生物分离工程实验教案.docx

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生物分离工程实验教案

山西大同大学

生命科学学院教案

课程名称：

生物分离工程实验

教材名称：

生物分离工程实验

授课对象：

11级生工1班

授课学期：

2013-2014第二学期

讲课学时：

32

授课教师：

张睿、张弘弛

技术职务：

讲师

工作单位：

生科院生工系

编写时间：

2014年4月

审阅意见：

生命科学学院讲稿

第一章标题

（章标题三号字体，加粗，居中，行距固定值17磅，段前段后1行）

第一节标题

（节标题小三号字体，加粗，居中，行距固定值17磅，段前段后0.5行）

一级标题

（四号字体，加粗，顶格，行距固定值17磅，段前段后0.5行）

二级标题（小四号字体，加粗，顶格，行距固定值17磅）

正文

正文字号采用小四号，中文字体为宋体，数字及英文字体均为TimesNewRoman，字符间距：

标准，行距：

17磅。

实验一两种方法制备溶菌酶粗提液

1、实验目的

学习溶菌酶粗提液制备的方法和基本原理。

二、实验原理

方法一：

0.05mol/LTris-Hcl缓冲液提取

蛋清溶菌酶的等电点为10.5，相对分子质量为1.43×104，在鸡蛋蛋清中的含量约为3%-4%。

蛋清中与溶菌酶的等电点接近的蛋白质种类较少，所以在提取缓冲液PH为9.0的条件下，只有包括溶菌酶在内的个别蛋白质带正电荷，很容易选择阳离子交换层析与大量带负电荷的蛋白质分开。

本实验利用PH9.0的缓冲液抽提蛋清，通过离心的方法除去不溶物，获得溶菌酶的粗提液，为阳离子交换层析做好准备。

方法二：

高温变性沉淀分离

溶菌酶带正电荷，与酸根负离子生成可溶性盐，且溶菌酶耐热性较高，而其它杂蛋白在高温下变性沉淀，之后通过离心的方法除去不溶物，获得溶菌酶的粗提液。

3、仪器、试剂和材料

1.仪器

（1）100ml烧杯16个；

（2）脱脂纱布1卷；（3）50ml离心管16个；

（4）冷冻离心机1台；（5）水浴锅

2.试剂

（1）提取缓冲液：

0.05mol/LTris—HCl缓冲液，PH9.0；

（2）醋酸

3.材料

新鲜鸡蛋

4、操作步骤

方法一：

小心破碎鸡蛋，将蛋清收集到一个干净的100ml烧杯中，用双层纱布过滤蛋清，收集滤过液，每3ml蛋清加入6mlPH9.0的提取缓冲液，轻轻振荡混匀，4℃冰箱中静置20min,转入1.5ml离心管中，10000r|min离心10min，上清液即为溶菌酶的粗提液。

吸取1ml粗提液保存在1.5ml离心管中，标记好，置-20℃冰箱保存。

方法二：

取6mlddH20，用醋酸调pH至3.5，放入85℃水浴锅中，加入3ml蛋清滤过液，在搅拌的条件下加热5min后，10000r|min离心10min，上清液即为溶菌酶的粗提液。

吸取1ml粗提液保存在1.5ml离心管中，标记好，置-20℃冰箱保存。

五、结果处理

【注意事项】

收集蛋清时不要混入蛋黄，在用纱布过滤时，请勿用力挤压，以免将卵胚等物质滤过。

【思考题】

如何选择溶菌酶粗提液制备的缓冲液？

粗提液制备各步骤的基本作用是什么？

【参考资料】

《生物化学实验技术》郭蔼光，郭泽坤主编，高等教育出版社出版

实验二考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量

一、实验目的和要求

通过实验，熟悉考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量的实验原理和操作方法。

二、实验原理

考马斯亮蓝G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）比色法是常用的一宗蛋白质含量的测定方法。

1976年由Bradford建立，用于测定蛋白质浓度。

考马斯亮蓝G-250是一种染料，在酸性溶液中为棕红色，最大光吸收波长为465nm。

它能与蛋白质通过疏水作用结合，形成蛋白质—染料的复合物，颜色由红转变为蓝色，在595nm波长下有最大吸收值，并且在低浓度范围内（0.01~1.0mgml），与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。

