没有差异；活性没有差别。

④三维结构比较：

通过比较，不同来源的白蛋白在三维结构上没有任何差别。

二者均保留了17.5对的二硫键和一个自由的硫基（HS）集团。

⑤优化了甲醇酵母表达白蛋白的发酵条件。

从溶解氧、无机盐和Biotin补料、甘油浓度、甲醇浓度等多个方面进行了系统的优化。

从而形成了稳定的发酵工艺。

⑥甲醇酵母细胞循环使用不仅可以节约大量的培养基和培养时间，而且可以提高表达水平，降低生产成本。

因此，对于白蛋白的表达至关重要。

通过多年的实验，可以使酵母细胞重复使用三次，降低生产成本20%。

⑦甲醇酵母细胞的高密度发酵技术。

通过多年不停的驯化，甲醇酵母细胞可以耐受到OD600=500的水平。

在如此高的细胞密度下，白蛋白的表达水平可以提高50%以上。

⑧在提取纯化方面，在常规的蛋白质纯化技术基础上，采用先进的白蛋白亲和技术，仅用一步提取，白蛋白的纯度即可达到传统工艺的三倍以上，收率也大幅度提高。

这对于降低白蛋白的生产成本、提高白蛋白的质量是非常关键的。

最为重要的时，白蛋白单克隆抗体纯化，可以甄别白蛋白三维构象错误的蛋白质，保留具有活性的白蛋白，这对于用药效率、用药安全具有重要的意义。

比较美国默克公司，菌种高产120%，发酵时间缩短100小时。

比较日本三菱公司，菌种高产高出200%，发酵时间缩短120小时。

比较中国华北制药，菌种高产高出260%，发酵时间缩短100小时。