反相高效液相色谱法测定食用植物油中维生素E的含量.docx
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反相高效液相色谱法测定食用植物油中维生素E的含量
无水乙醇:
检查是否含有醛类物质,方法:
加一定量的氨水于硝酸银溶液(50g/L)中,直至生成的沉淀重新溶解,再加入几滴氢氧化钠溶液(100g/L),如再产生沉淀,则再加入氨水直至沉淀消失,此溶液则为银氨溶液。
吸取2ml银氨溶液于干净试管中,加入0.5ml乙醇,摇匀,再加入几滴氢氧化钠溶液(100g/L),于沸水浴上加热,放置冷却后,试管壁出现少量片状银镜,则乙醇需经过处理后使用。
脱醛方法:
称取4g硝酸银溶解于少量水中,称取8g氢氧化钠溶于温热的乙醇中,然后将两者倒入1L的乙醇中,充分震摇后,放置暗处2d(期间不时摇动),过滤后,于水浴中蒸馏,弃去初滤液,收集滤液,然后再检
查。
1.1.3仪器与设备
Waters高效液相色谱仪e2695配2489紫外检测器美国沃特斯有限公司色谱
柱C柱(150mm<4.6mm5um)18
1.2试验方法
1.2.1标准溶液的配制
天然维生素E同系物通常为透明、淡黄色粘稠油状物,无臭无味,比重为0.950(25?
),不溶于水,可溶于油、丙酮、乙醇、三氯甲烷和乙醚等脂溶[8]性溶剂。
因为乙醇要进行脱醛处理,故选择甲醇配制标准溶液。
将100m①-生育酚、
100ma-生育酚、25mgr-生育酚用甲醇分别定容至100ml、100ml、50ml棕色容量瓶中,将其作为1mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml的储备液,放置冰箱保存;
移取一定体积的三种生育酚储备液,配制成1mg/ml、10mg/ml,40ug/ml,60mg/ml,100mg/ml,140mg/ml的浓度梯度的混合标准溶液。
1.2.2单因素试验
1.2.2(1波长的确定试验
以色谱条件为流动相:
甲醇+水(V+V)=98+2,柱温:
30?
,流速:
1.0ml/min,
,在紫外检测波长为280nm290nm292nm294nm300nm条件下进样量10uL
做单因素试验。
1.2.2.2流动相比例的确定试验
以色谱条件为紫外检测波长300nm柱温:
30?
,流速:
1.0ml/min,进样
,在流动相甲醇和水的比例为95:
5、97:
3、98:
2、99:
1、100:
0条件下量
10uL
做单因素实验
1.2.2.3流速的确定试验
因为柱效是色谱柱中流动相线性流速的函数,使用不同的流速可以得到不同的柱效。
对于一根特定的色谱柱,要追求最佳柱效,最好使用最佳流速。
对内径
4.6mm的色谱柱,流速一般选择1ml/min,对于内径为4.0mm柱,流速0.8ml/min
为佳。
故综合文献及流速对柱效的影响,选择以下5个水平做单因素试验。
以色谱
条件为流动相:
甲醇+水(V+V)=98+2,柱温:
30?
,紫外检测波长300nm,进样量
10uL,在流速为0.8、0.9、1.0、1.5、1.7ml/min条件下做单因素试验。
1.2.2.4
柱温的确定试验
因为C柱推荐使用柱温为40?
最高使用温度为50?
,故以色谱条件为18
流动相:
甲醇+水(V+V)=98+2,紫外检测波长:
300nm,流速:
1.0ml/min,进样量10uL,在柱温为25?
、30?
、35?
、40?
、45?
