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性别鉴定计
性别鉴定计
篇一:
性别鉴定
pcR性别鉴定实验
摘要:
人类y染色体上特异性重复序列(humany-chromosomespecificrepetitiveDnAfamilysequence)是一种重复性很高的特异性序列,引物能在人类广大的基因组中对它进行特异性识别,因此,它是良好的pcR材料。
本实验通过对人黏膜细胞的DnA提取、基因组DnA制备、pcR扩增y染色体上特异性重复序列、pcR产物的电泳检测的方法实现人的性别鉴定。
通过此次实验,我们得到了预期结果,只有极少数因实验操作等人为失误导致实验与预期不符的情况发生,总之,用pcR技术扩增y染色体上特异性重复序列的方法是可靠的。
关键词:
基因组DnApcRy染色体上特异性重复序列电泳检测
引言
pcR(polymerasechainReaction)又称聚合酶链式反应,它是一种用于放大扩增特定的DnA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DnA复制,pcR的最大特点,是能将微量的DnA大幅增加。
因此,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的DnA,就能用pcR加以放大,进行比对。
鉴定性别方法有很多,巴氏小体观察法、染色体分型技术都可以对人的性别进行鉴定,但是染色体分型需要专门的技术和人才,巴氏小体鉴定人的性别准确率低,而且无法鉴别xxY、x0核型的性别。
而pcR的方法操作简单,准确率高。
由于Y染色体是区分性别的本质,pcR可以很简便地从基因组DnA中直接获得Y染色体DnA进行分析鉴定。
本实验就是通过pcR技术扩增y染色体上特异性重复序列来实现性别鉴定。
人类及哺乳动物的性别决定和分化是一个复杂的过程,涉及已知和未知的多个基因。
sRY基因是人类及已知许多哺乳动物中一段Y染色体特异的保守序列,人类sRY编码区全长615bp。
该基因的突变将导致xY染色体女性化(特纳氏综合征);而含有该基因的染色体片段如果易位到x染色体,则导致xx男性综合征。
但是由于人类的基因组太大,有700多mb,引物要从700多mb的序列中识别615bp的序列十分困难,因此,本实验选取的是一种更容易被引物识别的序列——y染色体上特异性重复序列(humany-chromosomespecificrepetitiveDnAfamilysequence)来进行pcR扩增。
电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。
各种生物大分子在一定ph条件下,可以解离成带电荷的离子,在电场中会向相反的电极移动。
凝胶是支持电泳介质,它具有分子筛效应。
含有电解液的凝胶在电场中,其中的电离子会发生移动,移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。
利用移动速度差异,就可以区别各种大小不同的分子。
因而,凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DnA片段,是分子生物学的核心技术之一。
综上,本实验通过对人口腔黏膜细胞的DnA提取、基因组DnA制备、pcR扩增y染色体上特异性重复序列、pcR产物的电泳检测的方法实现人的性别鉴定,取得了良好的效果。
正文
1.材料和方法
1.1材料和试剂
实验材料:
人口腔黏膜细胞
实验试剂:
ddh2o、10×buffer、dnTp(2.5mmeach)、primerF(10μm)、primerR(10μm)、Taq酶(5u/μL)、TAe、eb、agarose,etc.