该法操作简单，反应迅速，2min左右即达到平衡，而且灵敏度很高，可测微克级的蛋白质含量，所生成的染料—蛋白质颜色稳定，实验重复性好，抗干扰性也强，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。

被测蛋白质与标准蛋白质氨基酸组成差异较大时，有一定差异，因为与染料结合量不同。

三、实验器材与试剂

（一）器材

精密电子天平，电子台秤，分光光度计（可见光），恒温水浴锅，容量瓶，小试管，小滴管和移液管（或可调式移液管）等。

（二）试剂

考马斯亮蓝G-250，牛血清蛋白（生化试剂），NaCl，95%乙醇和85%磷酸等。

四、操作方法

（一）试剂配制

1.考马斯亮蓝G-250溶液配制

精确称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml95%乙醇中，并加入100ml85%浓磷酸，然后，用蒸馏水稀释并定容至1000ml。

2.牛血清蛋白溶液配制

精确称取0.060g牛血清蛋白，加入0.526gNaCl，溶于少量蒸馏水中，然后稀释定容至500ml，配成120μg∕ml的牛血清蛋白原液。

（2）标准曲线制作方法

在5支试管中，分别精确吸取牛血清蛋白原液0.20，0.40，0.60，0.80，1.00ml，用蒸馏水全部稀释至1.0ml，然后分别加入5.00ml考马斯亮蓝溶液，混合均匀，于（25±1）℃的恒温水浴中保温10min，冷水浴中冷却后，立即于595nm波长处比色测定。

以1.00ml蒸馏水代替样品液，加入5.00ml考马斯亮蓝溶液，其余操作同上，做空白对照。

以试管中标准蛋白的总量（μg）为横坐标，相应的吸光度值（A）为纵坐标作标准曲线图，并作线性回归，求线性方程。

（3）未知样品的测定

将未知样品液作适当稀释（使其测定值在标准曲线的直线范围内），取1.00ml稀释液于试管中，按上述相同方法加入考马斯亮蓝溶液并比色测定。

根据所测定的A595值，由标准曲线线性方程，计算出未知样品的蛋白质质量浓度（mg∕ml）。

（四）操作注意点

1.显色受时间和温度影响较大，标准曲线和样品测定应尽量控制在同一条件下进行。

2.比色杯易受蓝色污染，应注意用乙醇清洗。

五、思考题

（一）预习

简述用考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量的基本原理。

与其他测定蛋白质的方法相比，该法有何优点？

（二）实验结果和讨论

1.将比色分析的操作过程及结果列成表格，作标准曲线图，并作线性回归，求出线性方程。

2.分析引起实验误差的原因。

实验三浓盐法提取酵母RNA

1．目的

学习和掌握从酵母中提取RNA的原理和方法，以加深对核酸性质的认识。

2．原理

酵母含RNA2.67%~10.0%，DNA很少（0.03%~0.516%），而且菌体容易收集，RNA也易于分离，所以选用酵母为实验材料。

RNA提制过程是先使RNA从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去。

再根据核酸在等电点时溶解度最小的性质，将PH调至2.0~2.5，使RNA沉淀，进行离心收集。

提取RNA的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。

前者利用稀碱溶解细胞壁，使RNA释放出来，这种方法提取时间短，但RNA在此条件下不稳定，容易分解；后者在加热的条件下，利用高溶度的盐改变细胞膜的透性，使RNA释放出来，此法易掌握，产品颜色较好。

3．仪器、试剂和材料

1、

（1）量筒（50ml）

（2）三角瓶（100ml）（3）烧杯（250ml、50ml、10ml）（4）布氏漏斗（40mm）（5）吸滤瓶（125ml）（6）751型分光光度计（7）表面皿（6cm）（8）离心机（4000r╱min）（9）恒温水浴（10）药物天平（11）烘箱