条件下做单因素试验。
1.2.3色谱条件优化试验
响应面法可以很好的反应各因素的与响应值之间的关系以及各因素之间的交互作用,借用其他统计软件还可以精确的预测最优工艺参数及其对应的响应值,但根据单因素结果可以看出,因素水平与评定值之间的关系大多为一定的递增或者递减趋势而不是有起落的峰形图,所做出的响应面液不是屋脊面,故本试验采用正交试验方法。
正交试验的结果分析有直观分析和方差分析2种,虽然直观分析法简便易
懂,但是不能对试验结果中必然存在的误差大小予以无偏估计,不能确定其精确
度,因而给试验的分析带来困难。
方差分析法要求用正交表设计[6]试验时,必须
留有不排入因素或互作的空列以作为误差的估计值,故选取流动4相比例、流速、
柱温三个因素的三个最佳水平做L(3)正交试验,重复次数为9
2次,确定最佳色谱条件。
2结果与分析
2.1单因素试验结果
2.1(1波长单因素试验结果如图1所示。
14600000
13.9500000
delta色谱峰保留时13.8400000间(分钟)
13.7300000(delta+gamma+alpha)色谱峰峰面积(微13.6200000伏*秒)
13.5100000
13.40
波长280nm
波长290nm
波长292nm
波长294nm
波长300nm
图1不同波长的比较
分析:
根据文献知维生素E的最大吸收波长基本均在280nm-300nm由表中数据可见在不同波长条件下保留时间基本不变,只有色谱峰峰面积在变化,波长294nm
时峰面积最大;由图知不同生育酚单体有不同的最大吸收波长,a-生育酚色谱峰的
峰面积变化最明显,波长为290nm,292nm294nm时a-生育酚的峰面积相差不大,最终选取294nm做为紫外检测器的波长。
2.1.2流动相比例单因素试验结果如图2所示。
30600000
25500000delta色谱峰保留时20400000间(分钟)
15300000(delta+gamma+alph10200000a)色谱峰峰面积(微伏*秒)5100000
流动相甲醇
流动相甲醇比水
99比1
流动相甲醇比水
98比2
流动相甲醇比水
97比3图2不同流动相比例的比较
流动相甲醇比水
95比5
分析:
由图知甲醇含量越高,保留时间越短,峰面积越大,即有机相比例越高,洗脱强度越大,目标物出峰时间越快。
故选取流动相比例为:
甲醇+水=98+2,甲醇+水=99+1,甲醇+水=100+0做为正交试验流动相比例的三个水平。
2.1.3流速单因素试验结果如图3所示
18700000
1660000014delta色谱峰保留时间50000012(分钟)400000108(delta+ga300000mma+alpha)色谱峰峰6200000面积(微伏*秒)4100000200
流速0.8ml/min
流速0.9ml/min
图3不同流速比较流速1.0ml/min
流速1.5ml/min
分析:
由图知流速越大,保留时间越短,但峰面积反而越小。
流速加快,目标物流速1.7ml/min
在色谱柱上交换不充分,从而体现出峰面积减少。
故综合平衡选取流速为
0.8ml/min,0.9ml/min,1.0ml/min做为正交试验流速的三个水平。
2.1.4柱温单因素试验结果如图4所示
16700000
14600000
12500000delta色谱峰保留时间(分钟)104000008(delta+gamma+alph3000006a)色谱峰峰面积(微200000伏*秒)4
1000002
00
柱温25摄氏度
柱温30摄氏度
图4不同柱温比较柱温35摄氏度
柱温40摄氏度
35?
、
由图知,色谱柱温度越高,保留时间越短,峰面积越大,故选取柱温为柱温45摄氏度
40?
、45?
做为正交试验柱温的三个水平。
2.2正交试验结果
2.2.1因素水平表如表2所示
表2色谱条件优化因素水平表
因素
水平A流动相比例(甲醇体积)%B流速ml/minC柱温?
1980.835
2990.940
31001.045
2.2.1正交试验结果分析
2.2.1.1以峰面积为评定值的结果分析过程
色谱条件优化试验结果如表3所示:
4表3色谱条件优化试验结果L(3)9
ABC指标试验号空列流动相比例流速(S+丫+a)色谱峰
(甲醇体积)%ml/min柱温?