实验仪器:
离心机、水浴锅、涡旋振荡器、微量移液器、不同类型的枪头、1.5mLep管、金属浴锅、制胶槽、制胶板、样品梳等
1.2实验方法
1.口腔上皮细胞DnA样品制备
(1)取一高压过的ep管,做好标记;
(2)取60μL细胞裂解液至一个ep管中;
(3)先用水漱口,然后用消毒牙签(钝头)刮取口腔上皮,弃去第一次刮取物,保留第二刮取物;
(4)将消毒牙签(钝头)放于ep管细胞裂解液中快速转动,释放细胞;(5)50℃水浴锅保温20min。
(6)在等待过程中建立pcR反应体系。
即取一个干净的pcR管,在冰浴中,依序加入表1中的成分(除了模板以外其他都加好)。
另外要设置阴性对照和阳性对照。
阴性对照不加模板,阳性对照加入男性基因组DnA。
(7)95℃金属浴保温除模版外pcR反应体系10min。
(8)12,000rpm离心除模版外pcR反应体3min,获得DnA溶液。
(9(10)将样品放入pcR仪中,按照表2的pcR反应条件进行目的片段DnA扩增。
2.1.2%的琼脂糖凝胶电泳
(1)正确组装1套制胶槽、制胶板、样品梳(使用2排25齿的梳子)。
(2)取80mL1×TAe至250mL干净红盖瓶中,称量0.96g琼脂糖,倒入瓶中,轻旋混匀。
轻
旋瓶盖,放入微波炉中加热沸腾3~4次,至溶液澄清无颗粒。
(3)待溶液冷却至60℃左右,加入40μL1mg/mL的溴化乙锭(eb)溶液,使eb溶液终浓度为0.5μg/mL,轻旋混匀后缓缓倒入架好样品梳的制胶槽中,冷却凝固(冷却凝固时间要在30min以上)。
(4)在20μLpcR反应液中加入4μL上样缓冲液,用微量移液器吹吸混匀。
(5)将凝胶中的梳子轻轻拔出,将凝胶连同制胶板一同放入电泳槽中,添加1×TAe电泳缓冲液至高出胶面约1mm。
(6)将上述混合好的DnA样品,按照表3的顺序,点样到凝胶中。
(7)开启电泳仪电源。
(8)选择合适的电压(100V)和时间(20min)。
(9)将电泳槽电极与电泳仪连接。
电泳槽红色电极为正极,与电泳仪正极相连。
电泳槽黑色电极为负极,与电泳仪负极相连。
(10)启动电泳,待观察到负极有气泡升起方可离开。
(11)电泳结束,关闭电源,取出凝胶,紫外灯下观察电泳结果,摄片,保存,分析。
2.结果
Y染色体特异性重复序列烦人DnA的pcR扩增电泳结果如图1所示。
图1-11.2%的琼脂糖凝胶电泳图(1组至6组)
图1-21.2%的琼脂糖凝胶电泳图(7组至10组)
图1-1的泳道1、泳道23、图1-2的泳道1、泳道16加的是DL2000DnAmarker,起指示DnA条带的作用。
DL2000DnAmarker的条带大小由上至下分别是2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp。
由于点样时间太长,图1-1泳道1和图1-2的泳道1的DL2000DnAmarker样品弥散了,因此在图中没有显示出来。
图1-1的泳道2、13,图1-2的泳道5是加入的样品是阴性对照,阴性对照组pcR反应体系不加模版,在100bp处有引物多聚体的条带,对女生的电泳结果起对照作用。
图1-1的泳道12,图1-2的泳道15是加入的样品是阳性对照,在299bp处有条带,能对男生的电泳结果起对照作用。
除DL2000DnAmarker的上样孔外,其他上样孔在100bp处都有或深或浅的条带,此处的条带是引物自身配对所形成的引物多聚体,条带深可能是因为:
①上样量相对较多;②所配总反映体系时没有充分混匀,导致分装过程中引物含量相对较多;③引物自身形成二聚体的量过多。
条带浅可能是因为:
①上样量相对较少;②所配总反映体系时没有充分混匀,导致分装过程中引物含量相对较少;③引物自身形成二聚体的量过少。
女生的上样孔为图1-1的泳道4、6、8、10、14、15、17、20、22和图1-2的泳道2、3、6、7、8、10、11、14。
所有的上样孔在100bp附近都有条带,是由于形成了引物多聚体。
图1-2的泳道6、7、8、10、11、14除了在100bp处有条带之外,在其上方也有较弱的条带,可能是操作过程中引入了DnA杂质而导致样品不纯。
男生的上样孔为图1-1的泳道3、5、7、9、11、16、18、19、21和图1-2的泳道4、9、12、13。
除泳道16外,其他上样孔在250bp靠上的位置均存在299bp的条带,有的条带深有的条带浅,可能是由于在取样过程中用牙签刮取的口腔上皮细胞量不同,导致所提取的DnA量不同,pcR扩增的片段的量也就不同了,也有可能是上样过程中点样量存在差异而导致最终条带亮度不同。
男生的泳道也均会形成100bp大小的引物多聚体。
泳道16没有299bp的条带可能是因为DnA模版没有加进pcR反应体系。