2、试剂

（1）Nacl（化学纯）

（2）6molHcl（3）95%乙醇（化学纯）

3、材料：

鲜酵母或干酵母；PH0.5~5.0的精密试纸

4．操作步骤

1、提取

称取干酵母粉2.5g，倒入100ml三角瓶中，加Nacl2.5g，水25ml，搅拌均匀，置于沸水浴中提取1h。

2、分离

将上述提取液用自来水冷却后，装入大离心管内，以4000r╱min离心10min，使提取液与菌体残渣等分离。

3、沉淀RNA

将离心得到的上清液倾于50ml烧杯内，并置于放有冰块的250ml烧杯中冷却，待冷置10℃以下时，用6mol╱LHcl小心调至PH2.0~2.5（注意严格控制PH）。

调好后继续于冰水中静置10min，使沉淀充分，颗粒变大。

4、洗涤和抽滤

上述悬浮液以4000r╱min离心10min，得到RNA沉淀。

将沉淀物放在10ml小烧杯内，用95%的乙醇5~10ml充分搅拌洗涤，然后在布氏漏斗上用射水泵抽气过滤，再用95%乙醇5~10ml淋洗3次。

5、干燥

从布氏漏斗上取下沉淀物，放在6cm表面皿上，铺成薄层，置于80℃烘箱内干燥，将干燥后的RNA制品称重，存放于干燥器内。

6、含量测定

将干燥后RNA产品配制成浓度为10~50μm╱ml的溶液，在751型分光光度计上测定其260nm处的吸光度，按下式计算RNA含量。

RNA含量（%）=A260╱（0.024×L）×（RNA溶液总体积（ml）╱RNA称取量（μm））×100

式中，A260为260mm处的吸光度；L为比色杯半径；0.024为1ml溶液含1kgRNA的吸光度。

5．结果处理

根据含量测定的结果按下式计算提取率

RNA提取率（%）=（RNA含量（%）×RNA制品重（g）／酵母重（g））×100

6、注意事项

1、用浓盐法提取RNA时应注意掌握温度，避免在20~27℃之间停留时间过长，因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用活跃的温度范围，会使RNA降解而降低提取。

2、加热至90~100℃使蛋白质变性，破坏丙磷类磷酸酯酶，有利于提取。

实验四大蒜中SOD的提取分离

一、实验目的

通过大蒜细胞SOD的提取与分离，学习和掌握蛋白质和酶的提取与分离的基本原理和操作方法。

二、实验原理

超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。

它可催化超氧负离子（O2－）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：

2O2－＋H2＝＝O2＋H2O2。

大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲液提取。

由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。

三、器材与试剂

（一）器材

恒温水浴锅、冷冻高速离心机、可见分光光度计、研钵、玻棒、烧杯、量筒

（二）材料和试剂

1、新鲜蒜瓣

2、0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）（详见生化实验书附页）

3、氯仿-乙醇混合液：

氯仿:

无水乙醇=3:

5

4、丙酮：

用前需预冷至4-10℃

四、实验方法及步骤

1．组织或细胞破碎

称取5g左右大蒜蒜瓣或大蒜细胞，置于研磨器中研磨，使组织或细胞破碎。

2．SOD的提取

将上述破碎的组织或细胞，加入2－3倍体积的0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后用离心机在5000rpm，离心15min，弃沉淀，得提取液。

3．除杂蛋白

提取液加入0.25倍体积的氯仿－乙醇混合溶剂搅拌15min，5000rpm离心15min，去杂蛋白沉淀，得粗酶液。

4．SOD的沉淀分离

将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min,5000rpm离心15min，得SOD沉淀。

将SOD沉淀溶于0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲液中，于55－60℃热15min,离心弃沉淀，得到SOD酶液。