峰面积(微伏*秒)
69197911(98)1(0.8)1(35)1684278688128
649938212(0.9)2(40)2630134640036
572059313(1.0)3(45)3582370577214
69614742(99)133692631694389
63402152211630755632388
52709962322535073531086
72205373(100)122718200720126
60042383233614102607262
55375893311555289554524
均值1635126.000700881.000608825.333625013.333
均值2619287.667626562.000629649.667630416.000
均值3627304.000554274.667643242.667626288.333
极差15838.333146606.33334417.3345402.667分析:
根据极差的大小,对因素的主次进行排队。
极差越大,表示该因素的水平变化对试验的影响越大,这个因素就越重要,反之,极差越小,这个因素就越不
、BC三个因素中极差的大小,可以看出B因素即流动相重要。
比较本试验中A
比例为最重要因素,其次为C因素即流速,而A因素即柱温为不重要因素。
直观分析已大概分析出因素的主次,但还要通过方差分析进行进一步确认,方差分析表如表4所示。
表4(S+丫+a)色谱峰峰面积方差分析表
变异来源SSdfFFaA流动相比例(甲醇体积)%376298086.88927.864
B流速ml/min32242189294.8892673.789F(2,2)=19.000.05C柱温
180275341.556237.678
误差47852064.2222
总变异34469314787.5608分析:
由表中数据可知,B因素存在极显著差异,C因素存在显著差异,A因素不存在显著差异,即B因素、C因素为重要因素,A因素为次要因素。
对B,C两因素进行多重比较表5至表7,用LSR法。
表5峰面积多重比较用SSR及LSR值
秩次距K23
SSR0.056.096.09
0.0114.014.0
LSR0.0517198.55717198.56
0.0139536.91239536.91
表6B因素各水平均值多重比较
B因素BBB123
均值700881.000626562.000554274.667
显著性(1%)ABC
表7C因素各水平均值多重比较
C因素CCC321
均值643242.667629649.667608825.333
显著性(5%)aab
分析:
由图知多重比较结果B因素以B1最好,C因素C2和C3无显著差异则均可以,但考虑到长期用比较高的柱温可能会影响色谱柱的使用寿命,故就峰面积这一评定值来讲,最优组合为B1C2,A因素不论。
2.2.1.2以保留时间为评定值的结果分析过程
色谱条件优化试验结果如表8所示
4表8色谱条件优化试验结果L(3)9
ABC指标试验号空列流动相比例流速S色谱峰
(甲醇体积)%ml/min柱温?
保留时间(分钟)
15.795
11(98)1(0.8)1(35)115.79715.796
13.122
212(0.9)2(40)213.14413.133
11.025
313(1.0)3(45)311.02411.024
12.630
42(99)13312.60312.617
10.529
5221110.50710.518
10.796
6232210.80810.802
10.313
73(100)12210.30710.310
10.310
8323310.31110.310
8.770
933118.7718.770均值113.31812.90812.30311.695均值2
11.31211.32011.50711.415均值39.79710.19910.61711.317极差3.521
2.7091.6860.378分析:
比较本试验中ABC三个因素中极差的大小,可以看出A因素即流动相比例为最重要因素,其次为B因素即流速,而C因素即柱温为不重要因素。
通过方差分析进行进一步确认,方差分析表如表9所示。
表9(S+丫+a)色谱峰保留时间方差分析表
变异来源SSdfFFa
A流动相比例(甲醇体积)%18.716281.374
B流速ml/min11.116248.33F(2,2)=19.000.05C柱温?
4.265218.543误差0.2302
总变异34.3308
分析:
由表中数据可知,A因素存在极显著差异,B因素存在显著差异,C因素不存在显著差异,即A因素、B因素为重要因素,C因素为次要因素。
对A,B两因素进行多重比较表10至表12,用LSR法。
表10保留时间多重比较用SSR及LSR值
秩次距K23
SSR0.056.096.09
0.0114.014.0
LSR0.051.1921.192
0.012.7412.741
表11A因素各水平均值多重比较
A因素AAA123
均值13.31811.3129.797
显著性(5%)aabb
表12B因素各水平均值多重比较
B因素BBB123
均值12.90811.32010.199
显著性(5%)abb
分析:
因为此方差分析表以保留时间为评定值,故保留时间越短越好。
由图知
多重比较结果A因素以A3最好,而B因素B和B3无显著差异均可以,最后综合2
221.1和221.2的结果,最优组合为A3B2C2即流动相为甲醇,流速为0.9ml/min,柱温为40?
。
3本章小结本章通过对检测波长、流动相比例、流速、柱温做单因素试验,然后选取合适的水平做正交试验以研究出最佳色谱条件,结果表明:
检测波长为294nm流动相
为甲醇,流速为0.9ml/min,柱温为40?