我的上样孔为图1-2的泳道7,存在100bp左右的引物多聚体,我的条带较浅是因为点样过程中样品点漂了;由于我的条带较浅,我的杂质也不太明显。
3.讨论
1.在建立pcR反应体系的时候,每桌可配成master后分装,这样可以保证加样量比较均一和准确,此外,每桌设置一个阴性对照和一个阳性对照。
2.女生注意保护好样品,以免样品被污染使电泳结果不准确。
3.pcR的反应条件有三个值需要人为设定,分别是复性温度(x℃)、延伸时间(Ys)、和循环次数(Zcycles)。
复性温度(x℃)由片段复杂程度决定的,片段复杂程度越高,复性温度越高。
延伸时间(Ys)取决于目的基因的长度,目的基因越长,延伸时间越长。
对于循环次数(Zcycles),循环次数越多DnA浓度越高,循环次数越少DnA浓度越低。
4.本实验pcR的人类Y染色体特异重复序列的最终产物大小是299bp,而前引物序列为ttccaatccattcctttcctttcgcttgc,序列长度是28bp,Tm值是54.96℃;而后引物序列为
ggatagtaatggactggagtgaaatggac,序列长度是29bp,Tm值是55.05℃。
因此,我们扩增的片段实际大小为242bp(299-29-28=242)。
5.引物设计时应避免一下几个方面:
①避免引物多聚体的形成:
尽可能避免两引物的3’端有较多碱基互补,引物二级结构的存在可能影响其与模版的特异结合和有效结合;②避免发夹结构的形成:
避免引物3’端形成发夹结构;③引物3’端的选择:
引物3’端需与模板DnA严格配对,不能有任何修饰,3’端的错配则会影响DnA聚合酶的有效起始;最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对;最后1~2个碱基(nt)最好不要用T/A,因为T/A之间只有两个氢键,引物与模版结合不牢固。
④避免引物在模版内部的错配:
引物在模板内应具有单一性,也就是说在模板内部没有错配。
如果引物可以结合除目的位点外的其他区域,扩增效率将明显降低,目的产物带将减少。
可以在引物设计好后,最好做blast检测,检查同一物种基因组中是否存在高度同源序列。
6.引物5’端可引入与模板DnA不配对的碱基,如:
①限制性核酸内切酶识别序列,以方便克隆操作;②各种寡核苷酸接头;③可改变某个碱基,从而在产物中引入点突变;④可利用放射性或非放射性物质(如生物素、地高辛等)进行标记,以方便后续分析、检测。
7.引物设计时应该把握以下几点:
①引物长度一般为15-30nt:
某些长的pcR片段和特殊的pcR片段需要更长的引物,引物越长,与模版结合的特异性也就越好,但是引物过长,包含的碱基越多,发生错配的概率就越高,通常更易于形成包括发卡结构、二聚体自身互补等二级结构。
,此外,引物过长会导致其延伸温度过高,不适于TaqDnA聚合酶进行反应。
如果引物太长就缩短退火时间,提高退火温度,杜绝形成引物二聚体;②引物gc含量在40%~60%之间:
gc含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的gc含量不能相差太大,因为引物的Tm值与gc含量密切相关,gc含量相差太大不好设置退火温度;③Tm值最好接近72℃:
Tm值(meltingtemperature)是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度.有效启动温度,一般低于Tm值5℃.若按公式Tm=4(g+c)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳;④碱基要随机分布:
同一碱基不应连续超过4个,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的g或c,因这样会使引物在g+c富集序列区
篇二:
胎儿性别鉴定
胎儿性别鉴定
与性别相关的遗传疾病,一些可能只出现在男性胎儿中,而还有一些可能只出现在女性胎儿中。
因此对于可能有这类遗传疾病史的家庭,早期鉴定胎儿性别将有利于制定最终基因检测计划。
过去,胎儿性别鉴定经常使用介入性早孕期诊断方法,比如绒毛活检。
由于采用怀孕组织直接取材,介入性早孕期诊断的准确率很高。
但是,因为诊断过程需要用针头刺人子宫内取样,这种手术有可能导致流产。
超声波诊断也可以用于胎儿性别鉴定,但是它只能对妊娠中期的胎儿性别做出准确鉴定。
而对于诊断与性别相关的遗传疾病,基因检测计划得制定需要在早孕期鉴定胎儿性别,因此,在这种情况下,超声波检测并不是一个很好的方法。
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