将上述粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。

5．SOD活力测定

取3根小试管，按下表分别加进各种试剂和样品液。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（ml）

试　　剂

空白管

对照管

样品管

碳酸缓冲液

5.0

5.0

5.0

EDTA溶液

0.5

0.5

0.5

蒸馏水

0.5

0.5

－

样品液

－

－

0.5

混　合　均　匀

肾上腺素液

－

0.5

0.5

在加入肾上腺素前，充分摇匀并在30℃水浴中预热5min至恒温。

加入肾上腺素（空白管不加），继续保温反应5min，然后立即测定各管在480nm处的光密度。

对照管与样品管的光密度值分别为A和B。

在上述条件下，SOD抑制肾上腺素自氧化的50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。

即：

　　　　　　　　　酶活力（单位）＝2·（A－B）·N/A

式中　　N――样品稀释倍数；

　　　　2――抑制肾上腺素自氧化50%的换算系数（100%/50%）。

若以每毫升样品液的单位数表示，则按下式计算：

　　　　　　酶活力单位/ml＝2·（A－B）·N/A·V/V1＝26·（A－B）·N/A

式中V――反应液体积（6.5ml）；

　　V1――样品液体积（0.5ml）。

五、实验结果

根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积，计算纯化提取率。

六、注意事项

酶液提取时，为了尽可能保持酶的活性，尽可能在冰浴中研磨，在低温中离心。

实验五PEG/（NH4）2SO4两水相系统相图

1、实验目的和要求

了解制作两水相系统相图的方法，加深对相图的认识。

2、实验原理

两种亲水相高聚物或高聚物与无机盐在水中会形成两个相，这是由于高聚物的不相溶性或盐析作用而引起的，但是它们只有达到一定的浓度时，才能形成两相。

两水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，它是一根双节线，当成相组分的配比取在曲线的下方时，系统为均匀的单相，混合后，溶液澄清透明，称为均相区；在曲线的上方时，能自动分为两相，称为两相区，若配比取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为浑浊。

相图是研究两水相萃取的基础。

3、实验器材与试剂

（1）器材

电子台秤，漩涡混合器，大试管（20ml），25ml滴定管，密度计和温度计等。

（2）试剂

聚乙二醇400（PEG400），硫酸铵等。

4、操作方法

（1）溶液配制

配制43.00%（g/ml）的溶液：

精确称取固体430.0g用少量水溶解后稀释到1000ml，并用密度计测定其密度。

（2）相图的制作

精确称取PEG400液体0.700g左右于大试管中，按表2.6.1中所列第1号数据，加入0.5ml去离子水（H2O的密度以1g/ml计），用滴定管缓慢滴加已配好的（NH4）2SO4溶液，并不断在漩涡混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内溶液开始出现浑浊为止。

记录硫酸铵溶液的加量（ml），根据密度值求出质量（g）。

然后，按表格所列第2号数据加入水，溶液澄清（加水量根据点子的密集程度控制），继续向试管中滴加硫酸铵溶液并不断混匀，直至再次达到浑浊，如此反复操作。

计算每次达到浑浊时，PEG和（NH4）2SO4在系统总量中的质量分数（g/g），将实验数据填入表1中，用温度计测量溶液的温度。

以PEG的质量分数为纵坐标，（NH4）2SO4的质量分数为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。

表1相图制作表

PEG400=g;

温度t=℃

编号

H2O

加量/g

（NH4）2SO4

溶液加量

纯（NH4）2SO4累计量/g

溶液累计总量/g

PEG400质量分数/%

（NH4）2SO4质量分数/%

/ml

/g

1

0.5

2

0.3

3

0.3

4

0.3

5

0.5

6

0.5

7

0.5

注：

如果实验室的电子台秤（精确至0.01g）能做到每组一台，也可采用在电子台秤上称取质量的方式来加

（NH4）2SO4溶液，这样就不需要通过密度转换，更直观。

5、思考题

（1）预习

1.简述两水相萃取中成相的原因。

2.说明实验数据的每步计算方法。

（2）实验结果和讨论

1.将实验结果列入表格，并作出相图。

2.实验操作中应注意哪些问题？

分析试验误差。

实验六两水相系统中蛋白质分配系数的测定

一、实验目的和要求

了解蛋白质在两水相系统中分配系数的测定方法。

二、实验原理

在两水相系统中，生物大分子物质与成相组分之间通过疏水键，氢键和离子键等相互作用而不同程度地分配在两水相中，当萃取达到平衡时，蛋白质在上，下两相中的浓度之比，称为分配系数K，用下式表示：