为最佳色谱条件。
第三章标准溶液的绘制
引言外标法也称为标准曲线法,是所有定量分析中最通用的一种方法。
因为相对比较简单,是实际工作中应用最多的一种定量分析方法。
测定方法为:
把待测组分的纯物质配制成不同浓度递增的标准系列,在一定操作条件下向色谱柱中注入相同体积的标准样品,测得各峰的峰面积或者峰高,绘制A-C或H-C的标准曲线,
然后在完全相同的条件下注入相同体积的待测样品,根据所得的峰面积或者峰高从曲线上查的含量。
本试验是选取峰面积和浓度绘制标准曲线。
在使用标准曲线定量时,应注意待测样品的浓度要在标准系列的浓度范围之内,这样才能获得准确的分析结果,本试验参考文献中测得的各种食用植物油的维生素E含量,确定标准曲线的线性范围为1.0mg/ml,140mg/ml。
当待测物质含有几种成分时,而标准溶液为几种成分的混合溶液,应先确定每种成分的保留时间,确定每种成分的出峰顺序进而确定是哪种成分。
即先注入一定浓度的单一成分的标准溶液,然后再注入混合标准溶液。
1材料与方法
1.1仪器与设备
紫外可见分光光度计UV-5200上海元析仪器有限公司
Waters高效液相色谱仪e2695带2489紫外检测器美国沃特斯有限公司1.2
方法
1.1.1标准溶液浓度的标定
取维生素E标准溶液三种组分的1mg/ml,1mg/ml,0.5mg/ml标准溶液各
100ul,用无水乙醇分别稀释定容至5ml。
按《NY/T1598-2008食用植物油中维生素E组分和含量的测定高效液相色谱法》给定的波长和比吸光系数,用紫外分光光度计测定各种形态维生素E的吸光度值。
1.1.2仪器色谱条件
紫外检测器波长为294nm流动相为甲醇,流速0.9ml/min,柱温40?
进样量10ul。
1.1.3标准曲线的绘制
取40ug/mlS-生育酚,a-生育酚,丫-生育酚单一成分的标准溶液进样,确定
单一成分的保留时间。
然后进样1mg/ml、10mg/ml,40ug/ml,60mg/ml,
100mg/ml,140mg/ml的浓度梯度的混合标准溶液,得到各成分的回归方程。
1.1.4精密度试验
取40ug/ml维生素E标准溶液连续进样6次,并计算出浓度。
2结果与分析
2.1标准溶液的准确浓度
计算得S-生育酚、a-生育酚、丫-生育酚的准确浓度分别为:
0.9814mg/ml,
1.0282mg/ml,0.51185mg/ml。
2.2标准曲线
2.2.1单一成分的色谱图如图5。
6所示
222混合标准溶液的色谱图如图
S-生育酚丫-生育酚a-生育酚
图5三种成分的图谱
图640ug/ml混合标准溶液的谱图
分析:
由图知丫-生育酚的响应值最大,其次是S-生育酚,且丫-生育酚和
S-生育酚响应值差别很小,最小的是a-生育酚;S-生育酚色谱峰的保留时间最
短
生育酚,最后是a-生育酚。
即最先出峰,其次是丫-
2.2.3标准溶液的线性关系三种成分的回归方程如表13所示。
表13维生素E中各种生育酚标样的回归方程
维生素E标准曲线R
33S-生育酚丫=5.26X10X+2.63X100.9985
33丫-生育酚丫=5.81X10X+6.92X100.9984
33a-生育酚丫=3.85X10X+5.53X100.9992
分析:
根据表中数据可知维生素E的三种单体的回归方程线性相关系数均接近
,故证明所配制标液的线性关系良好。
于1
2.3精密度试验
取40ug/ml维生素E标准溶液连续进样6次,结果见表14。
表14精密度试验结果
样品名称测定次数实测范围RSD(%)
S-生育酚638.081,39.2540.781
丫-生育酚640.258,41.0540.809
a-生育酚641.127,42.0431.19
分析:
根据数据知相对标准误差值都比较小,由此可以看出Waters高效液相色谱仪e2695的重现性很好。
3本章小结
本章进行了标准曲线的绘制,结果表明维生素E三种单体的色谱峰完全分离,回归方程的线性很好,Waters高效液相色谱仪e2695的重现性很好。
第四章不同处理方法对维生素E含量测定的影响引言维生素E对人体生理功能有着很重要的作用:
?
抗氧化作用:
有利于保
护生物膜,防止氧化剂对细胞膜中多不饱和脂肪酸、富含巯基德蛋白成分(保护某些含巯基酶的活性)以及细胞骨架和核酸的损伤;?
抗衰老以及防化学污染;?
可能与生殖功能有关;?
维护机体正常免疫功能—对T淋巴细胞的功能十分重要。
它广泛存在于各种植物油中,因此分析其中的维生素E的含量很必要。
维生素E的高效液相色谱法原理是样品经碱溶液皂化提取处理后,使试样
用有机溶剂提取不皂化物中的维生素E,浓缩,高效中的天然生育酚释放出
来,
液相色谱C18反相柱分离维生素E,经紫外检测器检测,用外标法定量。
根据相关标准介绍皂化方法有加入碱液震荡皂化和沸水浴回流皂化两种方式,皂化剂浓度、皂化温度和时间对于维生素E的解离有很重要的影响,所以震荡皂化用低浓度的氢氧化钾皂化,而回流皂化则加入浓度较大的氢氧化钾。
游离的维生素E易被氧
化,所以在皂化中加入一定量的抗坏血酸保护维生素E不被氧化。
皂化后用有机试
剂提取,提取剂由石油醚和乙醚,石油醚主要用作溶剂级作为优质的抽提用,但是皂化法相对繁琐,试剂用量较大。
也有文献介绍超声提取法测定维生素E含量,提取试剂有乙醇和正己烷,正己烷是食用植物油的提取剂。
维生素E的化学性质为在无氧条件下对热稳定,即使加热至200?
也不易被破坏,但是它对氧十分敏感,易被氧化破坏,此外对碱和紫外线液较敏感。
故本试验采用这些不同的处理方法并结合其化学性质进行
快速、准确、重现性好的提取方法,以缩短分维生素E含量的测定,从而找出
析时间。
1材料与方法
1.1材料冷榨法油茶籽油由湖南农业大学粮油加工实验室提供。
1.2化学试剂
石油醚分析纯天津市化学试剂研究所正己烷分析纯天津市化学试剂研究所抗坏血酸分析纯汕头市西陇化工厂有限公司
氢氧化钾分析纯天津市博迪化工有限公司
无水硫酸钠分析纯衡阳市凯信化工试剂有限公司1.3仪器与设备电子分析天平AR2140奥豪斯国际贸易(上海)有限公司
氮气吹扫仪MD200-1杭州奥盛仪器有限公司
微型旋涡混合仪WH-2上海泸西分析仪器厂有限公司
超声波清洗器DS2060天津市东康科技有限公司
电热恒温水浴锅武汉琴台医疗器械厂
电动离心机80-2江苏省金坛市医疗仪器厂
多用调速震荡器HY-4江苏省金坛市医疗仪器厂
超纯水器B110-B长沙源科仪实验器材有限公司
真空干燥箱DZF-6021AT上海一恒科技有限公司
蛇形冷凝管
250ml梨形分液漏斗SAMDUK
孔径0.45un有机过滤器津隆
一次性使用无菌注射器圣光医用制品有限公司
1.4方法
1.4.1样品前处理方法
1.4.1.1震摇皂化法
称取5g试样于皂化瓶中,加入30ml无水乙醇,混合均匀。
加入5ml抗坏血酸(100g/L),20ml氢氧化钾(1g/L),混匀后盖上塞子于振荡器上震荡皂化1h。
将皂
化后的试样移入250ml梨形分液漏斗中,用一定量的水洗皂化瓶,水并入分液漏斗中,然后用乙醚再次洗皂化瓶,乙醚液并入分液漏斗中。
轻轻震摇分液漏斗,注意震摇幅度不能太大,因为容易出现乳化现象而无法使试液分层,若出现少量乳化现象,可加入几滴乙醇,进行破乳,用水洗涤乙醚层几次,直至用
),滤至pH试纸检测洗涤后的水不显碱性。
将乙醚提取液过无水硫酸钠(约为
5g100ml棕色容量瓶中,用一定量的乙醚冲洗分液漏斗,并入容量瓶中,然后用乙醚定容,摇匀后吸取10ml乙醚提取液于50?
氮气吹扫仪上吹至近干,立即加入5ml乙醇,于涡旋混合仪上混合均匀后转入离心管中,4000r/min离心10min,上清液
过0.45um有机相微孔滤器后上机测定。
1.4.1.2回流皂化法
称取5g试样于皂化瓶中,加入30ml无水乙醇,混合均匀。
加入5ml抗坏血酸(100g/L),10ml氢氧化钾(500g/L),混匀后于沸水浴上回流30min,皂化完毕后立即用流水冷却,皂化液马上转入分液漏斗中,因为放置时间过长可能导致提取时出现乳化现象。
其余步骤同1.4.1.1
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- 高效 色谱 测定 食用植物油 维生素 含量