K=C1/C2

式中：

c1和c2——表示平衡状态下，上相和下相蛋白质的浓度

本实验以糖化酶为实验对象，在PEG/（NH4）2SO4水相系统中进行分配，用考马斯亮蓝比色法测定两相中总蛋自质的含量，求分配系数。

三、实验器材与试剂

（一）器材

电子台秤，10ml刻度离心试管，台式离心机，移液管或可调式移液器，小滴管，50ml容量瓶和试管等

（二）试剂

牛血清白蛋白溶液，PEG（聚乙二醇）400和硫酸铵等。

四、操作方法

（一）蛋白质在两相中的分配

在10ml刻度离心试管中.用电子台秤称取（NH4）2SO4固体1.30g,PEG400液体2.00g，用吸管加入牛血清白蛋白溶液2.00rnl，然后加水，直到总量为8.00g。

用橡皮塞塞紧试管口，用力振摇数分钟，使（NH4）2SO4全溶解，并使两相充分混合。

以便酶在两相中的分配达到平衡，然后，用台式离心机离心3min，转速调节至3000r/min，分别读出上、下相的体积，求相比R（上相体识与卞相体积之比），并用考马斯亮蓝比色法测定两相中的蛋白质浓度，求出分配系数。

（二）考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量

标准曲线的制作方法见实验二，样品的测定方法如下:

上相液：

吸取上相液0.5m1，用水稀释定容到1ml，取1.00ml稀释液于试管中，按标准曲线相同的方法加人考马斯亮蓝溶液并比色测定。

下相液：

吸取下相液0.1ml于试管中，加蒸馏水0.9ml，然后，按相同方法操作。

根据在595nm波长下所测得的吸收值，由标准曲线线性方程和不同的稀释倍数，计算出上,下两相中蛋白质质量浓度（mg/ml）。

然后按式（2-7-1）求分配系数K。

五、思考题

（一）预习

1、配制两水相萃取系统时，PEG400液体的加量能否改为量取相应的体积?

说明理由。

2、试述使用台式离心机的操作顺序。

3、用比色法分析上、下相蛋白质浓度时，如何精确吸出在同一离心试管中的上、下两相?

写出操作步骤。

（二）实验结果和讨论

1、将比色分析的操作过程及结果列成表格，作标准曲线图，并作线性回归。

2、求上，下相蛋白质浓度及分配系数K，求出相比R，计算该两相系统中PEG和（NH4）2SO4的含量。

3、在配制两水相系统时，为什么必须充分混合?

混合不充分会带来什么影响?

4、分析引起实验误差的因素。

实验七反胶束萃取法pH对萃取率的影响

一、实验目的和要求

1.加深对反胶束萃取基本原理的理解。

2.通过实验，了解反胶束萃取的基本操作方法。

3.以牛血清蛋白为实验对象，了解PH在反胶束萃取工艺中的重要性。

二、实验原理

反胶束萃取技术是利用表面活性剂在有机溶剂中自发形成的反胶束相来萃取水溶液中的大分子蛋白质，与有机溶剂萃取法相比较，由于在反胶团内部存在着能使蛋白质稳定的“水池”，故适用于蛋白质之类大分子生化物质的提取分离，而有机溶剂萃取法的相系统中不具有这种微环境，容易使蛋白质变性失活，故通常不适用于蛋白质的提取。

本实验利用阳离子型表面活性剂CTAB（溴化十六烷基三甲铵）在有机溶剂中形成的反胶束相来萃取牛血清蛋白（等电点PI=4.9，相对分子质量Mr=67000）。

CTAB形成的反胶束内表面极性头带有正电荷，当牛血清蛋白表面的净电荷为负值时，由于静电引力作用，使其被萃取进入反胶束内，反之，则不能被萃取，因此溶液的PH是影响反胶束萃取的重要因素。

三、实验器材与试剂

（一）器材

紫外分光光度计，电子天平，旋涡混合器，具塞大试管，PH酸度计，移液吸管和试管等。

（二）试剂

CTAB,牛血清蛋白（BSA，生化试剂），正己醇，正辛烷，KCl，NaOH，冰醋酸和乙酸钠等。

四、操作方法

（一）溶液配制

1.含1mg∕ml牛血清蛋白（BSA），0.1mol∕LKCl的pH4.0乙酸—乙酸钠缓冲液（原液A）

①配制含0.1mol∕LKCl的pH4.0乙酸—乙酸钠缓冲液：

将0.2mol∕L乙酸钠18ml和0.2mol∕L乙酸82ml混合均匀，加入0.75gKCl，搅拌溶解。

②精确称取0.05gBSA，用上述pH4.0缓冲液溶解，并定容至50ml。

2.含1mg∕ml牛血清蛋白（BSA），0.1mol∕LKCl的pH7.2水溶液（原液B）

①在100ml蒸馏水中加入0.75gKCl，用0.1mol∕LNaOH液调节溶液pH至7.2左右。

②精确称取0.05gBSA，用上述溶液溶解，并定容至50ml。

3.20mmol∕LCTAB正辛烷：

正己醇（4：

1，V∕V）的反胶束相溶液

称取0.73gCTAB溶于100ml的正辛烷：

正己醇（4:

1，V∕V）混合液中。

（2）萃取

1.在2支具塞试管中分别加入10.0ml上述已配制好的原液A和原液B，再加等体积的反胶束相溶液，在旋涡混合器上充分混合5min，使达到萃取平衡。

2.将乳浊液于3000r∕min，离心5min。

吸上相液和少量下相液，将下层水相用酸度计分别测定其pH。

3.按下述方法分析2支试管下相液中蛋白质的含量。

4.蛋白质的萃取率用下式计算：

E=（Co—Cw）∕Co

式中：

Co——原液中蛋白质的浓度

Cw——萃取平衡后下相液中蛋白质的浓度

（3）紫外分光光度法测定含量

1.标准曲线制作

将原液A和B分别用相应的含0.1mol∕LKCl的pH4.0缓冲液和pH7.2水溶液稀释，配成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg∕ml的溶液，以稀释液为空白对照，在280nm波长处测吸收值，以吸光度值A280为纵坐标，牛血清蛋白含量（mg∕ml）为横坐标作标准曲线。

作线性回归，求直线方程。

2.样品测定

将萃取后的下相液在280nm波长下测定吸光度值，由标准曲线计算含量。

五、思考题

（一）预习

1.简述反胶束萃取法的基本原理。

2.分别说明CTAB、正己醇、正辛烷、KCl在反胶束相中所起的作用。

（2）实验结果和讨论

1.将标准曲线的实验结果列成表格。

以吸光度值A为纵坐标，牛血清蛋白浓度为横坐标作标准曲线图。

作线性回归，并求直线方程。

2.分别计算不同pH的萃取率，并从理论上分析pH影响萃取率的原因。

实验八大网格吸附树脂的吸附等温线的制作

一、实验目的和要求

1.通过实验，加深对大网格树脂吸附法机制的理解。

2.了解吸附等温线的制作过程和操作方法。

二、实验原理

大网格树脂吸附法是利用树脂表面分子（包括树脂外表面和空隙的内表面）与生化物质分子间的范德华引力作用，将液体中的生化物质吸附到数值表面，与大量杂质分离，然后再用适当的溶剂将其洗脱下来。

大网格聚合物吸附树脂是一种应用较广泛的吸附剂，它与大网格离子交换树脂的主要区别在于其内部结构中没有可被交换的离子基团，因此，是利用分子间作用力进行吸附。

吸附等温